枯草芽孢杆菌降解油茶饼中茶皂素及成分变化.pdf

枯草芽孢杆菌降解油茶饼中茶皂素及成分变化罗彦玉，王磊，邹春霞，贾玉龙*（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳,550 0 0 0）研究报告D0I:10.13995/ki.11-1802/ts.033723引用格式：罗彦玉，王磊，邹春霞，等.枯草芽孢杆菌降解油茶饼中茶皂素及成分变化J.食品与发酵工业，2 0 2 3，49（17）：16 1-167.LUO Yanyu,WANG Lei,ZOU Chunxia,et al.Degradation of tea saponin in Camellia oleifera cake by Bacillus subtilisand its composition changeJ.Food and Fermentation Industries,2023,49(17):161-167.摘要较高的茶皂素含量一直是限制油茶饼综合利用的关键因素，现有主流处理油茶饼茶皂素的微生物发酵法存在液态发酵周期长、大批量操作成本高等缺点。基于前期筛选所得的有效降解茶皂素的枯草芽孢杆菌，期望开发大规模生产固态发酵油茶饼的新思路。该研究将茶皂素降解率作为主要衡量指标，利用单因素、响应面试验进行固态发酵的条件优化，随后测定分析油茶饼发酵前后的营养成分。结果表明最佳发酵条件为初始含水量8 3.7%，发酵温度3 6.3，接种量10.5%，发酵时间6 0.0 h，此时菌株对于茶饼中茶皂素降解率为7 2.18%。通过成分分析发现发酵会使油茶饼中各成分产生显著差异，其中茶皂素、单宁等抗营养因子显著降低；粗蛋白、还原糖、必需氨基酸等营养物质显著增加；黄酮等主要活性成分含量显著增多，而多糖、总糖被菌株当作碳源消耗显著减少。研究结果有望为我国油茶饼的综合利用提供一定的数据支撑。关键词油茶饼；枯草芽孢杆菌；茶皂素降解率；固态发酵；成分变化油茶饼是油茶籽榨油后的副产物，茶油的普及造成其产量增加，在中国每年约产生10 0 0 万t)。油茶饼含有丰富的蛋白质、多糖和多酚2 ,具有很高的经济价值，是潜在的饲料资源。但其因含茶皂素、单宁,会呈现苦、涩味，有刺激性，会影响动物吸收导致饲用价值低3 。目前关于油茶饼的研究主要是通过溶剂提取酚类、多糖、茶皂素等开发其特性价值，从而实现油茶油工业废弃物的再利用4-6 。但这对油茶饼的整体利用率极低，耗费溶剂、造成原料营养流失的同时，滤渣也会造成环境污染，于是实现其资源利用最大化应从降解茶皂素的角度出发。微生物发酵法是目前最为常见的方法,已有研究证明芽孢杆菌属、乳杆菌属、柠檬酸杆菌属等含皂素降解酶,对茶皂素有降解效果3.7-8 ,其中芽孢杆菌的发酵效果良好 。CHANG等10 用混合培养的枯草芽孢杆菌和黑曲霉固态发酵降解油茶粕中茶皂素,最佳条件发酵4d降解率为（6 7.8 40.2 3）%。黄浦等 用地衣芽孢杆菌与铜绿假单胞菌混合发酵降解茶皂素，优化后发酵12.8 d降解率达到（7 3.7 6 0.63）%。研究表明，用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌进行液态发酵，最优条件下茶皂素降解率均低于70%12-13。鉴于此,本研究旨在研究单菌降解效果第一作者：硕士研究生（贾玉龙副教授为通信作者，E-mail:）基金项目：贵州省林业局特色林业研究项目（特林研2 0 2 0-0 3，特林研2 0 2 0-19）；贵州省科技厅科技支撑计划定向重点项目（黔科合定向重点2022-09）；贵州大学引进人才自然科学科研基金项目（人基合字2 0 19-16）收稿日期：2 0 2 2-0 9-2 1,改回日期：2 0 2 2-11-14更好、发酵时间更短、操作更简便的固态发酵油茶饼的最优条件。考虑到枯草芽孢杆菌有显著的益生菌潜力14,会加快肠道对营养物质的吸收、抑制有害菌种及促进禽畜生长等15-16 ,故本研究通过单因素、响应面试验优化降解茶皂素的发酵条件,并对比此时发酵终点各物质含量。一是有助于发酵期间菌株良好生长，以达到所需目的，提高茶皂素降解率和降低能耗对于工业生产具有重要意义；二是综合评价最优条件下其营养物质变化规律，为我国油茶饼综合利用提供实际参考。1材料与方法1.1 材料与试剂油茶饼,贵州恒生源有限公司；枯草芽孢杆菌，自然发酵的油茶饼中筛选所得,菌株保藏编号CCTCCM2022623。营养琼脂（去除琼脂则为营养肉汤）、茶皂素标品（9 8%），贵州慕为美生物有限公司；无水乙醇、NaCl、香草醛、Na,CO，、H Cl、福林酚、AICl，等化学试剂为国产分析纯。