莱菔硫烷对D-半乳糖致衰老模型小鼠海马组织氧化应激水平的影响.pdf

6期第 45 卷6 期2023 年 6 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University收稿日期：2023-03-09基金项目：宁夏留学回国人员创新创业项目（宁人社函 2021 352号）；国家自然科学基金项目（82160617）；宁夏自然科学基金项目（2022AAC05024）作者简介：赵家丽（1997），女，在读硕士研究生，研究方向：营养与疾病。通信作者：张瑞（1986），女，博士，副教授，研究方向：营养与疾病。E-mail：z_衰老是一个机制复杂的生物学现象和过程，机体中的抗氧化物随着年龄的增长而减少，导致其清除体内过多氧自由基的能力减弱，引发衰老性损伤1-2。D-半乳糖可以减缓脑组织内自由基的清除，故而皮下注射 D-半乳糖是最经典且最接近自然衰老规律的衰老模型造模方式3-4。有研究5表明，氧化应激会引起神经元内 A茁 的沉积，当 A茁 沉积到一定程度就会对神经元产生损伤作用，引发进一步的氧化应激反应，造成更严重的伤害。丙二醛（malondialdehyde，MDA）和 4-羟基壬烯/4-羟基-2-壬烯（4-Hydroxynonenal，HNE）是公认的氧化应激标记物，并可促进与年龄相关的神经变性疾病的进展6-7。衰老会导致抗氧化酶类超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等活性降低，从而减少 MDA 等氧化终产物的产生8-9。因此，保护氧化还原稳态可能可以有效防止或减缓衰老的发生。莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）是存在于西兰花等十字花科蔬菜中的亲电化合物，是细胞抗氧化反应的有效诱导剂，有助于维持细胞氧化还原稳态并减轻氧化应激10。有研究11表明，SFN 可通过上调 SOD 的表达增强机体对过氧化物的清除作用，降低组织过氧化损伤程度。SFN 还可通过激活核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor-erythroid2-related factor 2，Nrf2）/ARE 信号通路，增加Nrf2 和血红素氧合酶 1（heme oxygenase 1，HO-1）的表达，改善脑内的氧化应激状态，从而在放射性脑损伤、脑卒中、抑郁症等模型中发挥神经保护作用12-16。然而，SFN 是否在衰老小鼠海马组织中发挥抗氧化作用尚未可知。故本研究以 D-半乳糖诱导 C57BL/6 小鼠衰老模型，并给予 SFN 干预，通过检测小鼠海马组织酶活性和 Nrf2 转录与翻译水平的变化，进一步验证 SFN 在衰老模型海马组织中是否具有抗氧化作用。1材料与方法1.1主要试剂与仪器1.1.1主要试剂D-半乳糖（美国 Sigma 公司），莱菔硫烷对 D-半乳糖致衰老模型小鼠海马组织氧化应激水平的影响赵家丽1，彭楠1，2，3，周宏桢1，高腾威1，2，3，罗少伟2，3，王一茜1，2，3，张瑞1，2，3（1.宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室，银川750004；2.宁夏医科大学公共卫生学院，银川750004；3.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川750004）摘要：目的探讨莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）对衰老模型小鼠海马组织氧化应激水平的影响。方法将 24周龄健康小鼠按体质量随机分为对照组、模型组、干预组，每组 10 只，雌雄各半。模型组和干预组小鼠皮下注射 200 mg kg-1D-半乳糖，每日 1 次；干预组小鼠给予 25 mg kg-1SFN 灌胃，每日 1 次，模型组小鼠灌胃等量蒸馏水；对照组小鼠皮下注射等量生理盐水，灌胃等量蒸馏水。干预至 48 周龄后，在末次给药 2 h 后取脑并称重。左侧海马组织用于检测超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）和总抗氧化能力（T-AOC）活力，右侧海马组织用于检测 mRNA 与蛋白水平。结果与对照组相比，模型组小鼠海马组织 GSH-Px、CAT、T-AOC 活性、Nrf2 mRNA 水平均降低，MDA 含量升高（P均约0.05）；与模型组相比，干预组小鼠海马组织 GSH-Px、SOD、CAT、T-AOC 活性、Nrf2 mRNA 和蛋白水平均升高，MDA 含量降低（P均约0.05）。结论SFN 可增强衰老模型小鼠海马组织抗氧化酶类活性及抗氧化能力，减少其氧化损伤。