金花茶CnbHLH79转录因子的克隆、亚细胞定位及表达分析.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(8):241-250收稿日期：2022-12-29基金项目：国家自然科学基金项目（31860228），广西林业厅项目（桂林科研202112 号），广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（2022KY0577），玉林师范学院高层次人才科研启动基金（G2019ZK13，G2019ZK35）作者简介：李博，男，博士，副教授，研究方向：金花茶的资源利用；E-mail:通讯作者：朱宇林，男，博士，教授，研究方向：植物资源利用及种质创新；E-mail:金花茶 CnbHLH79 转录因子的克隆、亚细胞定位及 表达分析李博1，3 刘合霞1 陈宇玲1 周兴文2 朱宇林1，3（1.玉林师范学院生物与制药学院，玉林 537000；2.福建工程学院建筑与城乡规划学院，福州 350118；3.玉林师范学院广西高校亚热带生物资源保护与利用重点实验室，玉林 537000）摘 要：为探究 CnbHLH79 转录因子在金花茶花色形成中的作用机理，克隆了金花茶 CnbHLH79 转录因子的编码序列，对其进行生物信息学和亚细胞定位分析，利用荧光定量 PCR 技术分析了 CnbHLH79 转录因子在金花茶不同组织，以及不同发育阶段的花瓣中的表达模式，并分析 CnbHLH79 转录因子的表达量与色相 b*、类黄酮物质含量的相关关系。研究结果表明，CnbHLH79转录因子的开放阅读框长度为 855 bp，共编码 284 个氨基酸，具有 bHLH_AtBPE_like 保守结构域。系统进化分析发现，金花茶CnbHLH79 蛋白与茶树 bHLH79 蛋白的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示，CnbHLH79 转录因子主要在细胞核中发挥功能。对CnbHLH79转录因子进行实时荧光定量PCR分析发现，该转录因子在金花茶的根、花等组织中表达量较高；还发现在花朵开放过程中，CnbHLH79 转录因子的表达量总体呈先高后低，逐步下降的趋势；此外，CnbHLH79 的表达量与色相 b*值、槲皮素-7-O-葡糖苷的相关性系数分别为-0.92、-0.7，它们之间的负相关性较高。本研究将为阐明 CnbHLH79 转录因子在金花茶中调控类黄酮的合成机制，以及调控花瓣显黄色的作用机理奠定基础。关键词：金花茶；CnbHLH79 转录因子；花色形成；类黄酮合成调控；亚细胞定位；表达定量；相关分析DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1562Cloning,Subcellular Localization and Expression Analysis of CnbHLH79 Transcription Factor from Camellia nitidissima LI Bo1,3 LIU He-xia1 CHEN Yu-ling1 ZHOU Xing-wen2 ZHU Yu-lin1,3（1.College of Biology and Pharmacy,Yulin Normal University,Yulin 537000;2.College of Architecture and Planning,Fujian University of Technology,Fuzhou 350118;3.Key Laboratory for Conservation and Utilization of subtropical Bio-Resources in Education Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Yulin Normal University,Yulin 537000）Abstract:In order to explore the regulation mechanism of CnbHLH79 in the flower color formation of Camellia nitidissima,the coding sequence of CnbHLH79 was cloned and analyzed by bioinformatics,and the subcellular localization of CnbHLH79 protein was performed.Subsequently the expression pattern of CnbHLH79 was analyzed by fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）in different tissues and petals of different flowering stages,and the correlation between the expression of CnbHLH79 and value of