克氏原螯虾自噬相关基因PcAtg2的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析.pdf

第 44 卷 第 5 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.44,No.5 2 0 2 3 年1 0 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct.,2023 *江苏省自然科学基金(BK20181138)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2019JBFZ09)共同资助。祝孟茹，E-mail: 通信作者：沈怀舜，研究员，E-mail: 收稿日期:2022-04-24,收修改稿日期:2022-05-18 DOI:10.19663/j.issn2095-9869.20220424002 http:/ PcAtg2 的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析.渔业科学进展,2023,44(5):137152 ZHU M R,WEN L J,ZHAN M,GONG J,XI C J,WEN H B,SHEN H S.Cloning and expression analysis of the autophagy related gene PcAtg2 in Procambarus clarkii under white spot syndrome virus stress.Progress in Fishery Sciences,2023,44(5):137152 克氏原螯虾自噬相关基因 PcAtg2 的克隆及其 在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析*祝孟茹1 问露洁1 占 铭1 公 洁1 席昌俊1 闻海波1,2 沈怀舜1,2(1.南京农业大学无锡渔业学院 江苏 无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 农业农村部稻鱼综合养殖生态重点实验室 江苏 无锡 214081)摘要 为了解自噬相关基因 Atg2 在克氏原螯虾(Procambarus clarkia)先天免疫中的作用，本研究克隆了克氏原螯虾 Atg2(PcAtg2)基因全长序列。生物信息学分析显示，PcAtg2 蛋白编码序列全长为 9 966 bp，推测其编码 2 189 个氨基酸。组织定量表达分布显示，PcAtg2 在克氏原螯虾的各个组织中均有表达，其中在肝胰腺中表达最高，在眼柄中表达最低。在白斑综合征病毒(WSSV)感染实验中，PcAtg2 基因表达量在不同组织中均呈现显著上调趋势。RNA 干扰(RNAi)实验显示，PcAtg2基因沉默后，WSSV 在克氏原螯虾体内的增殖明显被抑制，同时，自噬相关基因的表达量上调。透射电镜分析结果显示，在 WSSV 感染后，PcAtg2 基因沉默组中克氏原螯虾肝胰腺组织中的自噬小体多于对照组。本研究结果可为了解克氏原螯虾应对 WSSV 胁迫下的调控机制提供理论参考。关键词 克氏原螯虾；Atg2；基因克隆；WSSV；RNA 干扰 中图分类号 S966.12 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2023)05-0137-16 自噬(autophagy)是继细胞凋亡之后生命科学领域的另一个研究热点。自噬是细胞在自噬相关基因(autophagy-related gene,Atg)的调控下通过溶酶体降解受损细胞器和大分子的一种生物学过程。它在维持细胞内物质循环、细胞内环境稳态和机体动态平衡方面发挥着重要作用(Farre et al,2009;Mehrpour et al,2010)。自噬过程中形成的自噬体具有双层膜结构，这些双层膜的囊泡能包裹待降解的物质和受损细胞器，随即将它们运输至溶酶体中进行降解。自噬在消化降解时也为细胞内其他细胞器的组装提供原材料，即细胞内物质再循环(Green et al,2014;Mizushima et al,2011)。迄今为止，在酵母中已经确定多达 40 个自噬相关基因和 50 多个其他相关基因调节自噬过程中复杂的膜动态变化，这些基因中的大部分在哺乳动物中都存在相应的同源基因(Nakatogawa et al,2009)。自噬相关蛋白所形成的不同功能的复合体与其他调控因子相互作用共同参与自噬起始、自噬体的形成、自噬体与溶酶体的相互融合等过程(Cohen-Kaplan et al,2016;Ge et al,2014;Mizushima,2007)。