关键词：莱菔硫烷；衰老；海马组织；抗氧化；核因子 E2 相关因子 2中图分类号：R151.4+1文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.06.007文章编号：1674-6309（2023）06-581-05论著581窑窑宁夏医科大学学报4缘卷SFN（加拿大 TRC 公司），Nrf2 抗体（美国SantaCruz Biotechnology 公司），二抗辣根过氧化物酶（北京中杉金桥生物技术有限公司），GSH-Px、SOD、CAT 及 MDA 试剂盒（南京建成生物工程研究所），总 RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT PCR SYBR试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司，核蛋白提取试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。1.1.2主要仪器设备Real time PCR 仪（7500，美国 ABI 公司），光学显微镜（BX51，日本 Olym原pus 公司），石蜡切片机（RM2135，德国 Leica 公司），Multiskan MK3 酶标仪（美国 Thermo 公司），凝胶图像成像分析仪（美国 LICOR 公司），Image J图像分析软件（美国 NIH 公司）。1.2动物的饲养、分组、处理及样品采集24 周龄 C57BL/6 健康小鼠，由宁夏医科大学实验动物中心提供 动物证书编号：SCXK（宁）2015-0001。饲养环境温度（20依2）益，相对湿度40%耀70%，12/12 h 的光/暗循环，自由饮食。将小鼠按体质量随机分为对照组、模型组和干预组，每组 10 只，雌雄各半。模型组和干预组小鼠每日皮下注射 200 mg kg-1D-半乳糖 1 次；干预组小鼠给予 SFN 25 mg kg-1灌胃，每日 1 次，模型组小鼠给予等量蒸馏水灌胃；对照组灌胃等量蒸馏水，皮下注射等量生理盐水。以上操作持续处理至小鼠 48 周龄。在末次给药 2 h 后用异氟烷麻醉，取脑，称重。1.3方法与指标1.3.1酶学指标测定分离小鼠海马，使用组织破碎仪制备 10%组织匀浆，12 000 r min-1，4 益离心 5 min，小心吸取上清液。按照试剂盒说明书步骤测定与计算海马组织 SOD、MDA、GSH-Px、CAT 和总抗氧化能力（T-AOC）活力。蛋白质浓度：取待测样品，加入考马斯亮蓝 G-250 溶液显色，充分混匀后，采用酶标仪在 595 nm 波长下比色，记录吸光值并在标准曲线上查找得到溶液蛋白质浓度。SOD：将上述海马组织匀浆稀释至 0.25%，加入底物于 37 益孵育 20 min，采用酶标仪在450 nm 波长下读数，并计算。MDA：采用 10%海马组织匀浆配制反应体系，95 益水浴 40 min，3 500耀4 000 rmin-1离心 10 min。采用酶标仪在 532 nm 波长下读数，并计算。GSH-Px：制备0.25%海马组织匀浆，酶促反应后显色 15 min。采用酶标仪在 412 nm 波长下读数，并计算。CAT：采用 10%海马组织匀浆制备反应体系，采用酶标仪在 405 nm 波长下读数，并计算。T-AOC：采用 10%海马组织匀浆制备反应体系，室温反应6 min 后采用酶标仪在 520 nm 波长下读数，并计算。1.3.2Nrf2 mRNA 水平测定采用实时定量PCR 法测定总 mRNA 中 Nrf2 mRNA 水平。提取总 RNA 并统一稀释各样品的总 RNA，将 mRNA逆转录为 cDNA，以 Lamin A 为内参，再进行 PCR扩 增。Nrf2 引 物：5-AGCATGATGGACTTG 原GAGTTG-3 和 5-GCCATGAACCCCGTCTCAAT-3；Lamin A 引物：5-GGCTACAGACGCTGAAG原GAG-3 和 5-CTGTTCCACCTGGTCCTCAT-3。扩增体系：TB Green Premix Ex Tap 域12.5 滋L，上引物 1 滋L，下引物 1 滋L，灭菌水 9.5 滋L，cDNA1 滋L。反应条件：95 益预变性 30 s 后，95 益变性15 s、58 益复性 30 s、72 益延伸 30 s，循环指数为 40。1.3.3Nrf2 蛋白水平测定用 Western blot 法检测 Nrf2 蛋白水平。提取小鼠右侧海马核蛋白并统一蛋白质浓度至 5 滋g 滋L原员。样品在沸水浴中煮沸 3耀5 min，离心，使蛋白变性。以 10%SDS-PAGE 电泳分离（100 V、30 mA、1.5 h），将分离胶中的蛋白质转移到转移电泳槽中的 PVDF 膜上（25 V、125 mA、1.5 h）。用含 5%脱脂奶粉的含吐温 20 的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris-buffered saline with Tween 20，TBST），4 益封闭过夜。一抗 37 益孵育（兔抗 Nrf2，sc-13032，1颐200；小鼠抗 Lamin A，sc-71481，1颐200）2 h，二抗室温孵育 0.5 h 后增强化学发光（enhanced chemilu原minescence，ECL）显色并分析图像。1.4统计学方法采用 SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析。计量资料用均数依标准差（x依s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t 法。