chromaticity b*and the content of flavonoid compounds was analyzed.It was found that the coding sequence of CnbHLH79,with bHLH_AtBPE_like conserved domain,was 855 bp encoding 284 amino acids.CnbHLH79 had the closest relationship with bHLH79 protein of Camellia sinensis.Subcellular localization analysis showed that CnbHLH79 mainly had functions in the nucleus.CnbHLH79 highly expressed in the roots and flowers of C.nitidissima and gradually decreased at flowering stages by RT-qPCR.In addition,correlation coefficient between the expression of CnbHLH79 and the value of chromaticity b*and 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8242金 花 茶（Camellia nitidissima）为 山 茶 科（Theaceae）山茶属（Camellia）植物，主要分布在中国广西地区1。金花茶花色金黄，是培育黄色山茶的珍贵种质资源2。已有研究表明，金花茶花瓣中富含的类黄酮物质，不仅是金花茶抵御外界胁迫的有用物质，而且可能是促使金花茶开黄花的关键色素3-4。植物中类黄酮的合成由一系列结构基因编码的酶催化完成5-6。目前，利用转录组测序及基因克隆技术，金花茶中类黄酮合成途径的大部分结构基因已被克隆7-11，金花茶花色形成机理正在逐渐阐明，但是关于金花茶花色的转录水平调控机制及转录因子的作用机理尚不明确。MYB 转录因子、碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子、WD40 转录因子及其互作形成的 MBW（MYB-bHLH-WD40）复合体是植物中广泛存在、可调控植物类黄酮物质合成的关键转录因子12-14。目前，许多构成 MBW 复合体的转录因子已陆续从各种植物中被分离和克隆出来，利用亚细胞定位、酵母杂交实验、双荧光素酶互补反应实验等技术手段，这些转录因子的调控机制已被阐明，MBW 复合体或单独的 MYB、bHLH 均可参与调节植物组织的着色，在类黄酮合成途径中发挥重要的调控作用。例如，MBW 复合体可调节茶树（Camellia sinensis）叶片中类黄酮物质的合成以及叶片颜色的形成15；而矮牵牛（Petunia hybrida）16、蝴蝶兰（Phalaenopsis aphrodite）17、百合（Lilium brownii）18等植物的MBW 复合体或单独的 MYB、bHLH 则可调节花瓣颜色形成，使花瓣呈现多彩的颜色，或使花瓣上形成类型各异的花斑；此外，将克隆获得的 MYB 或bHLH 导入到非同种植物中进行异源表达，也能发挥其调控花色改变的作用19-20。本课题组前期研究发现，CnbHLH79 转录因子在金花茶开花过程中差异表达，且它与部分催化类黄酮合成的结构基因及 MYB 转录因子具有较高的相关性，推断该转录因子可能是 MBW 复合体的关键成员之一（数据未发表）。但是金花茶 CnbHLH79 转录因子的克隆鉴定，以及它在金花茶中的表达情况尚未见报道。因此，本研究以金花茶花瓣作为研究材料，克隆金花茶 CnbHLH79 转录因子的全长序列，对该转录因子进行生物信息学分析和亚细胞定位研究，在转录水平上分析 CnbHLH79 转录因子在金花茶的侧根、茎、叶、盛开的花等不同组织，以及不同开花时期花瓣中的表达模式，并分析 CnbHLH79转录因子的表达量与色相 b*、类黄酮物质含量的相关关系。本研究为阐明 CnbHLH79 转录因子在金花茶类黄酮的合成调控机制，以及调控花瓣显黄色的作用机理奠定基础，为黄色山茶品种的培育提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料采集金花茶的根、茎、叶、花等不同组织，以及不同开花时期的花瓣（图 1），该金花茶植株种植在广西玉林师范学院的苗圃内（N 224058，E 1101127）。利用液氮速冻采集到的金花茶组织，然后保存在-70超低温冰箱中备用。1.2 方法1.2.1 金花茶不同组织总 RNA 的提取及 CnbHLH79转 录 因 子 的 克 隆 首 先 利 用 RNA 提 取 试 剂 盒（RNAprep Pure DP441，天根生化科技，中国北京）提取金花茶的根、茎、叶、花、花瓣等不同组织的总 RNA，随后对金花茶总 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，再利用反转录试剂盒（PrimerScripTM RT reagent Kit,TaKaRa，中国大连）对总 RNA 进行反转录，从而获得 cDNA 模板。