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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。谢谢,分解纤维素微生物分离,JLSSY,BYH,第1页,纤维素与纤维素酶,1.纤维素,纤维素是一个由,葡萄糖,首尾相连而成,高分子,化合物，是含量最丰富,多糖,类物质。,一、基础知识,植物根、茎、叶等器官都含有大量纤维素。其中,棉花,是自然界中纤维素含量最高天然产物,。,第2页,土壤中一些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。,第3页,纤维素是地球上含量最丰富多糖类物质，植物每年产生纤维素超出70亿吨，其中40%-60%能被土壤中能产生纤维素酶微生物所利用，不会大量积累。,在草食性动物等消化道内，也,共生有分解纤维素微生物,，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素能力。,人类可应用分解纤维素微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。,第4页,2.纤维素酶,纤维素酶是一个,复合酶,，普通认为它,最少包含三种组分,，即,C,1,酶(,外切酶,)、C,X,酶(,内切酶,)和,葡萄糖苷酶,，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,纤维二糖,C,1,酶、Cx酶,葡萄糖苷酶,葡萄糖,纤维素,第5页,C,1,酶：,外切酶，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖,分子，产生纤维二糖,C,X,酶：,内切酶，使纤维素断裂成片断。,葡萄糖苷酶：,将纤维二糖分解成葡萄糖。,第6页,取二支20mL试管,试验：纤维素酶分解纤维素试验,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲 乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在,140r/min摇床上振荡1h,结果：乙试管滤纸条消失,讨论,：乙试管滤纸条为何会消失？甲试管作用是什么？,第7页,提醒：,本试验,自变量是纤维素酶有没有,，自变量操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量缓冲液，不能加入蒸馏水，不然会影响溶液pH。,试验分析：P,27,小试验是怎样组成对照？,第8页,刚果红染色法,刚果红能与纤维素形成红色复合物,，而不与水解后纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。,（二）纤维素分解菌筛选,当我们在含有纤维素培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中纤维素形成,红色复合物,。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素复合物就无法形成，培养基中就会出现,以纤维素分解菌为中心透明圈,，这么我们就能够经过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,第9页,第10页,二、实 验 设 计,请你依据试验流程图和提供三个资料以及“操作提醒”，在思索相关问题基础上，设计出一个详细试验方案。,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布在判别纤,维素分解菌培养基上,筛选产生透,明圈菌落,第11页,分布环境,1、土壤取样：,富含纤维素环境中,操作步骤,生物与环境相互依存关系，在富含纤维素环境中纤维素分解菌含量相对提升，所以从这种土壤中取得目标微生物几率要高于普通环境。,原因,第12页,实例：树林中多年落叶形成腐殖土，多年积累枯枝败叶等。,讨论:假如找不到适当环境，能够将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存适宜环境。普通应将滤纸埋于深约10cm左右土壤中。,第13页,2、选择培养,增加纤维素分解菌浓度,，以确保能够从样品中分离所需要微生物。,目标：,制备选择培养基：,操作：,将土样加入装有30ml选择培养基锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。,第14页,培养基成份分析,培养基组成,提供主要营养物质,纤维素粉 5g,碳源（能源）,NaNO,3,1g,氮源、无机盐,KCl 0.5g,Na,2,HPO,4,7H,2,O 1.2g,KH,2,PO,4,0.9g MgSO,4,7H,2,O 0.5g,无机盐,酵母膏 0.5g,生长因子、碳源、氮源,水解酵素 0.5g,氮素、生长因子,溶解后，蒸馏水定容至1000mL,水,第15页,提醒：自变量为培养基种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。,A、旁栏中配方是液体培养基还是固体培养基？为何？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）,B、这个培养基对微生物是否含有选择作用？假如含有，是怎样进行选择？,有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素微生物能够大量繁殖。,C、你能否设计一个对照试验，说明选择培养基作用,第16页,说明：,分析“纤维素分解菌选择培养基配方”,可知，该配方中酵母膏也能够提供少许碳源，所以其它微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，因为酵母膏含量极少，所以，只有以纤维素为碳源微生物才能大量繁殖。