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1脑质量三组小鼠脑质量差异无统计学意义（P跃0.05），见表 1。表 1三组小鼠脑质量比较（xs，mg）组别对照组模型组干预组n脑质量10331.8011.7510326.4017.9110333.0015.382.2海马组织氧化应激指标测定结果由表 2 可知，与对照组相比，模型组小鼠海582窑窑6期表 2三组小鼠海马组织 GSH-Px、SOD、CAT、T-AOC 活性和 MDA 含量比较（xs）GSH-Px/（U mg-1）SOD/（U mg-1）CAT/（U mg-1）T-AOC/（U mg-1）MDA/（nmol mg-1）58.484.7745.913.1011.500.761.080.110.750.0550.434.32*43.364.379.570.97*0.870.10*1.040.07*58.326.34#46.352.5910.801.29#1.210.10*#0.940.08*#组别n对照组10模型组10干预组10与对照组相比*P0.05；与模型组相比#P0.05。马组织 GSH-Px、CAT、T-AOC 活性均降低，MDA含量升高（P 均约0.05）。与模型组相比，干预组小鼠海马组织 GSH-Px、CAT、T-AOC 活性均增高，MDA 含量降低（P 均约0.05）。2.3Nrf2 mRNA 水平测定与对照组相比，模型组小鼠海马组织 Nrf2mRNA 水平下降（P约0.05）；与模型组相比，干预组小鼠海马组织 Nrf2 mRNA 水平升高（P约0.05），见图 1。#1.51.00.50.0#P0.05。图 1三组小鼠 Nrf2 mRNA 水平比较（n=10，xs）2.4Nrf2 蛋白水平测定与对照组相比，模型组小鼠海马组织 Nrf2蛋白水平差异无统计学意义（P跃0.05）；与模型组相比，干预组小鼠海马组织 Nrf2 蛋白水平升高（P约0.05），见图 2。3讨论衰老是一个多层次、进程复杂、涉及多器官的过程。其中，脑衰老是一个复杂的过程，从亚细胞到器官层面都会受到影响。从形态学上看，严重的脑老化可表现为脑容量减少。在采用 D-半乳糖致亚急性衰老过程中，动物脑质量变化并不一致。饶娜等17对昆明种小鼠实施为期 8 周的D-半乳糖腹腔注射干预，剂量为每日 200 mg kg-1，小鼠脑质量减轻；而肖明良等18应用 100 mg kg-1D-半乳糖皮下注射方式干预 2 月龄 ICR 小鼠，干预周期为 30 d，并未发现小鼠脑质量指数降低。本研究对 24 周龄 C57BL/6 小鼠每日进行200 mg kg-1皮下注射干预，连续干预 24 周，干预组小鼠脑质量与对照组相比差异无统计学意义，可能是因为不同研究使用的动物种属、给药剂量、给药时长等不同。GSH-Px、SOD、CAT 是生物体中的抗氧化酶家族的成员，其在清除体内多余氧自由基方面具有不可或缺的作用。而 MDA 是膜过氧化的终产物，其活性检测能反映机体内自由基的多少，进而推断自由基对机体损伤的程度。本研究中，衰老模型小鼠抗氧化酶类与 T-AOC 水平均降低，表明模型小鼠已出现氧化损伤19。有研究14，20-21表明，SFN 在放射性脑损伤、创伤性脑病、帕金森病等模型动物中，可提高 SOD 等抗氧化酶类活性，减少 MDA 含量。本研究发现，SFN 干预可提高衰老模型小鼠海马组织抗氧化能力，减轻其氧化损伤程度，说明 SFN 可能通过抗氧化作用在衰老过程中发挥神经保护作用。Nrf2 是氧化还原反应中主要的转录因子，可调节氧化应激、线粒体自噬等功能相关基因的表#P0.05。图 2三组小鼠 Nrf2 蛋白水平比较（n=10，xs）#1.51.00.50.068 kDa37 kDaNrf2LAMIN A赵家丽，等.莱菔硫烷对D-半乳糖致衰老模型小鼠海马组织氧化应激水平的影响583窑窑宁夏医科大学学报4缘卷达。Nrf2 表达的改变在很大程度上与衰老、神经退行性疾病有关，且可以通过上调参与谷胱甘肽和硫氧还蛋白合成的酶的表达，发挥抗氧化作用，抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量产生，进而延缓衰老2。已有研究22-23发现，SFN在皮肤衰老模型与支气管上皮细胞衰老模型中通过上调 Nrf2 来发挥抗氧化作用。本研究中，衰老模型小鼠海马组织 Nrf2 转录水平降低，而 SFN干预可使 Nrf2 转录与翻译水平升高。说明 SFN在衰老模型小鼠中也可能通过调节 Nrf2 的转录与翻译而发挥抗氧化作用。综上所述，本研究通过检测 GSH-Px、SOD、CAT、T-AOC、MDA 及 Nrf2 mRNA 和蛋白水平等抗氧化指标来探究 SFN 延缓小鼠海马组织衰老的机制，结果表明，SFN 可改善 C57BL/6 小鼠海马组织的氧化应激，增强模型小鼠海马组织抗氧化酶类活性及抗氧化能力。