利用金花茶花瓣组织的转录组测序所获得的 unigene 序列，并从中筛选出金花茶 CnbHLH79 转录因子序列，利用 prime primer 3 在线软件设计出金花茶 CnbHLH79 转录因子的扩增特异性引物（表 1），并利用该对引物对金花茶 CnbHLH79 转录因子进行 PCR 扩增，PCR 反应content of Qu7G was-0.92 and-0.70 respectively,which had negative relationship.This study lays a foundation for elucidating the mechanism of CnbHLH79 transcription factor regulating the synthesis of flavonoids in C.nitidissima and the mechanism of regulating the yellow color of petals.Key words:Camellia nitidissima;CnbHLH79 transcription factor;flower color formation;regulation of flavonoid synthesis;subcellular localization;quantitative analysis of expression;correlation analysis2023,39(8)243李博等：金花茶 CnbHLH79 转录因子的克隆、亚细胞定位及表达分析程序如下：94预变性 2 min；98变性 10 s，55退火 30 s，68延伸 60 s，共 32 个循环；68延伸5 min。利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增获得的产物，并将 852 bp 的电泳片段切下，使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（DP209-03，天根生化科技，中国北京）回收目的片段，按照试剂盒说明书进行操作。将目的片段连接在 pEGOEP35S-H 载体上（艾迪晶，中国武汉），再转化到大肠杆菌（Escherichia coli）DH5（TaKaRa，中国大连）中，随后进行菌落 PCR 检测，提取阳性菌斑的质粒进行测序，测序工作由武汉艾迪晶生物公司完成。1.2.2 CnbHLH79 转录因子的生物信息学分析 使用 ORF Finder（http:/www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html）预测金花茶 CnbHLH79 转录因子的开放阅读框。通过 NCBI 网站的 blastp 程序（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blastp）进行同源性比对，获取金花茶 CnbHLH79 的同源基因。随后利用 ExPASy 在线网站（https:/web.expasy.org/protparam/）预测金花茶 CnbHLH79 的蛋白质性质。而 CnbHLH79 蛋白的亚细胞定位及二级结构预测则通过利用 Plant-mPLoc在 线 网 站 完 成（http:/ 利 用 DNAMAN 8.0 软 件 对bHLH79 蛋白进行多序列比对。利用 SWISS-MODEL在 线 网 站（https:/swissmodel.expasy.org/interactive）对金花茶 CnbHLH79 蛋白的三级结构模型进行预测。再利用 MEGA10 软件，采用最大似然法（maximum likelihood,ML）构建系统进化树，分析 CnbHLH79 同源基因的系统进化关系（bootstrap=1 000）。1.2.3 金 花 茶 CnbHLH79 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 分析 构建融合表达载体 pEGOEP35S-H-bHLH79-GFP，将其转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。利用电转化法，将测序结果正确的阳性克隆的质粒转化到根瘤农杆菌（GV3101）。将农杆菌菌液注射到烟草下表皮叶片，弱光培养 48 h后，将烟草叶片制作成玻片，在激光共聚焦显微镜（FV3000，Olympus 公司，日本）下观察，并拍照。