Atg2 家族蛋白是较早被发现的自噬相关蛋白(Barth et al,2001;Shintani et al,2001)，酵母中只有Atg2 这一种类型，但在哺乳动物细胞中存在 Atg2A138 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 和 Atg2B 两个亚型。氨基酸预测得，Atg2 家族蛋白的 N 端结构与液泡分拣蛋白 13(vacuolar protein sorting 13,VPS13)类似，但其功能未知，并且 Atg2家族蛋白的 C 端在该家族中有 1 个保守的 ATG-C 结构 域(Munoz-Braceras et al,2015;Pfisterer et al,2014)。通过透射电镜(TEM)观察发现，哺乳动物敲除Atg2 基因后导致细胞内的自噬小体前体膜和分隔膜不断积聚(Kishi-Itakura et al,2014)。推测 Atg2 基因在哺乳动物和酵母细胞中的保守性功能极可能是促进自噬前体膜的组装与融合(Zheng et al,2017)。但 Atg2在甲壳动物中的作用却极少报道。克氏原螯虾(Procambarus clarkii)作为我国重要的淡水养殖虾类之一(Huang et al,2021)，由于其巨大的经济价值，已成为我国主要的水产经济甲壳物种(周剑等,2021)。近年来，克氏原螯虾市场需求日益扩大，养殖规模也在不断扩大，集约化养殖和管理不善导致病毒性疾病频频发生。其中，白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是一种极具破坏性的病原体，WSSV 引起的暴发性疾病，严重制约着克氏原鳌虾养殖业的健康发展。WSSV 病毒具有极强毒性，增殖速度快且致死率极高(徐婷婷等,2022)，已成为全球流行最广、传播最快的病毒之一，且宿主涵盖范围非常广泛(史晓丽等,2019)。多项研究结果显示，自噬在病毒侵染中发挥着重要的作用(Levine et al,2008;Shintani et al,2004;康恺等,2014)。病毒侵染可以刺激机体细胞发生自噬，研究表明，细胞自噬可直接包裹胞内的病毒并运送至溶酶体中将其降解；此外，自噬可将病毒核酸呈递给胞内感受器进而激活天然免疫，也可将病毒抗原呈递给主要组织相容性复合物以激活适应性免疫。本研究通过 RACE 技术克隆克氏原螯虾 Atg2 基因(PcAtg2)的全长序列，对其进行组织分布特征与在WSSV 胁迫下的表达模式分析，通过 RNA 干扰(RNAi)技术追踪 WSSV 病毒在克氏原螯虾体内增殖情况，进一步观察 WSSV 胁迫下克氏原螯虾肝胰腺中自噬小体的形成，期望探究克氏原螯虾在 WSSV胁迫下 PcAtg2 的分子功能和作用，以期为克氏原螯虾自噬基因对 WSSV 胁迫的应答分子机制提供更多的数据参考。1 材料与方法 1.1 实验材料 实验所用克氏原螯虾取自于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心扬中养殖基地。本研究中使用的所有实验方案均经南京农业大学动物保护与伦理委员会批准许可号：SYXK(Su)2011-0036。选取体长为 710 cm、体重为 812 g 的克氏原螯虾，在玻璃缸(97 cm 48 cm63 cm)内暂养 1 周，同时充分曝气养殖水温为(252),pH 为 6.730.18。1 周后，随机选取健康完整的雌雄克氏原螯虾各 3 尾，分别取肝胰腺、肌肉、心脏、中肠、鳃、胃、腹神经节、血淋巴、卵巢、精巢、表皮和眼柄组织，液氮速冻后置于80 冰箱保存备用。主要涉及实验耗材及试剂盒：氯仿、异丙醇、无水乙醇、NaCl、TRIzol 试剂、cDNA 逆转录试剂盒、SYBR qPCR Mixture、DNase/RNase-Free Water、HiScript-TS 5/3RACE Kit、Gel Extraction Kit、pMD19-T 载体、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 感受态细胞、琼脂糖凝胶回收试剂盒等。实验主要仪器：恒温培养摇床、高速冷冻离心机(Eppendorf,德国)、凝胶成像仪 Beck-man Coulter CEQ 8000(Thermo,美国)、微量光度分析仪 NanoDrop 2000(Thermo,美国)、荧光定量 PCR 仪(Bio-Rad,美国)和电泳仪等。1.2 总 RNA 的提取与 cDNA 的合成 将上述所取的克氏原螯虾组织置于液氮中充分研磨以便进行 RNA 提取。