DNA指纹图谱技术.doc

DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用
pace等于1986年首次利用rrna基因确定环境样品中的微生物，通过对5s rrna基因的序列分析来研究微生物的生态和进化。该方法很快被用于微生物多样性研究领域。由于5s rrna基因相对较小，携带信息相对较少，因而揭示微生物群落多样性的能力有限。相比之下，随后开展的16s rrna基因序列分析为微生物多样性研究提供了更多信息，且效率更高。目前16s rrna基因序列分析已广泛应用于微生物多样性的研究。16s rrna基因序列分析是主要基于已建立的微生物16s rrna基因序列数据库，用以确定细菌的系统发育关系，并使序列探针用于识别未知菌成为可能。当然序列探针的确定也可根据分子标记方法，如rapd方法进行。利用16s rrna基因序列研究微生物多样性可采用不同的策略。目前一般常用以下几种方法。
一、变性梯度凝胶电泳（dgge）和温度梯度凝胶电泳（tgge ）
1993年muyzer等将dgge技术引入环境微生物学多样性的研究。随后该技术被广泛用于比较不同生态系统中的微生物群落的多样性及监测特定微生物种群的动态变化，dgge和tgge的原理是根据含有不同序列的dna片段（16s rrna基因扩增产物）在具有变性剂梯度或温度梯度的凝胶上由于其解链行为的不同而导致迁移率的不同，部分解链的dna片段在凝胶中的迁移速率低于完全螺旋形式的dna分子，从而含有不同碱基序列的dna片段就得到有效分离。结合pcr扩增标记基因或其转录物（rrna和mrna）的dgge方法能直接显示微生物群落中优势组成成分。由于它可同时对多个样品进行分析，使之非常适合研究微生物群落的时空变化，而且可以通过对酶切条带进行序列分析，或通过与独特的探针杂交鉴定群落组成，可以方便地了解环境被干扰后的微生物群落变化或某种指示微生物的命运。oliver等用dgge方法考察了农田微生物的变化情况，认为环境变化对农田微生物的多样性有很大影响。但是dgge/tgge技术也存在一定的局限性。
其缺陷之一是只能分离约500 bp大小的dna片段，这限制了作为下一步用于杂交分析的探针设计。并且研究报道有些种类细菌16s rdna在dgge上不只显示1条带，而不同种细菌的16s rdna序列在dgge上也可能因为具有相同的解链行为而不能被分开。即便存在以上的一些局限性，dgge/tgge仍是分析微生物群落多样性较为敏感的方法之一。
二、单链构象多态性（sscp）
sscp是对16s rrna基因扩增产物进行分析的另一种简便有效的方法。该技术最初用来检测人类dna的基因多态性，lee等在1996年首次报道将sscp技术应用到环境样品微生物群体多样性分析。不同碱基序列的单链dna分子构象不同，dna片段变性成单链后受到凝胶不同分子筛作用力最终使不同dna片段得到分离。电泳结束后可以将不同的条带切下并测序，或采用特异性探针进行杂交，进而显示该特定微生物类群的动态变化。holly等利用sscp技术研究发现在植物根际土壤中大量存在古菌crenarchaeot，该类微生物以往一直被认为只存在于极端嗜热环境当中。但是sscp技术重现性较差，易受胶浓度和电泳温度等条件的影响。另外，sscp能够有效分离的dna序列过短，为150-400 bp。
三、随机引物扩增多态性dna（rapd ）
由williams建立的rapd技术，因具有操作简便、快速和经济等优点而得到了广泛应用。该技术以随机寡核苷酸（5-10 nt）作为引物，扩增得到的多态性片段较短，更方便检测两个同源或异源等位基因的有无，适用于种内和亚种更为细致的分类。张峦等在室内培养条件下，采用rapd分子标记技术研究了重金属镉和多环芳烃菲复合污染对土壤中微生物群落dna序列多样性的影响。结果表明，培养15 d和30 d后，镉-菲单一和复合污染均导致土壤微生物群落dna序列的丰度、均度和多样性指数增加。重复性不好是该技术存在的主要问题，而dna模板的质量与数量、mgcl2和引物浓度的变化都有可能导致得到不同的图谱。另外，从条带图谱中无法得到任何微生物系统发育信息。
四、限制性片段长度多态性（rflp ） 和扩增核糖体dna
限制性分析rflp方法和ardra方法也常用于微生物群落的分析。通常用引物pcr扩增得到16s rdna片段，被限制酶切割，然后再进行电泳形成不同长度的片断进行分析。其所获得的谱带更为简单，易于分析，不受菌株是否纯培养的限制，不受宿主的干扰，具有特异性强，效率高的特点。广泛应用于新物种的发现、微生物分类及鉴定、共生菌、病原菌的微生物遗传多样性的检测等。后来有人利用ardra方法考察两种不同农田土壤的微生物群落时，发现两者无显著差异。张于光等利用rflp方法对三江源地区不同的植物类型的土壤中固氮微生物群组成进行了研究，发现所有土壤样品中分别具有1-2个优势微生物种群。但是该技术所能获得的信息量相对较少，并且难以用来评估物种的丰度和均度。
五、末端限制性片段长度多态性（t-rflp ）
t-rflp是rflp/ardra方法的进一步发展，所不同的是在pcr扩增16s rrna基因过程中，其中一个引物用荧光标记，在计算机程序自动分析时仅分析荧光标记的末端限制片段，这样使得限制片段长度多态性图谱更为简化，并且每个可见的条带都代表一个“核型”或一个分类单元。此法能够得到一个群落的特征指纹图谱，可用于比较不同群落的相似性和由于污染造成的群落结构在时间和空间上的改变。pett等利用t-rflp技术考察氧化还原电位对土壤菌群的影响，研究发现经过4 d的好氧/厌氧处理与未处理的土壤样品菌群结构相似，而经过持续12 h的厌氧或好氧处理的土壤样品得到的分子条带则明显不同，在所有样品的179种条带图谱中只有3种是普遍存在的，同时还发现土著菌群对氧化还原电位的变化具有耐受性。catherine等对t-rflp方法进行了完善，采用多个限制性酶代替单一限制性酶更有利于排除选择酶的干扰，通过叠加靶基因酶切位点，使待定鉴定种属在数据库中匹配度提高。为得到较精确的结果，可以在产生图谱的同时，对分析样品创建克隆、测序鉴定，但所需费用较高。