1.2.4 CnbHLH79 转录因子的定量分析及相关性分析 利用 Primer 5 软件设计 CnbHLH79 转录因子从左到右分别是侧根、茎、叶；不同的开花时期分别为幼蕾期（A）、初蕾期（B）、显色期（C）、半开期（D）、盛开期（E）The cultures of C.nitidissima are lateral root,stem and leave from left to right.The different flowering stages are young bud（A）,early bud（B）,chromogenic stages of flowering（C）,the half-opening stage（D）and blooming stage（E）图 1 用于荧光定量表达的金花茶不同组织Fig.1 Different cultures of C.nitidissima for fluorescence quantitative analysis表 1 CnbHLH79 转录因子克隆、亚细胞定位以及表达定量所用引物Table 1 Primers used for cloning,subcellular localization and quantitative analysis of CnbHLH79引物名称 Primer name引物序列 Primer sequence（5-3）用途 UseCnbHLH79-FGATCCTCCGATAATCAATTTGACCTCTTTC克隆 CloneCnbHLH79-RTGCTGCTCTATCAAAACTGCTACCAACCnbHLH79-FGGAACACCAACATTTGATGC定量表达 Quantitative expressionCnbHLH79-RATGAAGCCATTCGGTTTGTCnbHLH79-FACTAGGGTCTCGCACCATGGATCCTCCGATAATCAATTTGACCTCTTTC亚细胞定位 Subcellular localizationCnbHLH79-RACTAGGGTCTCTCGCC TGCTGCTCTATCAAAACTGCTACCAAC18S rRNA-FCAACCATAAACGATGCCGA内参基因 Reference gene18S rRNA-RAGCCTTGCGACCATACTCC生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8244的荧光定量 PCR 引物（表 1）；利用 18S rRNA 作为内参基因进行荧光定量 PCR 反应9,21，检测CnbHLH79 转录因子在侧根、茎、叶、盛开的花等不同组织中的表达情况，此外还检测了 CnbHLH79转录因子在花瓣发育过程中的表达情况，每个样品重复 3 次，采用 2-CT法22计算差异基因的相对表达量，并利用单因素方差分析模型分析不同表达量之间是否存在显著性差异。将开花过程中CnbHLH79 在花瓣中的表达量与金花茶的色相 b*值、槲皮素-7-O-葡糖苷（quercetin 3-O-rhamnoside-7-O-glucoside,Qu7G）、槲 皮 素-3-O-葡 糖 苷（quercetin 3-O-glucoside,Qu3G）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）等类黄酮物质含量（上述数值来自课题组之前的实验研究）4进行 Pearson 相关性分析，研究 CnbHLH79 的表达量与花色表型指标之间的相关性。2 结果2.1 金花茶CnbHLH79基因的克隆以金花茶花瓣的 cDNA 为模板，利用特异性引物进行扩增，得到 850 bp 左右的扩增条带（图 2）；随后对扩增产物行测序，测序结果显示，克隆获得的金花茶 CnbHLH79 转录因子序列的开放阅读框长度为 855 bp，该转录因子共编码 284 个氨基酸。在NCBI 数据库中对 CnbHLH79 的编码序列进行 Blast比对发现，CnbHLH79 与茶树（C.sinensis）bHLH79-like 转 录 因 子（XP_028119408.1）、褐 枝 猕 猴 桃（Actinidia rufa）bHLH79-like 转录因子（GFS32687.1）、中 华 猕 猴 桃（Actinidia chinensis var.chinensis）bHLH79-like 转录因子（PSS07838.1）的相似性较高，CnbHLH79 与这 3 个转录因子的相似性（identity）分别为 98.94%、72.79%、72.44%。2.2 金花茶CnbHLH79转录因子的特征分析对金花茶 CnbHLH79 转录因子的蛋白质特征及保守结构域分析，结果显示金花茶 CnbHLH79 转录因子所编码蛋白的分子式为 C1294H2088N400O439S14，原子总数为 4 235，蛋白分子质量约为 30.72 kD，等电 点（pI）为 7.02。CnbHLH79 蛋 白 具 有 bHLH_AtBPE_like 保 守 结 构 域，它 的 起 止 氨 基 酸 位 点为 150-235 位，该 结 构 域 属 于 bHLH_SF 超 基 因家族（superfamily）（图 3-A），分析结果显示金花茶 CnbHLH79 蛋白具有植物 bHLH 转录因子的典型保守区域。此外，对金花茶 CnbHLH79 转录因子、拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtbHLH79 转录因子（AT5G62610.1）、茶树 CsbHLH79_like 转录因子（XP_028119408.1）、褐枝猕猴桃 ArBPEp 转录因子（GFS32687.1）的蛋白序列进行多序列比对发现，它们都具有相同的保守区域（图 3-B），其中近缘物种金花茶和茶树的 CnbHLH79 蛋白序列的相似性最高。