两个菜心CBL基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析.pdf

山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()广东省自然科学基金项目()韶关市科技攻关项目()韶关学院博士科研启动项目()作者简介:朱云娜()女博士讲师主要从事蔬菜生理与分子生物学研究工作:.通信作者:刘建国()男博士研究生助理实验师主要从事园艺生理生态研究工作:.两个菜心 基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析朱云娜符质冯慧敏王斌沈雪晴汤婉君刘建国(.广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室广东 韶关.韶关学院英东生物与农业学院广东 韶关)摘要:本研究以油绿 菜心(.)为材料采用同源克隆方法对其、基因进行克隆运用 和 软件对其编码蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析并利用 技术分析二者在菜心组织中及不同氮素形态条件下的表达模式 结果表明:菜心、基因的 全长均为 编码 个氨基酸分别命名为 和 具有 蛋白结合 所必需的 型结构域()、编码的氨基酸序列与拟南芥()、大白菜()等物种的同源性均达 以上二者分别与大白菜的、遗传距离最近并与拟南芥、共同聚类为一支 和 在菜心各组织器官中均有表达前者在菜心叶片中表达水平较高后者在菜心荚果等组织中表达水平较高两者表达受氮素形态及水平影响前者在低浓度 或 处理后上调表达后者表达随 浓度增加而上调表达 该研究结果可为进一步研究菜心 和 在氮素吸收利用过程中的功能及其调控机制提供一定理论基础关键词:菜心氮素形态类钙调磷酸酶 亚基蛋白基因克隆生物信息学分析表达分析中图分类号:.:文献标识号:文章编号:()(.)(.).().钙作为第二信使在植物信号转导中具有重要调控作用 钙调蛋白()、类钙调蛋白()、类钙调磷酸酶 亚基蛋白()和钙依赖型蛋白激酶()是植物体内常见的钙感受器种类 除 中含有蛋白激酶结构域外其他 个钙感受器都不含激酶结构域必须与靶蛋白结合形成复合体才能传递钙信号 起源于绿藻和苔藓现广泛存在于被子植物和裸子植物中是一种古老的钙感受器具有典型的结合 结构域 手臂()类钙调磷酸酶 亚基蛋白激酶()是 特异结合的蛋白激酶通过形成 复合体参与调控植物生长发育和非生物胁迫响应 不同植物 成员数量不同拟南芥、烟草、黄瓜、大白菜中分别有、个 成员植物 参与种子发芽、花粉管萌发等生长发育过程也参与响应高盐、低温、干旱等逆境胁迫 在调控矿质营养转运蛋白方面具有重要作用 低钾胁迫下/可将 定位到质膜使其通过磷酸化激活钾离子通道蛋白()从而增加拟南芥细胞对的吸收 近年来的研究表明水稻早期氮响应因子在蛋白质磷酸化等方面富集而氮转运蛋白活性也依赖于外界氮信号所触发的磷酸化因此蛋白磷酸化在氮信号传导、氮代谢方面发挥重要作用 如:复合体通过调控氮转运蛋白磷酸化水平调控拟南芥氮信号通路/通过磷酸化修饰调控拟南芥硝态氮转运蛋白(.)亲和性的转变以适应不同浓度硝酸盐()条 件 下 对 的 吸 收 在 高 铵()胁迫下 可调控铵态氮转运蛋白().和.的磷酸化使其失去活性避免吸收过量 我们最近研究发现菜心铵转运蛋白 可与 互作菜心 表达受氮素水平和氮素形态的影响(待发表)不同 可能参与同一种非生物胁迫相同 可能参与不同非生物胁迫响应 为此本文选择可与 互作的、为研究对象采用同源克隆法获得菜心 和 的全长序列并分析其生物学特性、组织表达特性以及对不同氮素形态的响应以期为提高菜心氮素吸收利用的作用机理研究提供一定的理论支撑 材料与方法.试验材料及样品处理供试菜心(.)品种为油绿(由广州市农业科学研究院选育)于 年 月在广东省韶关市韶关学院英东生物与农业学院生态园玻璃温室内培养 将菜心种子用.的 消毒 用无菌水清洗 次然后播种于海绵块上进行育苗待幼苗长至三叶一心时移植到改良霍格兰营养液中进行培养 之后根据不同 山 东 农 业 科 学 第 卷试验要求进行处理、取样.