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聚L-精氨酸修饰CNTs-壳聚糖电极的制备及对尿酸的检测
武怀娣
摘要 用循环伏安法制备了聚L-精氨酸修饰CNTs-壳聚糖玻碳电极，研究了尿酸在修饰电极上电化学行为。结果发现，在Φ=4mm的玻碳电极表面滴CNTs浓度为1mg/mL的壳聚糖溶液5µL形成的膜最好，且电流响应最灵敏。聚合L-精氨酸时选pH=6.0的磷酸盐缓冲溶液，浓度为2.5×10-3mol/L，扫描范围-0.7～2.5V，聚合时间为5周时聚合效果最优。研究了尿酸在该修饰电极上的电化学行为，结果显示，在pH=6.5的BR缓冲溶液中，扫描速率为200mV/s，电位范围在-0.1V～1.0V时，尿酸在修饰电极上于0.395V处产生一个灵敏的氧化峰。
关键词 L-精氨酸；尿酸；碳纳米管；玻碳电极
中图分类号：O657.1
Prepare poly(L-argenine)-modified CNTs-chitosan membrane glassy carbon electrode and detect the uric acid
Wu huaidi
Abstract：　Poly(L-argenine)-modified CNTs-chitosan membrane glassy carbon electrode (ACCGCE) was prepared by cyclic voltammetry. In a phosphate buffer solution of pH=7.0 and 2.5×10-3mol/L of L-argenine with a scan range of -0.7V～2.5V. The electrochemical behavior of uric acid at this electrode was studied. A novel method was proposed for the determination of uric acid. In a BR buffer solution of pH=6.5, at a scan rate of 200mV/s, a sensitive oxidation peak was observed at Epa=0.395V.
Keywords： L-argenine，uric acid, Carbon nanotubes, glassy carbon electrode
1引言
尿酸(UA)是人体内嘌呤核苷酸分解代谢过程的产物。过量的尿酸是许多疾病的征兆,如痛风、肾功能衰竭及先天性高尿酸血症等,血液中尿酸浓度过高还会导致肾脏受损及心血管疾病[ 1, 2 ] 。因此,研究尿酸的测定方法在药物控制、临床医学诊断及实现对生物分子的在体测定具有重大意义。检测尿酸的方法有光谱法[ 3 ] 、液相色谱法[ 4 ] 、酶分析法[ 5 ]和电化学法[ 6 ]等。由于光谱法易受样品中存在的其它发色基团的干扰,高效液相色谱法需要多步的样品预处理过程,且仪器昂贵,操作麻烦,并且常使用有毒试剂等,限制了方法的实用性。由于聚合物修饰电极的特殊三维空间结构及聚合膜对化学功能团的选择性响应,使测定的灵敏度和选择性大大提高,且操作简单[ 7, 8 ] 。目前用聚合物修饰电极测定UA的研究已有报道[ 9, 10 ] ,研制了用聚L -精氨酸修饰铂碳电极并用于尿酸的测定[11]。本文研究了聚L -精氨酸修饰CNTs-壳聚糖电极的制备及UA在修饰电极上的电化学行为，与聚L -精氨酸修饰玻碳电极相比，聚L -精氨酸修饰CNTs-壳聚糖玻碳电极的膜的牢固性大大提高，从而提高了电极的使用寿命。
2 实验部分
2.1 仪器
微机电化学分析系统（LK2005型电化学工作站；天津市兰力克化学电子高技术有限公司），CLJ2000磁力搅拌器（天津市兰力克化学电子高技术有限公司）；0.5-10µL微量加液器（Brand, Gevmany）;20-100µL微量加液器(Gilson, France)；100-1000µL微量加液器(Gilson, France)；石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏丹阳门石英玻璃厂），pHS-3B精密pH计，三电极系统：碳纳米管及聚L-精氨酸修饰的电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，测量均在室温下进行。
2.2试剂
尿酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），聚L-精氨酸（分析纯。Sigma），磷酸二氢钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），磷酸氢二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），碳酸钠（分析纯，天津市科盟化工工贸有限公司），冰醋酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），磷酸分析纯，国药集团化学试剂有限公司），硼酸（分析纯，佳木斯化学试剂厂），氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）多壁碳纳米管（LMWNT-10，主要直径范围<10nm, CNTs纯度≥95%,长度为5～15µm，灰分≤0.2wt%,比表面积：40～300m2/g.深圳纳米港有限公司，用前浓HNO3加热回流6h，并洗至中性，80℃干燥）；壳聚糖,L-精氨酸