CnbHLH79 蛋白含有影响蛋白质酸碱性的氨基酸共 66 个，其中呈碱性的氨基酸有 33 个，由 19 个精氨酸（Arg）、14 个赖氨酸（Lys）所组成，而呈酸性的氨基酸有 33 个，由 17 个天冬氨酸（Asp）、16 个谷氨酸（Glu）组成；CnbHLH79 蛋白的不稳定系数值（instability index）为 54.75，显示该蛋白为不稳定蛋白；CnbHLH79 蛋白的亲水指数（grand average of hydropathicity,GRAVY）为-0.662，显示该蛋白具有亲水性，而脂溶指数（aliphatic index）则为 64.26。利 用 Psipred 在 线 网 站（http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）预测 CnbHLH79 蛋白的二级结构域发现，该蛋白主要包含无规则卷曲（random coil）和-螺旋元件（-helix），这两种元件所占的比例分别为68.66%、31.33%，而-折叠元件、-转角等其他类型的元件则没有预测到。此外，利用 SWISS-MODEL对金花茶 CnbHLH79 蛋白进行三级结构预测发现，CnbHLH79 蛋白主要由 2 个-螺旋元件和 2 个无规图 2 金花茶 CnbHLH79 基因 cDNA 的 PCR 扩增Fig.2 PCR amplification of CnbHLH79 gene cDNA in C.nitidissima2023,39(8)245李博等：金花茶 CnbHLH79 转录因子的克隆、亚细胞定位及表达分析则卷曲元件组成，研究结果表明 CnbHLH79 蛋白的二级结构和三级结构的预测结果基本相符（图 4）。随后，利用 Plant-mPLoc 在线网站对 CnbHLH79 蛋白的亚细胞定位进行预测发现，CnbHLH79 蛋白定位在细胞核中的可能性较大。2.3 金花茶CnbHLH79蛋白的同源性比对及系统进化分析为解析金花茶 CnbHLH79 蛋白在植物系统进化中的关系，本研究通过 Blast 比对，获取了 17条与金花茶 CnbHLH79 蛋白同源性较高的蛋白序列（identity 65%），随 后 利 用 这 17 条 序 列 与ABA：蛋白功能结构域预测（bHLH_AtBPE_like：保守结构域；bHLH_SF：超基因家族）；B：氨基酸序列同源性比较；红色划线区域：bHLH_SF 基因家族保守结构域，bHLH79 蛋白在该区域的氨基酸序列高度保守；1 和 2：-螺旋元件；CnbHLH79：金花茶 bHLH79 转录因子；AtbHLH79：拟南芥 bHLH79 转录因子（AT5G62610.1）；CsbHLH79_like：茶树 bHLH79 转录因子（XP_028119408.1）；ArBPEp：褐枝猕猴桃 BPEp 转录因子（GFS32687.1）A:Protein functional domains prediction（bHLH_AtBPE_like:conserved domains;bHLH_SF:superfamily）.B:Homology comparison of putative amino acids sequence.The sequence underlined in red:conserved domains of bHLH_SF superfamily;conserved amino acids of bHLH_SF superfamily contained by bHLH79 protein;1 and 2:-helix;CnbHLH79:bHLH79 transcription factor of C.nitidissima;AtbHLH79:bHLH79 transcription factor of Arabidopsis thaliana（AT5G62610.1）;CsbHLH79_like:bHLH79 transcription factor of C.sinensis（XP_028119408.1）;ArBPEp:BPEp transcription factor of A.rufa（GFS32687.1）图 3 金花茶 CnbHLH79 蛋白功能结构域预测及氨基酸多重序列比对Fig.3 Prediting functional domain of protein CnbHLH79 and amino acid multiple sequence aligning in C.nitidissima图 4 金花茶 CnbHLH79 蛋白的三维结构预测Fig.4 Tertiary structure prediction of CnbHLH79 protein in C.nitidissima生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8246CnbHLH79 蛋白序列一起构建系统进化树（图 5）。