基因表达组织特异性分析的样品采集菜心幼苗移栽后生长 待角果结荚后分别取根、茎、叶、花、叶柄、荚果、花蕾、薹茎等组织样品用于基因表达的组织特异性分析 每个样品设 个生物学重复每重复取 株液氮速冻后保存在冰箱中备用.不同水平氮素处理试验的样品处理菜心移苗后在 个剂量的改良霍格兰营养液中培养 取出用蒸馏水冲洗根部然后转移到缺氮营养液中再培养 将菜心苗分苗移栽到、/营养液中处理 分别对叶片和根系进行取样每个样品设 个生物学重复每重复取 株液氮速冻后置于冰箱保存备用.总 提取及 合成采用 植物总 提取试剂盒普洛麦格(北京)生物技术有限公司 提取总采用 试剂盒宝生物工程(大连)有限公司反转录合成.菜心 基因克隆在 数据库(:/./.)查找拟南芥()、的基因序列然后在大白菜()基因组进行 比对得到与其同源性最高的 (.)、(.)基因序列 菜心是大白菜的一个 变 种 亲 缘 关 系 较 近 因 此 根 据 大 白 菜、基因序列设计同源引物用于克隆菜心相应的基因 利用 .软件设计引物引物序列见表 设置 反应体系:模板链 上下游引物各 加 补充至 反应程序:预变性 个循环延伸 回收扩增产物连接到 载体并转化大肠杆菌 感受态细胞将经 鉴定的阳性克隆送广州擎科生物技术有限公司测序.生物信息学分析利用表 所列软件对菜心、基因编码蛋白及其氨基酸序列进行分析 表 所用引物及其序列引物序列()用途:基因克隆:荧光定量:荧光定量 内参 表 所用软件及其网址软件网址用途:/./蛋白质理化特性分析:/./蛋白疏水性分析.:/./.:/./.?蛋白亚细胞定位 .:/./.?.蛋白质跨膜结构分析.:/./磷酸化位点分析.:/./.?.蛋白质信号肽预测:/./蛋白质二级结构分析:/./蛋白质三维结构预测:/./保守结构域分析:/./蛋白互作分析.基因表达量的 分析按照.中的方法提取菜心样品的 并反转录为 样品用 稀释 倍后作为模板利用 进行荧光定量 分析 扩增体系:/上下游引物各.模板 用 补充到.扩增程序:预变性 循环 次 以 和 为内参基因用 计算基因相对表达量.数据统计分析与作图用 整理数据用.进行统计分析用 法进行显著性分析用 .作图 结果与分析.菜心、基因的克隆以菜心叶片 为模板用、第 期 朱云娜等:两个菜心 基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析 和、引物进行 扩增均获得约 的基因片段(图)经测序克隆得到的基因片段长度均为 通过 在线比对菜心 基因片段与拟南芥的(.)、甘蓝型油菜()的(.)、大白菜的(.)的核苷酸序列同源性分别为.、.、.而菜心 基因片段与 (.)、(.)、(.)的核苷酸序列同源性分别为.、.、.初步表明所克隆的两个基因片段分别为菜心、基因序列 将这两个基因分别命名为、:基因扩增条带:基因扩增条带图 菜心、基因的 扩增图谱.、的氨基酸序列分析利 用 和 对、编码蛋白序列进行分析结果显示 编码 个氨基酸分子量为.原子组成为 理论等电点()为.平均疏水率为.脂肪酸系数为.不稳定系数为.编码 个氨基酸分子量为.原子组成为 为.平均疏水率为.脂肪酸系数为.不稳定系数为.、均为可溶性亲水蛋白 通过 .预测分析发现二者均无信号肽序列为非分泌型蛋白、均有多个丝氨酸磷酸位点()和苏氨酸磷酸位点()利用.和.预测、亚细胞定位均定位于细胞膜上 .分析结果表明二者均无跨膜结构.和 的二、三级结构分析运用 的 对、蛋白的二级结构进行预测分析结果(图)显示 蛋白含有 螺旋().、折叠延伸链().、转角().、无 规 则 卷 曲().而 蛋白的 螺旋、折叠延伸链、转角、无规则卷曲分别为.、.、.、.可见两者的主要组成部分均为 螺旋折叠延伸链、转角、无规则卷曲则散布于蛋白结构中 三级结构预测结果与该结果一致 另外 蛋白三级结构为单体结构而 蛋白三级结构为二聚体结构(图).、氨基酸序列同源性比对及系统进化分析将、与(.)、(.)、(.)、(.)进行氨基酸序列多重比对分析结果(图)显示、与两个物种、的氨基酸相似性介于.