1.2仪器与设备SpectraMax190型光吸收酶标仪，美谷分子仪器2023 年第 49 卷第 17 期(总第 48 5 期)16 1食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES有限公司;H2-16KR型冷冻离心机，湖南可成仪器设备有限公司；L-8800氨基酸自动分析仪，日立公司；SCIENTZ-18N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；JK9870型全自动凯氏定氮仪，上海仪电分析仪器有限公司；BSA224S分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-6恒温水浴锅，江苏金坛市金城国盛实验仪器厂。1.3试验方法1.3.1种子液制备菌种活化后，挑单颗菌落于50 mL的液体培养基,3 7、150 r/min摇床培养2 2 h。1.3.2样品前处理油茶饼干燥粉碎，40 目筛，按比例与水拌匀，121 灭菌 2 0 min。1.3.3茶皂素含量测定参照田漫漫等17 的方法提取茶皂素；用香草醛-硫酸显色法3 测定茶皂素含量，稍作改动：0.5mL提取液加0.5mL8%香兰素-乙醇溶液，置冰水浴加4mL77%H,S04溶液轻微晃动摇匀，6 0 水浴10min，冷却至室温,550 nm记录吸光度。取0.0.1、0.2、0.3.0.4、0.5m L的1mg/mL茶皂素标品溶液补水至0.5mL同上步骤作标准曲线。降解率按公式(1)计算：Wo-WX/%=Wo式中：X,茶皂素降解率,%;w。,发酵前油茶饼中茶皂素含量，mg/g;w，发酵后油茶饼中茶皂素含量，mg/g。1.4单因素试验初始条件：发酵时间2 d，温度3 7，接种量10%，翻样（间隔12 h）。分别设置初始含水量7 0%、80%、9 0%、10 0%、110%、12 0%；发酵温度2 5、2 8、31、3 4、3 7、40；接种量2%、4%、6%、8%、10%、12%；发酵时间12、2 4、3 6、48、6 0、7 2、8 4、9 6、10 8、120 h。每确定一个因素再进行下一步试验。1.5响应面试验1.5.1Box-Behnken响应面优化设计以单因素试验中得到的对茶皂素降解率影响较大的因素一一含水量（A）、接种量（B）和发酵温度(C)进行响应面优化试验。1.5.2验证试验对响应面所得最佳工艺进行验证，判定其结果是否可信。1622023 Vol.49 No.17(Total 485)1.6成分测定1.6.1基本成分灰分测定参照GB5009.42016食品安全国家标准食品中总灰分的测定；蛋白质测定参照CB5009.5一2 0 16 食品安全国家标准食品中蛋白质的测定；脂肪测定参照GB5009.62016食品安全国家标准食品中脂肪的测定；粗纤维测定参照GB/T5009.10一2 0 0 3 植物类食品中粗纤维的测定；单宁测定参照NY/T16002008水果、蔬菜及其制品中单宁含量的测定分光光度法；还原糖测定使用DNS法18 ,稍改动,1mL待测液加1mL水、1.5mLDNS试剂,混匀，沸水浴5min,冷却加水至10 mL,540nm测吸光度。1.6.2游离氨基酸样品前处理参照WEN等19 的方法，稍作修改，样品按体积比1:50 加人0.0 1mol/L的盐酸，超声波浸泡3 0 min，过滤，上清液按体积比1:1加人8%的磺基水杨酸，摇匀放置10 min，10 0 0 0 r/m in 离心10min，上清液过膜（0.2 2 m），上机测定。1.6.3活性成分总糖参照葱酮硫酸法2 0 ;多糖参照苯酚硫酸法2 1 总酚参照Folin-Ciocalteau法2 2 ，稍作修改：0.5mL提取物按V（样品）：V（8 0%甲醇）=1：10，(1)40超声波浸提1h，循环3 次，过滤定容到50 mL，加水7.5mL、福林酚0.5mL、2 0%的Na,CO，1.5m L混匀黑暗反应3 0 min，7 6 5n m 读数。取0.1mg/mL的没食子酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL按1.3.3节的方法作标准曲线。总黄酮采用硝酸铝比色法2 3 ,1.0 mL提取物按V（样品）：V（6 0%乙醇）=1:3 0，浸泡过夜，45超声波45min，重复提取，定容至10 0 mL，分别加10%的Al（NO，）3、5%的NaNO，各0.3 mL，摇匀，黑暗放10min;加4%的Na0H3.5mL，定容到10 mL,黑暗放30min,510nm测定吸光度。质量浓度为1mg/mL芦丁标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL按1.3.3 节的方法作标准曲线。1.7数据处理利用MicrosoftExcel和SPSS26.0软件数据处理,结果以平均值标准差表示，利用Design-Expert13软件完成响应面优化，利用Origin2021软件中的HeatMapwithDendrogramAPP进行聚类热图的绘制。各组重复3 次，P0.05表示差异显著。研究报告含水量过低也会影响茶皂素的降解，因此初始含水量2结果与分析选择9 0%。