2.3实验所用溶液及其配制方法
1）不同浓度的CNTs-壳聚糖聚合溶液的配制：称取10mg酸处理的CNTs与研钵中磨碎成粉末，在1.5mL的离心管中用二次水配成10mg/mL的溶液，在超声仪中超声两小时。在0.5mL的离心管中配制100µL的不同浓度的溶液。
表1 不同浓度的CNTs-壳聚糖聚合溶液的配制
CNTS（mg/mL）
0.0
0.2
0.5
1.0
3.0
5.0
7.0
CNTS（µL）
0.0
2.0
5.0
10.0
30.0
50.0
70.0
壳聚糖（µL）
100
98
95
90
70
50
30
2） 50mL8mg/mL的壳聚糖溶液的配制：用40mL0.05mol/L的HCl溶解400mg壳聚糖，因粘度很高，要不停的快速搅拌。用1.0mol/L的NaOH在精密pH计上调其pH稳定。调节过程中会有白色絮状物质生成，pH变化缓慢。约两小时后达到稳定，实际NaOH用量约10µL。
3） 不同PH的PBS缓冲液的配制：先配置500mLpH=7的0.2mol/L的PBS缓冲液，准确称取NaH2PO46.08g，Na2HPO421.84g。混合后用二次水溶解。在500mL容量瓶中定容。用0.1mol/LNaOH在精密pH计上调节不同的pH值。
4） 不同pH的BR缓冲溶液的配制：
A液，3.92g H3PO4(2.71mL85%正磷酸)，2.47g H3BO4, 2.40g乙酸（2.36mL冰醋酸）用二次水配成1000mL的溶液。B液，8.0g/L的NaOH溶液1000 mL。按表2配制。
表2 配制不同pH的BR缓冲溶液的方法
A液 25mL
B液(mL)
1.5
3.5
4.5
5.25
6.0
7.25
8.75
9.5
10.5
11.5
13.15
pH值
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
A液 25mL
B液(mL)
15.25
16.0
17.0
18.5
19.5
20.25
21.0
22.25
25.0
pH值
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.0
11.5
12.0
5)100mL2.5×10-3mol/L L-精氨酸溶液的配制方法：准确称取7.16g Na2HPO4于洁净干燥的烧杯中，加入80mL水溶解，用浓NaOH调pH=10.5，将其定容于100mL的容量瓶摇匀后，准确称取0.0435g L-精氨酸，溶于上述PBS缓冲溶液中，并用其定容于100mL容量瓶中，摇匀备用。
6) 不同浓度的50mLpH=6.0（PBS缓冲液）的L-精氨酸溶液的配制（见表3）。
表3不同浓度的50mLpH=6.0（PBS缓冲液）的L-精氨酸溶液的配制方法
L-精氨酸溶液(mol/L)
1.0×10-3
2.5×10-3
3.0×10-3
5.0×10-3
L-精氨酸质量（g）
0.0087
0.0217
0.0261
0.0435
7)100mL1.0×10-3mol/L尿酸溶液的配制方法：准确称取1.32gNa2CO3于洁净干燥的少杯中，加入二次水溶解，将其定容于200mL的容量瓶摇匀制得0.01mol/L的Na2CO3。准确称取0.0168g尿酸，用0.01mol溶液溶解，将其定容于100mL的容量瓶中，摇匀备用。
8）不同pH的2.5×10-4mol/L的尿酸溶液的配置：取上述1.0×10-3mol/L尿酸溶液12.5 mL于50 mL容量瓶中，用不同pH的BR缓冲液定容。
2.4 CNTs-壳聚糖电极的制备及聚L-精氨酸修饰CNTs -壳聚糖电极的制备
2.4.1 CNTs-壳聚糖电极的制备
将玻碳电极在湿润的金相砂纸上磨光，然后用Al2O3（0.05µm）悬乳液抛光成镜面，依次用VHNO3：VH2O=1：1混合液，无水乙醇和二次水超声清洗5min。再用二次水冲洗晾干后，以CNTs浓度为1mg/mL的壳聚糖混合液5µL滴至电极表面，放阴凉处阴干。
2.4.2 聚L-精氨酸修饰CNTs-壳聚糖电极(ACCGCE)的制备
以CNTs-壳聚糖电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在浓度为2.5×10-3mol/LL-精氨酸的pH=6.0的PBS缓冲液中，电位范围为-0.7～2.5V，以60mV/s的扫描速率循环扫描五周。取出用二次水淋洗电极表面，晾干。即制得聚L-精氨酸修饰CNTs-壳聚糖电极。
2.5实验方法
在10ml 的电解池中，倒入2.5×10-4mol/L 的由BR缓冲液配制的不同PH的UA溶液。采用三电极体系，以聚L-精氨酸修饰CNTs-壳聚糖电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，静置时间为1s，以200mV/s的扫描速率向正电位方向扫描。记录-0.1V～1.0V的线性扫描伏安图上的峰电流和峰电位。每次扫描结束后，用二次水冲洗，滤纸吸干后，即可进行下一次测定。
3 结果与讨论
3.1电极表面CNTs-壳聚糖聚合条件
壳聚糖与CNTs溶液以不同比例混合后，滴在电极表面成膜后，再制成L-精氨酸修饰电极，研究了该电极对UA的响应，结果见图1。由图1可知，当CNTs浓度为1mg/mL，对尿酸测定最灵敏。制得的修饰电极对UA的电化学响应在0.368V处产生一个灵敏的氧化峰。（见图2）

