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实验4 果汁中的果胶和果胶酶
相关知识及原理：
果胶是植物细胞壁的主要成分。果胶酶是指分解果胶酶物质的多种酶的总称，可分解聚酶和果胶酯酶。果胶不溶于酒精，工业生产果胶时常用95%的酒精沉淀果胶，酒精浓度加到50%—55%即可。 果胶酶可提高果汁出汁率，还可促进果汁的澄清，刚压榨出来的果汁粘度大，常会形成果汁分层、浑浊，在过滤时又容易堵塞过滤设备。添加果胶酶澄清处理后，果汁的粘度迅速下降，使引起果汁浑浊的粒子迅速凝聚下沉，所得的果汁易于过滤和澄清。
在应用果胶酶处理苹果汁时，要注意pH值、温度、作用时间、酶的用量等对处理效果均有影响。果胶酶的使用温度为10—50℃，在温度能够保证酶不失活的情况下，适当提高温度，可以提高澄清效果，缩短澄清时间。
实验目的：了解果胶酶对果汁形成的作用，95%的酒精沉淀果胶。
实验仪器及用具：
组织捣碎机、烧杯、电热恒温热水浴锅、试管、点样板、电子天平、微量可调移液器或吸管
实验材料和试剂：
苹果、2%果胶酶、95%乙醇。
实验步骤：
1、 将苹果洗净，去柄，并切成小块，放入高速组织捣碎机或榨汁机中榨汁，至苹果成匀浆状态。
2、 将捣碎的苹果浆倒入烧杯中，用纱布过滤苹果汁；
3、 观察果胶酶的作用：取2支试管，分别加入4mL苹果汁，并编号为试管1和试管2，向1号试管中加入1mL蒸馏水作对对照，向试管2中加入1mL2%果胶酶溶液振荡混匀；
4、 将试管1和2放入45℃水浴锅中10分钟；观察实验有无分层现象；
5、 然后同时过滤到另外2支试管中，观察实验现象；
6、 沉淀果胶：取点样板，编号点样孔1和2，
点样孔1：0.5ml苹果汁+0.5ml的水作对照，混匀；
点样孔2：0.5ml苹果汁+0.5ml的95%乙醇混匀； 2分钟后观察现象；
试管1：（4ml苹果汁+1ml水）
试管2：（4ml苹果汁+1ml果胶酶）
不分层，过滤后出汁率比试管2低的多
分层，果汁出汁率高
点样孔1（0.5ml苹果汁+0.5ml水）
点样孔2（0.5ml苹果汁+0.5ml乙醇）
无变化
产生絮状沉淀
7、 观察实验现象并填写下表（实验结果参考）。

实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
实验原理：
酶在水溶液中很不稳定，不利于工业化使用。固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。将固定化酶装柱时，在酶的作用下转变为产物。
本实验是用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶催化后，可使淀粉水解成糊精。流出液用淀粉指示液测试，呈红色，表明水解产物糊精产生。
α-淀粉酶 β-淀粉酶 糖化淀粉酶
淀粉—————→ 糊精—————→麦芽糖———→葡萄糖
实验目的：
⑴ 制备固定化ɑ-淀粉酶；⑵ 进行淀粉水解酶的测定；
实验材料和试剂：
α-淀粉酶、 0.5%淀粉、石英砂、5mmol/L KI-I2溶液。
实验步骤：
1. 用50ml小烧杯称取5g石英砂，加入4ml α–淀粉酶，缓慢搅拌15分钟，使α–淀粉酶固定到石英砂上；
2. 用10～15ml的蒸馏水清洗石英砂2-3次，最后一次清洗时取其上清滴加到点样板上，同时滴加1%淀粉溶液充分混匀，再加入KI-I2溶液，若溶液变为蓝色，说明游离的α–淀粉酶已完全除去；
3. 先把滤纸片放入层析柱（针管注射器）中，再装入固定有α–淀粉酶的石英砂；
4. 将灌注了固定化酶的层析柱放在支架上，用滴管加0.5% 淀粉溶液，使淀粉溶液约以1滴/6s的流速过柱。
5. 在流出2mL反应液后,接收约0.5mL流出液，加入1-2滴KI-I2溶液，观察颜色。
6. 用水稀释淀粉滤液1倍后再观察颜色并填写下表。
7. 实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此固定化柱，放置在4℃冰箱中，几天后再重复上述实验，看是否有相同的结果。
8. 观察颜色反应并填写下表。
样品
水
0.5%淀粉
层析柱淀粉滤液
2滴 KI-I2溶液
结果
①空白对照
+
-
-
+