2.1卓单因素试验结果2.1.1初始含水量对茶皂素降解率的影响初始含水量是固态发酵的一个重要影响因素,低水分时微生物生长会最小化，高水分时基质会被水占据导致氧气被排出2 4。图1-a中9 0%含水量时降解率达到6 6.2 9%，最适合固态发酵降解茶皂素。高于90%时降解率持续降低，这可能是由于含水量增加使混匀后的油茶饼黏度增加通气量减少的原因引起的，a80r%/率圳刻掌骨装2.1.2发酵温度对茶皂素降解率的影响影响微生物生长的所有生态生理参数中最重要的是温度,其通过影响酶活性对微生物生长、代谢产物的积累产生作用2 5。图1-b中随温度升高菌株对茶皂素的降解率呈现先升后降的趋势，这是因为高温会使酶失活，低温会影响菌体生长和产酶速度。37时茶皂素降解率达到6 1.0 6%显著高于其他温度，因此发酵温度选择3 7。b70r60bDbDbdcd302010070C7060d504030201002Fig.1 Effects of different single factors on degradation rate of tea saponin2.1.3菌菌株接种量对茶皂素降解率的影响菌株生长速度与接种量直接相关，接种量将影响菌株的降解能力。图1-c中接种量10%时降解率达到最大值6 3.6 1%。接种量2%10%时，降解率随接种量增加而增加，原因是细菌数增加缩短了对数期，其通过种内互助快速适应新环境，生长良好，提高降解率。而超过10%时，营养物质缺乏使得菌株相互竞争，降解率停止增加甚至减少2 6 。故选择10%的接种量。2.1.4发酵时间对茶皂素降解率的影响图1-d是发酵时间对菌株茶皂素降解率的影响。发酵前期,随时间推移降解率一直升高，,这是因为菌株产生的某些酶类对油茶饼中大分子物质进行分解8 ,促进了菌株生长。而6 0 h后降解率开始逐渐下降，这是营养物质消耗尽，后期不足以供菌体正201008090初始含水量/%bcbbcd410068接种量/%a-初始含水量;b-发酵温度;c-接种量;d-发酵时间图1不同单因素对茶皂素降解率的影响注：不同小写字母表示差异显著（P 接种量（C）初始含水量（A）。茶皂素降解率（Y)的二次回归方程：Y=69.802023 年第 49 卷第17 期（总第 48 5 期)16 311010120cd1225d706050403001224364860728496108120132发酵时间/h28313437发酵温度/40食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES0.91A-4.02B+3.82C-1.31AB-2.80AC-2.57BC-0.71A-8.17B-11.43C。加以软件分析得最佳条件为初始含水量8 3.6 6 9%，发酵温度3 6.3 0 1，接种量10.53 5%，降解率预测值7 1.2 3 0%。考虑实际操作，确定初始含水量8 3.7%、发酵温度3 6.3、接种量10.5%进行验证试验，茶皂素降解率为72.18%，接近预测值，证明本试验的优化方法可信。表1响应面试验设计与结果Table 1Design and results of response surface experiment因素茶皂素降试验号A初始含B(温度)/C(接种量)/%水量）/%1802100380410058061007808100990109011901290139014901590169017902.3基本成分变化如表3 所示，发酵后茶皂素和单宁含量分别显著降低7 2.18%、2 7.2 7%。发酵后仅剩6.2 4%的茶皂素，含量较低，将其添加于饲料中可能会具有改善动物生长性能的潜力2 7 。粗蛋白和粗脂肪增加了Table 3 Basic components of C.oleifera cake before and after fermentation项目茶皂素/%发酵前22.43 0.47a发酵后6.24 0.25 b注：同一列不同小写字母表示有显著差异（下同）。2.4游离氨基酸变化发酵前后油茶饼的游离氨基酸变化情况见图2，共16 种氨基酸，含7 种必需氨基酸。热图表明2 个样品的氨基酸含量差异显著,发酵后油茶饼总氨基酸含量显著降低3 1.42%，必需氨基酸显著增加16.18%,其中蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸分别显著增加2 7 倍、1.41倍、1.3 9 倍，这和DAI等【2 8 1用枯草芽孢杆菌进行固态发酵豆粕后必需氨基酸含量增加的研究结果一致。