其 中 与 相 似 性 高 达 与 相似性为.蓝色代表 螺旋绿色代表 转角紫色代表 折叠延伸链红色代表无规则卷曲图 和 蛋白二级结构预测 山 东 农 业 科 学 第 卷图、蛋白三级结构预测图 菜心、拟南芥、大白菜、氨基酸序列多重比对结果 利用 在线工具对两个菜心 基因编码氨基酸进行保守结构域分析结果(图)表明、均具有 蛋白结合 所必需的 型结构域()保守结构域均为 个且位置相同位于第、位氨基酸()和()()和 ()()和()图 、保守结构域分析进化树分析结果(图)表明与图 、与拟南芥、大白菜 的进化树分析 第 期 朱云娜等:两个菜心 基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析亲缘关系最近 与 亲缘关系最近其次分别为 和 且菜心、大白菜、拟南芥的 与 同聚类在一个分支而与拟南芥、大白菜的其他 成员相距较远进一步表明本研究分离得到的 个菜心 基因属于植物 基因家族成员编码类钙调磷酸酶 亚基蛋白.、在菜心不同器官中的表达分析由图 可知 和 在菜心根、茎、叶、叶柄、薹茎、花蕾、花、荚果中均有表达 在菜心叶中表达量最高显著高于其他器官其次为根、茎在叶柄、薹茎、花蕾、花、荚果中表达量相对较低且器官间无显著差异 在菜心荚果中表达量最高其次为薹茎两者间差异显著且均显著高于其他器官在叶、叶柄、花、根、茎中表达量相对较低在花蕾中的表达量最低显著低于其他器官仅为荚果中表达量的.两个基因均以菜心根系中 的相对表达量为 进行比较分析 不同小写字母表示在.水平上差异显著下同图 ()和()在菜心不同器官中的表达分析.和 对不同氮素形态的响应由图 可知、表达量受氮素形态及其水平影响二者表现出不同的表达模式 在低浓度氮条件表达量较高表达量有随氮浓度增加而明显下降的趋势在 /(或)条件下菜心根和叶中的 表达量也较高为 /(或)条件下的.表达还受不同氮素形态影响在相同浓度条件下处理的菜心根中 表达量最高处理的次之处理的最低(图)在菜心叶中 表达也呈现出与根中类似的变化规律(图)由图 看出在菜心根中 表达量随着 浓度增加显著增加/处理下最高分别是中、低浓度 处理下的.倍和.倍而在 和 处理下随其浓度增加 表达量均呈现出先下降后上升的趋势且不同浓度处理间差异显著但表达量最高值分别出现在低浓度和高浓度处理时 在菜心叶中(图)表达水平随 浓度增加而降低中、高浓度处理间表达量差异不显著但显著低于低浓度处理在 和 处理下 表达水平随浓度的变化趋势与根系中相似但变化幅度略小其中中浓度与高浓度 处理间、低浓度与高浓度 处理间差异不显著此外与 相比无论在菜心根还是叶中 均保持较高的表达水平暗示两基因可能在氮素吸收利用方面发挥着不同作用.、蛋白互作关系在 交互式数据库中输入、蛋白序列选择“拟南芥”为所属物种利用拟南芥蛋白构建互作关系网络据此推测、的互作蛋白 由图 推测可知 蛋白与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(、)、钾离子通道蛋白 具有互作关系而 蛋白也可与 和 家族蛋白互作但其互作网络中未包含 和 此外菜心 还可与免疫亲和蛋白()和 蛋白互作 山 东 农 业 科 学 第 卷横坐标的、分别代表、分别指 种浓度处理单位均为/两个基因均以 /处理的菜心根系 表达量为 进行比较分析图 (、)和(、)对不同氮素形态的响应图 ()和()蛋白的互作网络 讨论与结论本研究从菜心中克隆到两个完整的 基因 、开放阅读框均为 均编码 个氨基酸残基、蛋白均具有 蛋白结合 所必需的 结构域与大白菜、拟南芥、的氨基酸序列同源性均在 以上聚类于同一进化分支但与其他 成员的遗传距离较远、编码蛋白均为稳定性蛋白具有较强的亲水性定位于细胞质膜上无跨膜结构无信号肽与拟南芥、和唐古特白刺 的定位结果一致 定位于质膜上表明其可能通过结合膜蛋白在细胞中发挥作用 和 蛋白结构的主要组成部分均为 螺旋散布 折叠延伸链、转角、无规则 第 期 朱云娜等:两个菜心 基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析卷曲然而 为单体结构 