②样品1
-
+
-
+

③样品2
-
-
+
+

④样品3
-
-
+
+

苹果酒的制作

　　苹果酒是以苹果为原料经破碎、压榨、低温发酵、陈酿老熟而成的国际通行的果酒。
　　苹果酒是世界第二大果酒，流行于欧、美、澳等国家，是国际饮料酒市场的一大热点。苹果酒中含有25种氨基酸，其中有8种是人体不能合成的；还含有促进人体发育及治疗和预防疾病的维生素(维生素B12、维生素C和肌醇等)。苹果酒中含有的以苹果酸为主的有机酸，有助于除去人体内引起动脉硬化和尿石症的多余盐类；苹果酒还有软化血管，降低血脂和开胃的功效；尤其是苹果酒中含有的脂肪燃烧剂———丙酮酸，可以起到消耗脂肪的作用，适量的丙酮酸浓度可以使人体达到供需平衡和胖瘦适宜的状态，长期饮用，不失为健身、减肥的好方法。随着苹果和苹果酒的营养与功能特性逐渐被人们了解和认识，为苹果酒产业提供了一个很好的发展环境，10年间，世界苹果酒的市场规模翻了一番，总产量达17亿升。我国苹果酒产业起步晚，目前只有几家公司生产，技术上大多采用葡萄酒酿酒酵母和酿造工艺生产苹果酒，掩盖了苹果酒的特色，因此，开发优质的苹果酒是当务之急。
苹果酒的简单制作工艺
1、 原料选择：选择无销售价值的残、次、落果或罐头加工剩下的下脚料甚至烂果作原料。
2、 清洗：首先将苹果放入1%至2%稀盐酸溶液中浸洗，去除农药污染。然后用清水冲刷洗净，彻底清除泥土、杂物等，烂果尽量除去腐烂部分，最后取出晾干。
3、 破碎：将清洗并晾干的苹果送入打浆机中粉碎。
4、 榨汁：将破碎后的苹果块、汁液等放入陶瓷缸中静置10至12小时。然后用每平方厘米26公斤的压力压榨，可得果浆，最后用消过毒的纱布过滤得到果浆。
5、 调液：取得果汁后立即通入适量的二氧化硫气体，使其在果汁中的浓度达到75ppm，然后调整果汁的糖、酸含量分别为10%至14%和0.4%至0.6%。
6、 接曲发酵：按质量比10%接种酒曲(或酒糟、酵母液等)，然后在环境温度280℃至320℃下发酵。数小时后即能听到类似蚕食桑叶般的沙沙声，同时可见果汁表面泛起泡沫。完成发酵过程至少需2周以上时间。发酵结束后，液体上部澄清无渣，闻之有酒香味，此时酒精含量一般能达到10%左右。最后将上部清液倒入贮桶中进行后发酵，此过程大约需一个月的时间。后发酵结束后再通入二氧化硫气体使其含量达100ppm，能有效防腐。
7、 陈酿：首先要在半月之内将入桶新酒的酒精含量由10%调整到18%至20%，然后在200℃以下陈酿，半年后即可得到成品苹果酒。
8、 好的苹果酒，酒液应该是清亮、透明、没有沉淀物和悬浮物，给人一种清澈感。果酒的色泽为黄中带绿，有苹果香气和陈酒脂香。目前市场出售的果酒大部分属配制品，即由果汁经酒精浸泡后取霜，再加入糖和其它配料，经调配色、香、味而制成。这种果酒一般酒色鲜艳，口味清爽，但缺乏醇厚柔和感，有时有明显的酒精味。

泡菜的制作方法
原理 利用乳酸菌在无氧的环境下大量繁殖制作泡菜
经过查找资料和初步实验，发现当食盐浓度为3%以下时，制作的泡菜容易发生腐败，而当食盐浓度在8%以上时，制作的泡菜又容易成为腌菜。因此，我们分别制作了3%、5%、7%的食盐浓度梯度的泡菜，以供实验检测。
本实验选择的泡菜原料为白萝卜和洋白菜。这两样蔬菜不含或含有较少量的色素，有利于检测。制作泡菜时所采用的配料为：料酒、白醋、白糖、味精、姜、香料、花椒、辣椒。除食盐浓度不同外，配料完全相同并等量，以保证只有食盐浓度一个变量。
材料：
泡菜坛子一个（上边有沿，可装水，坛子的上沿口是装水的，且平常水不能缺，才能起到密封的作用）、高粱白酒、花椒、辣椒、大料（就是八角茴香，也叫大茴香）、冰糖、盐。