其他氨基酸如天冬氨酸增加（1.17表2 回归模型方差分析Table 2Analysis of variance of regression model方差来源平方和自由度均方F值模型1205.30A-初始含水量6.64B-发酵温度129.28C-接种量116.51AB6.81AC31.30BC26.32A22.09B2280.89C2550.11解率/%残差失拟项3410341040104010378378371237123484083412401237103710371037103710表3 油茶饼发酵前后的基本成分单宁/%还原糖/%1.32 0.02 a4.42 0.16b0.96 0.01 b8.62 0.32aP值9133.9216.641129.281116.5116.81131.30126.3212.091280.891550.11343.970.000 1*11.1978.66365.33纯误差64.19总和60.2753.9150.6556.3564.5759.0848.3745.0960.4446.9069.2470.7169.5768.9270.5583.740.000 1*4.150.080 980.840.000 1*72.850.000 1*4.260.077 919.570.003 1*16.460.0048*1.310.290 1175.640.000 1*1.602.892.5341 216.5016注：R=0.9908,RAaj=0.9790;*影响极显著(P0.01)；*影响显著(P0.05)。26.89%和3 3.48%，粗蛋白增加是由于微生物会向胞外分泌多肽和酶蛋白等物质2 8 。粗脂肪增加是因为油茶饼发酵时某些营养物质可能会降解成小分子物质，如醇和酸发生酯化反应,形成酯类物质，使得乙醚提取物增多2 9 。发酵过程中,基本成分比例会发生变化，如油茶饼中某些物质会被菌株当做碳源以供营养所需。而粗纤维和还原糖的变化是由于枯草芽孢杆菌产生纤维素酶，将纤维素降解成低分子还原糖所引起。相比发酵前，油茶饼发酵后不良属性被改善，抗营养因子大量降解使得苦、涩味消失，适口性变好；含有营养价值更高的蛋白、脂肪，可用于生产生物发酵饲料3 ,在动物蛋白饲料方面具有一定的应用前景。粗蛋白/%9.15 0.08b11.61 0.12a倍）和甘氨酸降低（57.8 3%）与YA0等3 0 1研究相似，枯草芽孢杆菌发酵豆粕后其含量会显著增加和减少，这是大分子蛋白质水解所引起的。天冬氨酸由小分子肽(2 2 0 个氨基酸残基)和游离氨基酸组成3 1,，可直接被动物肠道系统吸收，侧方面也证实发酵油茶饼可作为饲料的潜在可能性。此外,丙氨酸、精氨酸分别急剧下降7 0.50%和58.9 7%，造成总氨基酸的整体下降，这是由于最优工艺下菌株长势良好，消耗过多氨基酸所引起。氨基酸可提供微生物生长所需4.560.632.9粗脂肪/%粗纤维/%9.35 0.22b19.26 0.59a12.48 0.67a16.48 0.38b0.0883灰分/%3.53 0.07b4.16 0.05a1642023 Vol.49 No.17(Total 485)研究报告营养，也是重要的呈味物质，与产品风味密切相关。纤维素并释放酚类化合物,因为酚类化合物与纤维素异亮氨酸、组氨酸、精氨酸等是苦味氨基酸3 2 ,其含酶和果胶酶的产生之间具有强烈的相关性3 6 ;在发量降低表明苦味有所减少，这与2.3 节中茶皂素大幅酵时，微生物会产生各种酶类分解植物细胞的细胞壁度降解相对应，减少了牲畜拒食的可能性。总的来成分，实现酯键水解，释放酚类物质，使得总酚含量增说，微生物发酵会使氨基酸有不同程度的变化，如加。酚类物质是最大的次生代谢物组分之一，也是非CHEN等3 3 发现纳豆芽孢杆菌在不同发酵时间下大必需膳食成分的主要组分，具有广泛的生物特性，如豆粉氨基酸会产生显著差异。抗氧化、抗炎和抗癌活性3 7 。而发酵后活性成分增加，为较高市场价值功能性食品、药物等产品的生产创造了新的契机。-1.00-1.00-0.55-1.14-0.90-0.90-0.910.82-0.90-0.92-0.93-0.90-0.85-0.99-0.91-1.051.350.100.540.790.261.431.130.731.010.771.100.900.941.030.881.06图2 油茶饼发酵前后氨基酸含量的热图Fig.2Heatmap of amino acid content in C.oleifera cakebefore and after fermentation注：DZB为发酵前,FJB为发酵后。2.5活性成分变化黄酮、总酚和糖类是油茶饼最主要的活性成分。表4中总糖和多糖显著下降2 8.2 2%和2 3.6 6%，这说明菌株将油茶饼中的糖类当作了自身生长所需的碳源，不断消耗造成了大量减少。这与WAGNER等3 4 研究发现枯草芽孢杆菌可以降解或使用碳水化合物作为发酵中自身代谢的能量来源的观点一致。多糖中葡萄糖是主要的组成单糖之一,可用于菌株的生物合成和代谢,这也是造成其含量下降的原因。多酚和类黄酮是科学研究中经常评估的生物活性化合物，由分析可知枯草芽孢杆菌发酵油茶饼后总酚和总黄酮含量分别增加了5.56%和3 0.8 8%。这与XU等3 5 和DAI等2 8 的研究一致，大豆发酵产品与原料的总酚与黄酮含量存在差异；枯草芽孢杆菌发酵豆粕会使总酚和类黄酮含量显著增加。