分析结果表明，金花茶 CnbHLH79 蛋白与同为山茶科山茶属的茶树 bHLH79 蛋白的亲缘关系最近，它们在系统进化树中被聚类在一个小分支内。另外还发现金花茶 CnbHLH79 蛋白与高丛越橘（Vaccinium corymbosum）的 VcbHLH044 蛋白、中华猕猴桃（A.chinensis var.chinensis）的 AcbHLH79_like 蛋白、褐枝猕猴桃（A.rufa）的 ArBPEp 蛋白也具有较高的相似性，CnbHLH79 蛋白与这些蛋白亲缘关系较近，它们被聚类在同一个小簇中。而金花茶 CnbHLH79蛋白与灯笼辣椒（Capsicum baccatum）的 CbbHLH79蛋白、辣椒（Capsicum annuum）的 CabHLH_like89?Capsicum baccatum PHT47809.1_1-274?Capsicum annuum XP_047261660.1_1-276?Vitis vinifera XP_002267633.1_1-284?Vitis riparia XP_034673048.1_1-284 100?Juglans regia XP_018831619.1_1-278?Juglans microcarpa Juglans regia XP_040986641.1_1-278 87?Carya illinoinensis XP_042949152.1_1-277 100?Prunus mume XP_008239676.1_1-278?Prunus persica XP_007209455.1_1-278?Prunus pseudocerasus ALN42130.1_1-278 100100?Trema orientale PON93286.1_1-27956?Ziziphus jujuba var.spinosa XP_015882713.1_1-282 7293?Citrus sinensis XP_006476705.1_1-275 8689?Camellia sinensis XP_028119408.1_1-284?Camellia nitidissima CnbHLH79100?Vaccinium corymbosum AOY34415.1_1-273?Actinidia chinensis var.chinensis PSR89623.1_1-269?Actinidia rufa GFS32687.1_1-274 978464100图 5 金花茶 CnbHLH79 蛋白系统发生树Fig.5 Phylogenetic tree of protein CnbHLH79 in C.nitidissima 蛋白的亲缘关系最远。2.4 金花茶CnbHLH79转录因子的亚细胞定位验证Plant-mPLoc 在 线 预 测 结 果 显 示，金 花 茶CnbHLH79 蛋白定位于细胞核中，为了验证上述预测结果，构建获得了 pEGOEP35S-H-CnbHLH79-GFP载体表达载体，通过农杆菌介导的烟草叶片下表皮细胞瞬时转化实验，分析金花茶 CnbHLH79 蛋白在细胞中的定位情况。目标蛋白主要使表皮细胞的细胞核发出绿色荧光，且在细胞核中与红色荧光染料（SV40 NLS）共定位，实验结果（图 6）显示，CnbHLH79-GFP 蛋白定位于细胞核中，表明该转录因子主要在细胞核中发挥功能。2.5 金花茶CnbHLH79的表达分析及相关性分析通过对金花茶 CnbHLH79 转录因子的荧光定量 PCR 分析发现，该转录因子主要在金花茶的根和花中高表达，而在茎和叶中的表达量则相对较低（图 7）。此外，还发现在不同开花阶段的花瓣中，CnbHLH79 转录因子的表达总体呈现先高后低，逐步下降的趋势，在幼蕾期、初蕾期的表达量较高，在半开期、盛开期的表达量较低（图 8）。将开花过程中 CnbHLH79 在花瓣中的表达量与金花茶的色相 b*值、槲皮素-7-O-葡糖苷、槲皮素-3-O-葡糖苷、槲皮素、山奈酚等类黄酮物质含量的 Pearson 相关性分析，结果表明，CnbHLH79 的表达量与色相 b*值、槲皮素-7-O-葡糖苷的负相关性较高，其相关性系数分别为-0.92、-0.7（图 9）。3 讨论3.1 CnbHLH79转录因子对金花茶花色形成的调控作用分析bHLH 基因家族作为植物第二大转录因子家族，在类黄酮代谢、逆境胁迫响应、植物生长发育等方面发挥了重要的调控作用23-25。例如，玉米（Zea 2023,39(8)247李博等：金花茶 CnbHLH79 转录因子的克隆、亚细胞定位及表达分析mays）中 bHLH 转录因子 B-peru 和拟南芥 mPAP1 基因能协同作用，可增加番茄（Solanum lycopersicum）花瓣中类黄酮化合物的含量，使花瓣颜色变深26；荷 花（Nelumbo nucifera）中 的 bHLH 转 录 因 子NnTT8 具有调节花青素和原花青素合成的功能，该基因可改变转基因拟南芥的种皮颜色27；石斛杂交种（Dendrobium hybrids）的 DhbHLH1 转录因子可与DhMYB2 共同作用，使石斛杂交种的白色花瓣生成紫色斑点28；并且这些基因在它们发挥功能的部位都具有较高的表达量。