ip/µA

图1 不同浓度CNTs修饰的ACCGCE对尿酸的响应
电聚合条件：2.5×10-3mol/L L-精氨酸；pH=6.0 PBS溶液；扫描范围：-0.7～2.5V；扫速：60mV/s。测定条件：2.5×10-4mol/L UA ；pH=6.5 BR溶液；扫速：200mV/s。
ip/µA

图2 2.5×10-4mol/L UA在ACCGCE上的循环伏安曲线
条件如图1

3.2电化学聚合条件
实验结果表明,随着L-精氨酸溶液pH值的升高,制得的修饰电极对UA的响应电流先增大后减小再增大,在pH= 6.0，pH=10.5时,响应电流出现两个顶峰。但pH= 6.0处，峰电流高且峰形好（如图3）。固定负电位为- 0.7V,正电位在1.0～2.5V范围内,峰电流随电位增加而增加,大于2.5V时,峰电流开始减小。固定正电位为2.5V,负电位在- 0.7 V时,制得的修饰电极对UA的响应电流最大,且峰形最好。在- 0.7～2.5 V聚合电位下,循环扫描速率小,形成的膜致密,但耗费时间多,且随着时间的增长,一些干扰因素也难控制;扫描速率大,能够节省时间,但形成的膜的表面形态不规整,影响测定的精密度。在扫速为60 mV / s时,峰电流达到最大,且电极稳定性较好。修饰电极对UA的响应电位不随聚合扫描次数的变化而改变,但响应电流受扫描次数的影响较大,扫描次数较少时,对UA的响应电流小,聚合扫描5周,修饰电极对UA的响应电流达到最大值。（如图4）这是由于随着扫描次数的增加,在电极表面聚合的氨基酸越多,相应的活性中心增加,使其对目标物质的响应电流增大。聚合5周后,由于聚合时间长,膜厚增加,电子在膜中阻力变大,导致响应电流略有降低。故本文选择在pH = 6.0的PBS介质中, - 0.7～2.5V电位范围内,以扫描速率为60 mV / s聚合5周制备聚L -精氨酸修饰电极。
ip/µA

图3 不同pH值L-精氨酸聚合溶液制成ACCGCE对2.5×10-4mol/L UA的响应。
条件如图1

Ip/µA
扫描次数/圈

图4聚合L-精氨酸扫描次数对UA的响应电流的影响曲线
条件如图1
3.3 L-精氨酸浓度的影响
实验结果表明，当取L-精氨酸浓度为2.5×10-3mol/L时。聚合形成的膜最好(如图5）且在对尿酸进行检测时，制得的修饰电极对UA的电化学响应在0.368V处产生一个灵敏的氧化峰(如图2)。
Ip/mA

图5 L -精氨酸聚合过程的循环伏安曲线
电聚合条件：2.5×10-3mol/L L-精氨酸；pH=6.0 PBS溶液；扫描范围：-0.7～2.5V。3.4 尿酸检测的最佳环境
3.4.1 PH的影响
测定尿酸时，底液的pH对UA的峰电位和峰电流均有影响。随着底液的PH值的升高，氧化峰电位负移 (见表3 )。在pH=3.0时，峰电流较大，灵敏度较高。
但在pH=2.0～2.5范围内。峰形较宽且电位太正（如图6）。在pH=9.0～12.0之间，峰电流较小（如图7）。为了检测一些干扰因素，我们选择接近人体的pH=6.5的弱酸环境。
表4 不同pH的底液对UA检测的氧化峰电位
pH
2.0
2.5
3.0
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
E/V
0.7591
0.6105
0.5993
0.5520
0.5047
0.4529
0.4416
0.4191

pH
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
E/V
0.3943
0.3403
0.3291
0.2368
0.2188

Ip/µA

图6 在pH=2.0的BR缓冲液中ACCGCE对尿酸的循环伏安曲线
条件如图1

Δi/µA

图7 在pH=12.0的BR缓冲液中ACCGCE对尿酸的循环伏安曲线
条件如图1
3.4.2扫描速率对尿酸检测的影响
随着扫描速率的增加。尿酸的峰电流不断增加。氧化峰电位不断正移（如表5）。在低扫速下，响应电流较小（如图8a），在高扫速下，峰电流较大（如图8c），但峰形变差。所以本实验选择200mV/s的扫速（如图8b）。
表5 不同扫描速率下检测尿酸的氧化峰电位和电流
扫速（mV/s）
0.01
0.02
0.05
0.1
0.2
0.25
0.3
0.35
E/V
0.2931
0.3021
0.3100
0.3223
0.3426
0.3471
0.3561
0.3628
ip/µA
8.3244
10.1609
15.5496
20.482
29.034
33.833
40.214
44.718

扫速（mV/s）
0.40
0.45
0.5
0.55
0.6
0.65
0.7
E/V
0.3764
0.3899
0.3696
0.3742
0.3786
0.3831
0.3876
ip/µA
53.673
71.314
56.086
57.802
66.890
70.241
74.531

Δi/µA

c
b
a

图8不同扫描速率下尿酸的循环伏安曲线
参考文献
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