利用 1%琼脂糖凝胶电泳测定 RNA 产物的完整性，再利用微量光度分析仪测量RNA 浓度和纯度(OD260 nm和 OD280 nm的比值)。参照逆转录试剂盒指导说明书进行总 RNA 的逆转录，并保存在80 下备用。1.3 克氏原螯虾 Atg2 基因克隆 以克氏原螯虾肝胰腺组织 cDNA 为模板，根据本实验室构建的克氏原螯虾转录组文库所获得的 Atg2基因保守序列(Shen et al,2020)，利用 Primer Premier 5.0 软件分别为 5RACE 和 3RACE 设计特异性引物并合成(表 1)。参照 5/3-RACE 操作说明将克氏原螯虾肝胰腺总 RNA 反转录成 cDNA 第一链，以 5/3-RACE cDNA，5/3GSP 为引物，分别进行 3端和 5端序列的快速扩增。5/3RACE-PCR 产物进行 DNA胶回收，随后与 pMD19-T 载体连接，37 连接 4 h，然后转化 DH5 感受态细胞，经 PCR 鉴定筛选后，随即进行阳性菌液测序及拼接测序，最后，将测序结果与 Atg2 基因序列比对，获得克氏原螯虾 Atg2(PcAtg2)基因 cDNA 全序列。1.4 生物信息学分析 利用 ORF Finder 在线平台进行开放阅读框预测；利用 DNAMAN 软件进行氨基酸序列翻译；PcAtg2 第 5 期 祝孟茹等:克氏原螯虾自噬相关基因 PcAtg2 的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析 139 表 1 相关引物的序列信息 Tab.1 Sequences of primers used in the present study 引物名称 Primer name 序列(53)Sequence(53)用途 Application PcAtg2-3GSP-1 TGTATCAGGAGCCATCGGAGGAGT 3RACE PcAtg2-3GSP-2 TGATGCTCGTAAAGAAGCGGCTGA 3RACE PcAtg2-5GSP-1 ATATCGCTGAAGGAGG 5RACE PcAtg2-5GSP-2 TAATCGCCCTCTTCTTGA 5RACE PcAtg2-5GSP-3 ATCCGACCACGGGAAGTA 5RACE PcAtg2-F GTACTTCCCGTGGTCGGATG RT-qPCR PcAtg2-R CCATCCACGAACCTGAGAGG RT-qPCR LC3-F TGAGTAGTCCGTCTCGGTGT RT-qPCR LC3-R CCATGTAGAGGAACCCGTCG RT-qPCR P62-F AACACGACCAGACCTTGGAC RT-qPCR P62-R CATACGGTGTTCGGAGTGCT RT-qPCR Atg5-F CCTACCGAAGAGGGAGGCTT RT-qPCR Atg5-R GTGTGGCCCTCAGGAGATAC RT-qPCR Atg12-F TGGAGGGGAAGGACTTACGG RT-qPCR Atg12-R AGCTTTCCCTTAGCAGTCTTC RT-qPCR WSSV-F GCTGGCAAAATCTTCCACCA RT-qPCR WSSV-R CCACAAAAGACTGGGATGGC RT-qPCR-actin-F ATAACGCACCACCACCATGT RT-qPCR-actin-R CGTCCTTCTGACCCATACCG RT-qPCR dsPcAtg2-F TAATACGACTCACTATAGGGCCCAGCAACTGGAGATGGTT RNAi dsPcAtg2-R TAATACGACTCACTATAGGGTGATGCAGCAGGGAAGTGTT RNAi dsGFP-F GCGTAATACGACTCACTATAGGTGGTCCCAATTCTCGTGGAAC RNAi dsGFP-R GCGTAATACGACTCACTATAGGCTTGAAGTTGACCTTGATGCC RNAi 基因的保守结构域在 NCBI 中 CD-search 工具进行预测；利用 SOPMA 和 SWISS-MOLDEL 在线工具分别进行 PcAtg2 基因编码蛋白的结构预测。以 NCBI 中BLAST 工具进行 PcAtg2 基因氨基酸同源性分析；再进行 PcAtg2 蛋白信号肽预测，通过在线平台 PcAtg2基因磷酸化位点和糖基化位点，使用 Compute pI/Mw计算其理论等电点(pI)和相对分子量；最后，利用DNAMAN 软件及多重序列对比工具进行多物种的氨基酸序列比对，并以 MEGA 7.0 软件构建 PcAtg2 氨基酸系统发育进化树。