蛋白为二聚体结构暗示两者可能发挥着不同的生物学功能基因在不同组织中的表达特性可能暗示其在相应表达部位的生物学功能 在已研究的植物中多数 在各个组织或器官中具有不同程度表达在某些组织中具有表达优势 本研究结果表明 和 在菜心根、茎、叶、叶柄、薹茎、花蕾、花、荚果中均有表达其中 在叶中的表达量远高于在其他组织中而 在荚果中的表达量显著高于在其他组织中暗示两基因可能分别主要在菜心叶和荚果生长发育过程中发挥作用研究报道/可与 形成 复合体参与拟南芥氮信号通路调控并可响应低温、高盐、干旱、低钾等多种逆境胁迫在植物生长发育过程和非生物胁迫中具有重要作用 本研究结果表明、确实可响应外界氮素变化二者的表达水平不仅受不同氮素形态影响也受氮素水平影响但二者呈现出不同的变化趋势 其中 在低浓度(/)单一氮源(或)条件上调表达而在中(/)、高浓度(/)或混合氮源()条件下调表达甚至不表达在低浓度 条件下表达量低在中、高浓度 条件下表达量高而在 和 处理时 在低/高氮浓度下表达水平较高在中等浓度下表达量较低 这与/受低浓度 诱导上调表达而在高浓度 时下调表达的 结 论 一 致 报 道 拟 南 芥 表达依赖于 缺氮后恢复供/可诱导其表达供 时 表达量达到峰值随后开始下降而 表达量在供 后才开始增加随后基本无明显变化 本研究主要对供不同浓度不同形态氮素 后、基因在菜心中的表达情况进行分析并未比较不同供氮时间对二者表达量的影响可在今后研究中增加该项目通过 交互式数据库利用拟南芥、蛋白构建互作蛋白网络据此推测菜心的 与、等 家族成员及钾离子通 道 蛋 白 互 作 而 虽 可 与、互作但 成员不包含 和 此 外 还 可 与 和 蛋 白 互 作 数 据 库 对 蛋白注释为含有蛋白磷酸酶 和环核苷酸结合/激酶结构域蛋白参与调控蛋白质磷酸化/受低浓度 诱导表达促进其与 形成复合体以调控.磷酸化水平 从 而 促 进 运 输 在 拟 南 芥 中 与 形成 复合体参与调控.和.蛋白磷酸化水平从而调控拟南芥根系对 的吸收而 并未参与调控 本研究发现菜心 和 表达均受不同氮素形态和氮素水平影响二者在不同氮素形态下如何调控氮素吸收利用是否存在功能冗余现象仍需进一步研究综上本研究分离得到的、基因属于菜心 基因家族成员具有组织表达特异性受氮素不同形态不同水平影响但两者表达模式不同可能参与调控不同氮素条件下的氮吸收与利用过程具体作用机制还需进一步探究在今后研究中可将氮素供应时间进一步细化观察、基因在不同供氮时间下的表达模式再利用 对基因进行沉默验证其功能 本研究结果可对进一步探究菜心氮素吸收利用分子机制提供一定的理论依据参 考 文 献:张传鹏 戴绍军 魏建华 等.家族在植物逆境胁迫响应和生长发育中的作用.现代农业科技 :.():.曾后清 张夏俊 张亚仙等.植物类钙调素生理功能的研究进展.中国科学:生命科学 ():.马瑞 李世贵 刘维刚 等.植物 信号系统的功能及其响应非生物胁迫作用机制研究进展.植物生理学报 ():.王海波 李芙蓉 杨金翠 等.信号系统参与小桐子抗冷性形成的生物信息学分析.广西植物():.山 东 农 业 科 学 第 卷:.():.:.():.曾文艺 周思如 左同鸿 等.普通烟草 基因家族全基因组鉴定与分析/.分子植物育种.:.曹齐卫 刘明毓 陈伟 等.黄瓜 基因的鉴定和特征分析.核农学报 ():.李利斌 王殿峰 刘立锋 等.大白菜 家族基因的鉴定和遗传进化分析.山东农业科学 :.黎梦娟 朱礼明 霍俊男 等.唐古特白刺、基因克隆及表达分析.南京林业大学学报(自然科学版)():.张俊文 魏建华 王宏芝 等.信号系统在植物应答逆境胁迫中的作用与机制.自然科学进展():.():.:.():.():.():.:.:.():.():.:.():.():.朱云娜.菜心 在铵硝营中调控铵吸收的作用机理研究.广州:华南农业大学.():.().:.翟莹 邱爽 张军 等.大豆中 个 转录因子的生物信息学及表达分析.华北农学报 ():.第 期 朱云娜等:两个菜心 基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析