金花茶 CnbHLH79 转录因子在不同组织中的荧光定量分析结果表明，CnbHLH79转录因子在金花茶根和花中的表达量较高，由此推断该转录因子主要在这两个组织中发挥作用。另外，还发现在金花茶开花过程中 CnbHLH79 转录因子在花瓣中的表达总体呈先高后低的下降趋势，所以 CnbHLH79 转录因子可能在开花过程的早期具有调控的作用。Liu 等29在对金花茶全长转录组的研究中通过 WGCNA 分析发现，CnbHLH79 转录因子图 6 CnbHLH79 蛋白的亚细胞定位Fig.6 Subcellular localization of the protein CnbHLH79（Bar=50 m）0123?Relative expression?Root?Stem?Leaf?Flower*代表茎、叶、花的表达量相对于根，差异极显著（P0.01）；内参基因：18S rRNA；n=3*indicates extremely significant difference in the expression of stem,leave and flower compared with root（P0.01）.Reference gene:18S rRNA;n=3图 7 CnbHLH79 在不同组织中的基因表达量Fig.7 Relative expressions of CnbHLH79 in different culture*0.02.55.07.5ABCDE?Relative expressionnsA：幼蕾期；B：初蕾期；C：显色期；D：半开期；E：盛开期；*代表 C、D、E 的表达量相对于 A，差异极显著（P0.001）；ns 代表没有显著区别；内参基因：18S rRNA；n=3A:Young bud;B:early bud;C:chromogenic stages of flowering;D:the half-opening stage;E:blooming stage.*indicates the expressions of C,D,and E shows extremely significant difference compared with that of A（P0.001）.ns means no significant difference.Reference gene:18S rRNA;n=3图 8 CnbHLH79 转录因子在不同开花时期的表达量Fig.8 Expressions of CnbHLH79 at different flowering stages生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8248与类黄酮合成通路中的结构基因 PAL（phenylalanine ammonia-lyase）存在于一个共同的调控网络中，且CnbHLH79 转录因子与该网络的核心基因 PAL 具有较高的关联度，CnbHLH79 转录因子可能通过调控PAL 的表达来调节金花茶花瓣中类黄酮物质的合成。此外，已有研究表明金花茶花瓣中的槲皮素-7-O-葡糖苷（Qu7G）、槲皮素-3-O-葡糖苷（Qu3G）是影响金花茶花色形成的关键化合物30，色相 b*是金花茶花色描述的主要指标31。本课题组在之前的研究中发现，CnbHLH79 转录因子在花瓣发育过程中的表达量，与苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）、查尔酮合成酶（chalconesynthase,CHS）、二氢黄酮醇-4-还原酶（difunctional dihydroflavonol 4-reductase/flavanone 4-reductase,DFR）、黄酮醇合成酶（flavonol synthase,FLS）等类黄酮合成途径的结构基因的表达量，具有较强的相关性；且在本研究中通过相关性分析发现，CnbHLH79 转录因子的表达量与金花茶花瓣的花色指标（色度 b*值）、类黄酮物质含量，例如槲皮素-7-O-葡糖苷（Qu7G），具有较强的负相关性，因此推断 CnbHLH79 基因对于金花茶花色的形成以及类黄酮物质的合成，可能具有负调控的功能。3.2 CnbHLH79转录因子对冷胁迫的作用分析类黄酮化合物是植物中广泛存在的一类次生代谢物质，它可以提高植物对逆境的适应能力32。类黄酮化合物主要通过防止活性氧的产生以及清除已生成的活性氧，来完成其抗氧化功能，进而提高植物的适应性33-34。例如，在低温条件下，类黄酮化合物在苹果中会大量积累，从而提高苹果对低温逆境的适应能力35。此外，已有研究发现 bHLH79 转录因子具有提高植物适应冷胁迫的功能，例如在冷胁迫环境中，茶树 CsbHLH79 转录因子的表达量会显著提高36。CabHLH79 通过调控 CaNAC035 的表 达，进 而 增 强 活 性 氧 簇（reactive oxygen species,ROS）相关基因及冷耐受基因的表达，从而提高辣椒对冷胁迫的适应性37。金花茶主要在冬季开花，不同开花过程的花瓣中 CnbHLH79 转录因子在低温环境中存在差异表达现象，并且该转录因子的表达量与槲皮素、槲皮素-7-O-葡糖苷等物质的相关性较强，因此在金花茶中可能存在着通过 CnbHLH