1.5 PcAtg2 基因在组织中的表达分析 为了确定 PcAtg2 在不同组织中的表达特异性，依据以上 RACE 实验得到的 PcAtg2 基因全序列设计并合成实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)扩增引物。克氏原螯虾-actin 基因做为内参基因并设计引物进行 RT-qPCR 实验，且每个样品及内参均设置 3 个重复。根据 2Ct算法计算各样品中 PcAtg2 基因相对表达量(Schmittgen et al,2008)。1.6 WSSV 胁迫实验 随机挑选 120 尾健康克氏原螯虾，用于 WSSV感染实验。将实验虾随机分为 2 组，每组 3 个重复，每个重复 20 尾，分别于虾体第 2 背节注射 PBS 和WSSV 悬液。实验组虾注射 100 L WSSV 悬液(1.0 108 CFU/mL)，对照组注射 100 L 无菌磷酸盐(PBS,pH 7.4)。注射后 0、6、12、24、48 和 96 h 时随机选取健康完整的 3 尾虾，获取克氏原螯虾肝胰腺和肌肉组织，置于80保存。用于刺激克氏原螯虾的 WSSV病毒悬液由厦门大学水产学院实验室馈赠。1.7 RNA 干扰(RNA interference,RNAi)实验 PcAtg2 基因和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的双链 RNA(double-stranded RNA,dsRNA)的合成均按照 T7 RNAi Transcription Kit 说明书进行。注射前，将合成的 dsPcAtg2 和 dsGFP 稀释至 1 g/L。取健康的克氏原螯虾平均体重为(5.0 1.0)g，以 35 g/g 虾的比例注射 dsRNA(Bai et al,140 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 2015)。注射实验共 4 组，分别为 PBS 注射组、dsGFP注射组、dsPcAtg2 注射组和不注射组。每组 3 个重复，每个重复 30 尾。分别于注射实验后 24、48、72 和 96 h后各组中随机挑选健康克氏原螯虾 6 尾，取肝胰腺组织置于 RNAlater 溶液中，用于检测 dsRNA 注射后PcAtg2 基因的干扰效率。在 dsRNA 注射 48 h 后进行WSSV 胁迫实验，在注射 WSSV 的 0、6、12、24、48和 96 h 分别取其肝胰腺组织置于80保存。同时，收集克氏原螯虾新鲜肝胰腺组织，并于 2.5%戊二醛中预固定 24 h，在 1%OsO4中固定 1 h，4 下保存24 h，利用日本日立 H-7500 型透射电镜仪器观察WSSV 感染下的自噬体。1.8 统计分析 所有数据均以平均值标准差(Mean+SD)表示(组间重复 n=3)，采用 SPSS 20.0 软件进行单因素方差显著分析(one-way ANOVA)，显著水平设为 P0.05 和P0.01。采用多重比较检验组间差异(T 检验/Duncan检验)，利用 GraphPad Prism 8.0 软件进行图形绘制。2 结果与分析 2.1 PcAtg2 基因全长及 cDNA 序列分析 以克氏原螯虾肝胰腺总 RNA 为模板所克隆得到的 PcAtg2 基因序列全长为 9 966 bp(GenBank 登录号MZ425926)，包括 6 567 bp 的开放阅读框、582 bp 的5端非编码区(untranslated region,UTR)和 2 817 bp 的3UTR，其中 3UTR 具有加尾信号(AATAAA)和典型的 Poly(A)尾结构。推测编码氨基酸 2 189 个，编码蛋白的相对分子量为 242.59 kDa，理论等电点(pI)为5.38；在该氨基酸序列上预测到了 65 个丝氨酸磷酸化位点和 48 个糖基化位点，信号肽结构域位列于第 170 位氨基酸，ATG 结构域位于 2 0932 178 位氨基酸(图 1)。2.2 PcAtg2 氨基酸多序列比对及系统发育分析 利用 NCBI 中 BLASTp 在线工具进行 PcAtg2 氨基酸序列的同源性分析。结果显示，PcAtg2 与美洲螯龙虾(Homarus americanus)的 Atg2 氨基酸序列同源性 最高(图 2)，达 88.26%，与凡纳对虾(Penaeus vannamei)、斑节对 虾(P.monodon)、三疣 梭子 蟹(Portunus trituberculatus)、雪蟹(Chionoecetes opilio)、隐 白 蚁(Cryptotermes secundus)和东亚飞蝗(Locusta migratoria)的同源性分别为 80.85%、80.67%、75.21%、74.60%、42.88%和 43.37%。