参考文献：1 Wang X，Zhou Y，Gao Q，et al.The role of exosomal mi原croRNAs and oxidative stress in neurodegenerativediseases J.Oxid Med Cell Longev，2020，2020：3232869.2George M，Tharakan M，Culberson J，et al.Role ofNrf2 in aging，Alzheimer s and other neurodegenera原tive diseases J.Ageing Res Rev，2022，82：101756.3 Xiao Y，Yang C，Yu L，et al.Human gut-derived B.longum subsp.longum strains protect against aging ina D-galactose-induced aging mouse model J.Mi原crobiome，2021，9（1）：180.4 Zhu X，Cai L，Liu J，et al.Effect of seabuckthorn seedprotein and its arginine-enriched peptides on combat原ing memory impairment in mice J.Int J Biol Macro原mol，2023，232：123409.5 王昊，李博，李哲.A茁 受体在阿尔茨海默病中的研究进展 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Control，Yinchuan750004，China）Abstract：ObjectiveTo investigate effects of sulforaphane on oxidative stress in hippocampus of aging mice.Methods 24 weeksold mice were assigned to control group，aging model group and SFN intervention group（n=10，equal numbers of male and female mice）.Aging model group and intervention group were subcuta-neously injected with 200 mg kg-1D-galactose once a day，and mice in SFN intervention group were treatedwith 25 mg kg-1SFN once a day，the mice in the model group were given with equivalent distilled water.Thecontrol group was fed with distilled water and the same amount of solvent in the same way.Intervention to 48weeks of age，and 2 h after the last dose，the brain was isolated and weighed.The left hippocampus was used todetect the activity of superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），glutathione peroxidase（GSH-Px），catalase（CAT）and total antioxidant capacity（T-AOC）.The right hippocampus was used to detect mRNA lev-els and protein levels.ResultsCompared with the control group，the activities of GSH-Px，CAT，T-AOC andNrf2 mRNA in hippocampus of the model group were decreased，and the content of MDA in hippocampus wasincreased significantly（P all0.05）.Compared with the aging model group，the activities of GSH-Px，SOD，CAT，T-AOC，Nrf2 mRNA and protein levels in hippocampus of the intervention group were increased，and thecontent of MDA in hippocampus was decreased significantly（P all0.05）.ConclusionSFN could enhance theactivities of antioxidant enzymes and the antioxidant capacity，and reduce the oxidative damage in hippocampusof aging mice.Key words：sulforaphane；aging；hippocampus；anti-oxidation；nuclear factor-erythroid 2-related factor 2赵家丽，等.莱菔硫烷对D-半乳糖致衰老模型小鼠海马组织氧化应激水平的影响585窑窑