制作方法：
一、培养泡菜发酵菌
（1）首先在冷水里放入一些花椒，适量的盐，然后把水烧开。水量在坛子容量的10%-20%左右，不要太多。 盐比平时做菜时多放一点，感觉很咸即止。 花椒放大约20到30粒左右，尽量多放些，那样可以泡出很香的菜。
（2）待水完全冷却后，灌入坛子内，然后加一两高粱酒（大坛子可以适当多加）。 其它酒不行，泡菜菌其实就是从高粱酒麹来的，酒也是经常要添加的。
（3）放青椒( 是那种长的很结实的深绿色辣椒，很辣，调味用的)、生姜可多放些，增加菜的味道。而且这两种菜要保持坛子内一直有，它们有提味的作用。
2－3天后可注意仔细观察，看青椒周围是否有气泡形成，开始的时候是一到两个十分细小的气泡，不注意观察几乎看不见。如果有气泡，哪怕是一个气泡，就说明发酵正常，待青椒完全变黄后，再放2至3天，就成了!
（4）泡菜的原汁就这样做好了（泡菜菌培养好了）。
泡菜菌属于厌氧菌，注意坛口的密封十分重要。泡菜随着发酵，产生抗菌作用。在发酵过程中产生乳酸菌，且在随着发酵的成熟产生酸味，不仅使泡菜更具美味，还能抑制坛内的其它菌，防止不正常的发酵。

注意事项：
坛子内壁必须洗干净，然后把生水擦干，或干脆用开水烫一下也行。
绝对不能有生水。青椒洗过后，也要晾干，绝对不能带生水。
为什么不能有生水呢？道理很简单，自来水（生水）含有杂菌，而且里面的氯气会杀死泡菜菌。
二、泡制
先加入大料、冰糖适量。
（1）常用泡菜原料：萝卜，豇豆，盖菜，子姜（紫红的的嫩姜）、辣椒等。 注意：胡萝卜和黄瓜最好即泡即吃，过一晚上就拿出来，不然会引起坛子里生花（泡菜汤里出现泡沫，表面出现灰皮）。
（2）蔬菜洗干净后，切成大快或条（不要太小），晾干水分。
（3）放入培养好的泡菜原汁在坛内，蔬菜必须完全淹没在水里，然后密封坛口。
（4）每加入一次新的菜要加入相应的盐，要适量，做几次后会把握好的。如果盐多了，会咸，少了，菜酸，泡菜汤容易变质。
每次加入新菜后，根据不同的菜，泡制时间不一样，最长时间一周。
三、食用
（1）泡菜洗一下可直接吃，吃粥时就泡菜，一会儿就能吃上几碗粥。
（2）也可切成小块然后煸炒一下，泡菜特有的风味更显突出。入锅最多2分钟。口味可根据自己的习惯用干辣椒炝锅，放盐和糖。
（3）可以拌着吃。因为泡菜较咸，可以将黄瓜丝与泡菜丝混拌后，腌一会儿挤掉水分，加入香油、味精、香菜等，也是一份很不错的凉拌菜。
四、原汁的维护
每泡制3到4次后最好补充一次高梁酒（半两左右）、冰糖。
用过的原汁可反复使用，越老越好，不放菜的时候注意在里面加上盐，注意坛子上沿的水不要干了，放在凉爽的地方，只要保管的好，泡菜原汁用5年没问题。
用过半年以后的原汁发酵能力十分强大，一般的蔬菜只需浸泡一天左右就能食用。
特别提醒：
一、坛子一定要密封，最好选用土烧制的带沿口的那种。坛子的上沿口是装水的，且平常水不能缺，才能起到密封的作用。取泡菜时注意不要把生水滴到坛子里。
二、坛子里不要沾油，沾了油会生花，严重的整个坛子里的菜会腐烂。
测定亚硝酸盐含量
原理 在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮反应后，与N—1—萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。以下为反应方程式。
无机大分子颗粒吸附有机杂质的原理和方法。
1. 配制实验溶液 质量浓度为4mg/ml的对氨基苯磺酸溶液，质量浓度为2mg/ml的N—1—萘基乙二胺盐酸盐溶液（使其与对氨基苯磺酸溶液发生重氮反应），质量浓度为5μg/ml的亚硝酸钠溶液，提取剂（称取50 g氯化镉和50 g氯化钡溶于1 000 ml的蒸馏水中，用浓盐酸调节pH至1。提取剂的作用为提取泡菜汁中的杂质，以利比色），氢氧化铝乳液（进一步吸附泡菜汁中的杂质）和物质的量浓度为2.5 mol/L的氢氧化钠溶液（使其与泡菜汁中的部分物质形成沉淀）。
2. 制备标准显色液 用刻度移液管吸取0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml与1.5 ml的亚硝酸钠溶液（相当于1μg、2 μg、3 μg、4 μg、5 μg、6 μg和7.5 μg亚硝酸钠），分别移于50 ml比色管中，再另取1支比色管作为空白对照。在各管中分别加入2.0 ml氨基苯磺酸溶液，混匀，静至3～5 min后，各加入1.0 ml的N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液，添加蒸馏水，使各比色管内体积为50 ml，混匀，观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化。
3. 样品处理 以下是样品处理流程图
将3坛泡菜做好标记后，分别做如下处理：称取0.2 kg泡菜，用榨汁机粉碎，离心后过滤，得到大约100 ml汁液。将其中的20 ml转移到100 ml容量瓶中，加40 ml蒸馏水，20 ml提取剂，振荡1小时，再加入8 ml氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至100 ml后，立即离心和过滤。将60ml滤液转移至100 ml容量瓶中，加入氢氧化铝乳液，定容至100 ml，再次离心和过滤。此时，滤液变得无色透明。离心的目的是缩短过滤时间，因为过滤的时间太长，每次过滤约需1 h左右。
4. 比色 吸取40 ml的透明滤液，转移到50 ml的比色管中，重复“制作标准显色液”中的显色步骤，每隔2天检测一次，比色检测。计算样品中的亚硝酸盐含量：
亚硝酸盐含量=样品中亚硝酸盐含量（mg）/取样量（40ml滤液的质量，kg）
5. 数据记录 根据以上方法，我们分别在泡菜腌制完成后的第3 d、第5 d、第7 d、第9 d、第11 d和第13 d分别对食盐浓度为3%、5%、7%的3坛泡菜做了亚硝酸盐含量的检测，经过多次实验检测，我们得到以下数据：
实验结果与分析
三种食盐浓度的泡菜中的亚硝酸盐含量与发酵天数的关系图