利用 MEGA 7 软件，基于邻接法构建了PcAtg2和其他物种的系统进化树(图3A)。PcAtg2 先与甲壳动物美洲螯龙虾聚为一支，随后与其他无脊椎动物聚为一类。2.3 PcAtg2 蛋白空间结构预测 PcAtg2 蛋白二级结构预测结果显示，无规则卷曲占比最高(55.26%)，其次是-螺旋(26.97%)、延伸链(15.40%)，-折叠仅占 2.38%。利用 SWISS-MODEL在线工具构建了 PcAtg2 蛋白可能存在的三级结构(PDB DOI:10.2210/pdb6A9J/pdb)，结果如图 3B 所示。2.4 PcAtg2 基因在各组织的表达情况 采用 RT-qPCR 检测 PcAtg2 基因在肝胰腺、肌肉、心脏、中肠、鳃、胃、腹神经节、血淋巴、卵巢、精巢、表皮和眼柄组织中的表达情况。结果显示，PcAtg2基因在雌、雄性克氏原螯虾生殖器官组织中的相对表达量无显著差异，但在不同组织中的表达存在差异(P0.05)。PcAtg2 基因在肝胰腺组织中的相对表达量最高，显著高于其他组织，其次为肌肉和表皮，而在眼柄中的相对表达量最低(图 4)。2.5 WSSV 胁迫对 PcAtg2 基因表达的影响 WSSV 感染克氏原螯虾后的不同时间点，通过RT-qPCR 检测了 PcAtg2 在克氏原螯虾肝胰腺、肌肉、表皮、血淋巴、中肠和心脏中的表达模式(图 5)。与PBS 组相比，注射 WSSV 组的克氏原螯虾不同组织中PcAtg2的相对表达量呈先升高后降低趋势。PcAtg2在肝胰腺、表皮、中肠和心脏组织中的相对表达量在24 h 达到峰值，然后恢复正常，而在肌肉和血淋巴组织中的相对表达量在 48 h 达到峰值，然后恢复正常水平。尽管在 WSSV 感染条件下，PcAtg2 在不同组织中的表达模式不同，但均表现出一定程度的诱导作用。结果表明，PcAtg2 在克氏原螯虾应对 WSSV感染中发挥一定作用。2.6 PcAtg2 基因干扰后的相关表达分析 为验证 dsRNA 干扰效率，向克氏原螯虾注射体外合成的 dsPcAtg2 进行基因沉默。dsPcAtg2 注射组在 24、48、72 和 96 h 的 PcAtg2 相对表达量分别仅为对照组(dsGFP 注射组)的 51.53%、26.61%、42.7%和 62.73%(图 6A)。实验结果显示，RNAi 有效抑制了 PcAtg2 基因的表达，并且在注射后 48 h 干扰效率达到最大值。与对照组相比，dsPcAtg2 注射组的 WSSV 拷贝数在 WSSV 胁迫后 2472 h 出现上升趋势(图 6B)，说明病毒增殖明显。然而，dsPcAtg2 注射组的 WSSV 第 5 期 祝孟茹等:克氏原螯虾自噬相关基因 PcAtg2 的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析 141 142 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 图 1 PcAtg2 基因全长 cDNA 序列及推导的氨基酸序列 Fig.1 Nucleotides and deduced amino acid sequences of the PcAtg2 cDNAs 起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)用黑色方框表示，浅灰色阴影区域为 VPS13-N 端结构域序列，深灰色阴影区域为VPS13-C 端结构域序列，箭头方向表示 ATG-C 端结构域，*表示氨基酸的终止，下划线表示 poly A 加尾信号(AATAAA)。Black panes indicate the start codon(ATG)and the stop codon(TAA).N-terminal region and C-terminal region of VPS13 are shaded by light gray and dark gray,arrow below the sequences represents the autophagy-related protein C terminal domain.*indicates the termination codon.The poly(A)special sequences AATAAA is underlined.