,第17页,在选择培养条件下，能够使那些能够,适应,这种营养条件微生物得到,快速繁殖,，而那些,不适应,这种营养条件微生物繁殖被,抑制,，所以能够起到“浓缩”作用。,为何选择培养能够“浓缩”所需微生物？,第18页,比较项目,分解尿素细菌,纤维素分解菌,选,择,培养,基,原理,培养基类型,目标,鉴,定,培养基,原理,现象,方法,将细菌涂布在只有,尿素做氮源选择,培养基上,将细菌涂布在只有,纤维素粉做碳源,选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,第19页,思索：本试验流程与课题2中试验流程有哪些异同？,本试验流程与课题2流程区分以下。课题2是将土样制成菌悬液直接涂布在,以尿素为唯一氮源选择性培养基上，直接分离,得到菌落。本课题经过,选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，,再将菌液涂布在选择培养基上。其它步骤基本一致。,第20页,按照课题1稀释操作方法，将选择培养后培养基进行等比稀释10,1,10,7,倍。,3.梯度稀释,10,1,10,2,10,3,10,4,10,5,10,6,第21页,4.将样品涂布到,判别纤维素分解菌,培养,基上,（1）制备判别培养基:,（2）涂布平板：,将稀释度为10,4,10,6,菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。,第22页,培养基组成,提供主要营养物质,CMC-Na 510g,碳源,酵母膏 1g,碳源、氮源、生长因子,KH,2,PO,4,0.25g,无机盐,土豆汁 100mL,碳源、生长因子,琼脂 15g,凝固剂,上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL,氢元素、氧元素,判别纤维素分解菌培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),第23页,方法一：先,，再加入刚果红进行颜色反应。,方法二：在,时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,5.刚果红染色法,挑选产生透明圈菌落，普通即为分解纤维素菌落。,第24页,这两种方法各有哪些优点与不足？,染色法,优点,缺点,方法一,方法二,颜色反应基本上是纤维素分解菌作用,操作繁琐,刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶微生物也产生含糊透明圈,2.有些微生物能降解色素，形成显著透明圈。,第25页,比较,项目,分解尿素细菌,纤维素分解菌,选,择,培养,原理,培养基类型,目标,鉴,定,培养基,原理,现象,方法,在细菌分解尿素化学反应,中，细菌合成脲酶将尿素,分解成了氨，氨会使培养基,碱性增强，pH升高。在培,养基中加入,酚红指示剂,，如,果pH升高指示剂会,变红,刚果红,能够与纤维素形成,红色复合物,，当纤维素被,纤维素酶催化分解后红色,复合物无法形成，培养基,上就会出现以纤维素分解,菌为中心,透明圈,观察菌落周围是否有着色,环带出现来判定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现,透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,第26页,方法一中NaCl溶液作用？,思索：,漂洗作用,，洗去与纤维素结合不牢刚果红，以免出现透明圈不够清楚。用这方法能够判断酶活力大小，实际上刚果红是结合到培养基多糖底物，但分解纤维素细菌能够产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这么刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就能够使结合不牢刚果红洗去，这么就留下大大小小透明圈，大透明圈当然分解纤维素能就强！,第27页,在,产生显著透明圈,菌落，挑取并接种到纤维素分解菌选择培养基上，在30,0,C 37,0,C培养，可取得,纯化培养,。,6、纯化培养,第28页,四、结果分析与评价,1.培养基制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落,对照培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。,假如观察到产生透明圈菌落，则说明可能取得了分解纤维素微生物。,2.分离结果是否一致,因为在土壤中细菌数量远远高于真菌和放线菌数量，所以最轻易分离得到是细菌。但因为所取土样环境不一样，不一样同学也可能得到真菌和放线菌等不一样分离结果。,第29页,为了确定分离得到是纤维素分解菌，还需要进行_,_试验，纤维素酶发酵方法有_ 发酵和_ 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生_ 含量进行定量测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,五、课题延伸,第30页,分解,纤维素微生物分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,试验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法,后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色判别,分离出分解菌,课堂总结,第31页,
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