从上面的曲线图中我们可以看出，泡菜中亚硝酸盐含量在发酵刚刚开始的时候都处于上升趋势，在5 d或者7 d的时候会达到一个最高值，之后就会慢慢下降，在发酵时间达到13 d左右的时候下降到一个相对比较稳定的数值，达到平稳状态。
对比不同食盐浓度的泡菜中亚硝酸盐含量，食盐浓度为3%的泡菜中亚硝酸盐含量总体上是3坛泡菜中最高的；食盐浓度为5%的泡菜中亚硝酸盐含量变化最快，它的最高值是三坛中最高的，当亚硝酸盐降到最低值时，也是3坛泡菜中最低的；而食盐浓度为7%的泡菜中亚硝酸盐含量变化不大，一直处于较低的数值。
通过以上记录的数据，特分析如下：
发酵初期，泡菜中的微生物生长很快，微生物将蔬菜中的硝酸盐氧化成亚硝酸盐，如此同时，蔬菜中的酚类物质和维生素C等物质也会将亚硝酸盐还原，但总体来说，生成的亚硝酸盐大于被还原的亚硝酸盐，因此，随着发酵时间的进行，亚硝酸盐的含量会逐步上升。随着微生物代谢活动的持续，氧气被消耗殆尽，泡菜坛中的环境不利于除乳酸菌以外的其他微生物的生长。与此同时，蔬菜中的硝酸盐含量由于被氧化而减少，因此，亚硝酸盐的含量会逐渐下降并趋于一个相对稳定的数值。
此外，食盐浓度也会对泡菜中的亚硝酸盐含量产生影响。根据所测得的数据可以发现，3%的食盐浓度所制作的泡菜，经过13 d发酵后，泡菜中的亚硝酸盐含量相对较高，低浓度的食盐溶液可能对微生物生长的抑制作用较小，而7%的食盐溶液则对微生物的生长有较大的抑制作用，因此，高浓度的食盐浓度泡菜中的亚硝酸盐含量较低。
进一步推测：选择不同的蔬菜，其亚硝酸盐含量及其变化曲线应该不同；泡菜制作时的温度不同，检测的数据也会有所变化。
六、结论
1．泡菜在发酵初期，其亚硝酸盐含量一直在上升，在发酵时间达到第5 d或第7 d时，其亚硝酸盐含量会达到一个最高值。之后，亚硝酸盐含量将慢慢下降。
2．不同的食盐浓度会影响泡菜中的亚硝酸盐含量，过高或过低的食盐浓度对泡菜中的亚硝酸盐含量都有不同程度的影响。
3．经过对泡菜口味的尝试、实验结果以及其原因的分析，我们认为食盐浓度为5%的泡菜比较适合食用，但要在发酵时间达到11天以后食用才比较适宜。
七、说明
本课题是一个极好的研究性课题，它与人们的日常生活和健康习习相关，既可以培养学生具有一定的实验技术和科学理论，又可以获得一定的科学研究价值，因此，本课题能很好地激发了学生的研究兴趣。中央电视台曾将本课题的学生活动拍成录像，在2005年1月27日少儿频道的神奇之窗栏目中播出。
本课题中的比色环节，如果学校有比色仪，也可以采用比色仪比色，这样做更精确些，但是一方面比色仪比较贵，另一方面，人工比色更有利于学生对实验原理的深刻认识。
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