第 5 期 祝孟茹等:克氏原螯虾自噬相关基因 PcAtg2 的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析 143 144 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 图 2 PcAtg2 与其他已知物种 Atg2 氨基酸序列比对 Fig.2 Amino acid alignment of PcAtg2 with those of other known animals 基因登录号：克氏原螯虾，MZ425926；美洲螯龙虾，XP_042231353.1；凡纳对虾，XP_027223358.1；雪蟹，KAG0728919.1；斑节对虾，XP_037790247.1；三疣梭子蟹，MPC48873.1；隐白蚁，PNF21608.1；东亚飞蝗，ATX63054.1。红色方框表示信号肽序列，绿色方框为 ATG 结构域，下同。Genbank accession number:P.clarkia,MZ425926;H.americanus,XP_042231353.1;P.vannamei,XP_027223358.1;C.opilio,KAG0728919.1;P.monodon,XP_037790247.1;P.trituberculatus,MPC48873.1;C.secundus,PNF21608.1;L.migratoria,ATX63054.1.The red box represents the signal peptide sequence,and the green box represents the ATG domain,the same below.第 5 期 祝孟茹等:克氏原螯虾自噬相关基因 PcAtg2 的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析 145 图 3 PcAtg2 氨基酸序列与其他物种 Atg2 氨基酸序列的系统发育进化树(A)和蛋白三级结构预测结果(B)Fig.3 Phylogenetic analysis of PcAtg2 amino acid sequences with other known species(A),and a tertiary structure prediction of PcAtg2 protein(B)图 4 PcAtg2 基因在不同组织中的表达 Fig.4 Expression of PcAtg2 gene in different tissues of P.clarkii HP：肝胰腺；MU：肌肉；EP：表皮；HC：血淋巴；MI：中肠；HE：心脏；GI：鳃；OV：卵巢；TE：精巢；AG：腹神经节；ST：胃；EY：眼柄。柱上字母不同表示组织间差异显著(P0.05)。HP:Hepatopancreas;MU:Muscle;EP:Epidermis;HC:Hemocyte;MI:Midgut;HE:Heart;GI:Gill;OV:Ovary;TE:Testis;AG:Abdominal ganglion;ST:Stomach;EY:Eyestalk.Different letters mean significant difference between different tissues(P0.05).拷贝数显著低于对照组和 dsGFP 注射组，表明 WSSV病毒复制在 PcAtg2 基因沉默期间受到一定程度的抑制。图 6C 记录了 WSSV 感染期间每个实验组不同时间点的死亡率，其中 PBS 注射组总死亡率最高(63%)，其次分别是对照组(57%)、dsGFP 注射组(51%)和dsPcAtg2 注射组(43%)。dsPcAtg2 注射组的死亡率从24 h 开始超过 24%，低于 dsGFP 注射组(31%)、对照组(39%)和 PBS 注射组(63%)。dsPcAtg2 注射组 48 h的死亡率为 30%，也低于 dsGFP 注射组(42%)、PBS注射组(48%)和对照组(52%)。死亡率结果显示，沉默PcAtg2基因能够降低 WSSV对克氏原螯虾的致死率。2.7 WSSV 胁迫下克氏原螯虾肝胰腺超微结构分析 为阐明 WSSV 胁迫对克氏原螯虾肝胰腺组织的影响，本研究检测了注射 dsPcAtg2 组在 WSSV 胁迫后克氏原螯虾肝胰腺组织超微结构的变化，采用透射电镜观察组织切片，在 WSSV 胁迫 24 和 48 h 后，对照组、dsPcAtg2 注射组和 dsGFP 注射组克氏原螯虾肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡，细胞核附近溶酶体出现并聚集了更多自噬体(图 7)，实验结果显示，克氏原螯虾在 WSSV 胁迫下能激活细胞自噬调节。其中，WSSV 胁迫 24 和 48 h 后 dsPcAtg2 注射组的克氏原螯虾细胞中聚集的自噬体多于 dsGFP 注射组和对照组。在 WSSV 胁迫下，自噬标志基因(P62,LC3b,Atg5和 Atg12)在克氏原螯虾肝胰腺组织中不同时间的表达情况见图 8。如图 8 所示，dsPcAtg2 注射组克氏原螯虾的 LC3b、Atg5 和 Atg12 基因相对表达量显著高于对照组。LC3b 和 Atg12 基因相对表达量在 48 h 达到最大值，Atg5 基因相对表达量在 24 h 时达到最大值。然而，P62 基因的相对表达量显著低于对照组。3 讨论 本研究利用 RACE 技术克隆得到了克氏原螯虾PcAtg2 基因序列全长，氨基酸多序列比对结果显示，PcAtg2 有 65 个丝氨酸磷酸化位点和 48 个糖基化位点，这些位点在众多生物反应中起到关键作用，如分子识别、信号转导和免疫调节等(范红弟等,2020)。结构预测表明，PcAtg2 含有 ATG-C 端和 VPS13-N 端和 C 端结构域，Atg2 和 VPS13 的结构域具有相似的序列，推测 Atg2 可能也具有脂质转运活性(Saikat et al,146 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 图 5 PcAtg2 在 WSSV 感染克氏原螯虾各组织中的相对表达水平 Fig.5 Relative expression levels of PcAtg2 in tissues of P.clarkii after WSSV infection PBS 注射组的表达模式作为对照。*表示组间差异显著(P0.05),*表示组间差异极显著(P0.01)。下同。The expression pattern in the PBS injection group was used as a control.*indicated significant different with control group(P0.05),*indicated highly significant different with control group(P0.01).The same as below.图 6 PcAtg2 基因沉默和 WSSV 胁迫下的相关实验 Fig.6 Related experiments after PcAtg2 silencing and under WSSV stress A：注射 dsPcAtg2 的克氏原螯虾肝胰腺中 PcAtg2 基因的相对表达量；B：WSSV 感染注射 dsPcAtg2 的克氏原螯虾后的增殖情况；C：WSSV 胁迫下注射 dsPcAtg2 的克氏原螯虾的死亡率变化 A:Relative gene expression levels of PcAtg2 in hepatopancreas of P.clarkii after injection of dsPcAtg2;B:Proliferation of WSSV in the P.clarkii injected with dsPcAtg2 post WSSV challenging;C:Mortality changes of P.clarkii injected with dsPcAtg2 post WSSV challenging 2018)。Atg2 至少可以使用 2 个独立的结合域与细胞膜相互作用(Kotani et al,2018;Tamura et al,2017)。一个膜结合结构域位于 N 端区域，与 VPS13 蛋白家族的 N 端区域具有弱序列同源性。虽然 VPS13-N 对于Atg2 定位至自噬体前体不是至关重要的，但对于将Atg2 固定到内质网非常重要(Kotani et al,2018)。另一个膜结合域位于 Atg2 的 C 端，预计形成两亲性螺旋，对将 Atg2 靶向 PAS 至关重要(Kotani et al,2018)。这 2 种膜结合结构域在细胞质到液泡的靶向与囊泡介导的分选以及细胞内蛋白运输中起作用(Leonzino et al,2021)。系统进化树结果表明，PcAtg2 基因与美洲螯龙虾氨基酸序列相似性最高，优先聚为一支，再与亲缘关系相近的虾蟹等甲壳类聚为一支，说明该基因在进化上相对保守。PcAtg2 基因在克氏原螯虾不同组织分布研究发现，PcAtg2 基因遍布所有组织，推测 Atg2 可能参与多种细胞代谢功能；然而，其在不同组织中的表达丰度不同，这也说明其具有组织偏好性，通常在免疫、发育组织中有较高的表达量。肝胰腺是甲壳动物重要的免疫器官，也是 WSSV 侵袭机体的重要靶器官，在调节生物体的代谢过程和免疫 第 5 期 祝孟茹等:克氏原螯虾自噬相关基因 PcAtg2 的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析 147 图 7 WSSV 对克氏原螯虾肝胰腺组织超微结构的影响 Fig.7 Effects of WSSV on ultrastructure of hepatopancreas tissue of P.clarkia AC分别为对照组、dsPcAtg2注射组、dsGFP注射组24 h的肝胰腺超微结构；DF分别为对照组、dsPcAtg2注射组、dsGFP注射组48 h的肝胰腺超微结构 M：线粒体；N：细胞核；Er：内质网；Ly：溶酶体；Go：高尔基体；箭头符号表示自噬小体。AC:Ultrastructure of hepatopancreas of control group,dsPcAtg2 injected group,and dsGFP injected group in 24 h;DF:Ultrastructure of hepatopancreas of control group,dsPcAtg2 injected group,and dsGFP injected group in 48 h M:Mitochondria;N:Nucleus;Er:Endoplasmic reticulum;Ly:Lysosome,Go:Golgi apparatus;Arrow symbols indicate autophagosome.图 8 注射 dsPcAtg2 的克氏原螯虾感染 WSSV 后肝胰腺中自噬相关基因的相对表达量 Fig.8 Relative expression of autophagy related genes in hepatopancreas of dsPcAtg2 injected P.clarkii post WSSV challenging 应答中起着重要作用(Shen et al,2014;Jiao et al,2019;Dai et al,2017)。肝胰腺在甲壳动物物质代谢过程中发挥重要作用(Alexandre et al,2013)，在功能上与哺乳动物的肝脏和胰脏相类似(Rszer,2014)。本研究中，PcAtg2 在肝胰腺组织中的高表达也说明其在机体免疫反应中发挥重要作用。目前已发现多种水生动物病毒感染也可引起细胞自噬，例如鲑传染性贫血病毒(infectious salmon anemia virus,ISAV)诱导细胞自噬，并能利用自噬进行复制(Schiotz et al,2010)。而细胞自噬在牡蛎疱疹病毒148 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 (ostreid herpesvirus-1,OsHV-1)感染过程中发挥抗病毒作用(Moreau et al,2015)。鲤春病毒血症病毒(spring viremiaof carp virus,SVCV)、乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus,SHVV)侵染细胞均能够诱发自噬活动，病毒与自噬的关系也因毒株和其靶细胞类型不同而存在差异(Liu et al,2015;Wang et al,2016)。近年来，越来越多的研究表明，Atgs 在脊椎动物和无脊椎动物抵抗病原体感染的免疫反应中起着重要作用(Li et al,2009;Richetta et al,2013)。Atg1 和 Atg5 沉默的果蝇(Drosophila)感染水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)后，实验组大量果蝇死亡，病毒浓度显著高于对照组，表明自噬在果蝇 VSV 感染中起着重要的拮抗作用(Shelly et al,2009)。黄病毒科(Flaviviridae)的登革热病毒(dengue virus,DENV)可诱导自噬，促进自噬有助于病毒复制(Heaton et al,2011)。柯萨奇病毒(Coxsackie virus,CV)中 Atg7 基因缺失后，病毒的复制水平显著降低，成熟病毒粒子的释放受到抑制(Meyers et al,1998)。在新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染胶质瘤细胞的实验中，发现用 RNAi沉默 Atg5 和 Beclin-1 后，病毒浓度显著降低(Li et a