芽孢杆菌能代谢-0.63-0.99-0.90-1.01-0.92-0.91-0.90-0.770.770.640.850.850.950.700.760.780.880.021.130.910.910.920.910.93-0.15-182-0.73-0.85-1.05-0.70-0.910.961.250.920.900.910.900.910.960.93-1.490.34-0.95-0.97-0.81-0.90-0.90-0.850.500.850.680.910.930.910.860.86-0.57-0.49-0.86-0.89-0.87-1.100.920.92Cyse0.5His-0.5Gly-1.0Ala-1.5ArgThrSerLeuValPheGluLysASPMetTyr1.0表4油茶饼发酵前后的活性成分Table 4Active components of C.oleiferacake before and after fermentation项目总糖/(mg/g)发酵前264.92 2.96a发酵后190.15 2.22 h3结论与讨论本研究利用枯草芽孢杆菌固态发酵油茶饼，通过响应面优化得到降解茶皂素的最佳工艺为初始含水量8 3.7%，发酵温度3 6.3，接种量10.5%，发酵时间6 0.0 h，此时降解率达到7 2.18%。而后对比发酵终点各类物质含量，结果表明：发酵会使油茶饼中茶皂素、单宁等抗营养因子显著降低；粗蛋白、粗脂肪、还原糖、必需氨基酸等营养物质显著增加；黄酮等主要活性成分显著增多，糖类物质显著减少；此外粗纤维、灰分含量也产生变化。综上，本研究证实枯草芽孢杆菌固态发酵可以一定程度提升油茶饼的营养与活性成分含量，有利于其在发酵产品中的应用与发展。参考文献1 ZHENG T R,YU H L,LIU S J,et al.Achieving high ethanol yieldby co-feeding corncob residues and tea-seed cake at high-solids sim-ultaneous saccharification and fermentation J.Renewable Energy,2020,145:858 866.2SARMAH K,DAS P,SAIKIA G K,et al.Biochemical characteriza-tion of tea（Ca m e l l i a s p p)s e e d o i l c a k e J.Bu l l e t i n o f En v i r o n-ment,Pharmacology and Life Sciences,2018,7(9):45-49.3FU G M,CHEN K D,WANG J T,et al.Screening of tea saponin-degrading strain to degrade the residual tea saponin in tea seed cakeJ.Preparative Biochemistry&Biotechnology,2020,50（7):697 707.4ZHANG D D,NIE S P,XIE M Y,et al.Antioxidant and antibacte-rial capabilities of phenolic compounds and organic acids from Ca-mellia oleifera cake J.Food Science and Biotechnology,2020,29(1):17-25.5 ZHANG S,LI X Z.Hypoglycemic activity in vitro of polysaccharides2023 年第 49 卷第 17 期(总第 48 5 期)16 5多糖/(mg/g)174.42 3.43a133.16 1.49b总酚/(mg/g）总黄酮/(mg/g)20.69 0.39a10.72 0.22b21.84 0.45a14.03 0.21a食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESfrom Camellia oleifera Abel.seed cake J.International Journal ofBiological Macromolecules,2018,115:811-819.6YU Z L,WU X H,HE J H.Study on the antifungal activity andmechanism of tea saponin from Camellia oleifera cake J.EuropeanFood Research and Technology,2022,248(3):783-795.7QIAN B J,YIN L R,YAO X M,et al.Effects of fermentation onthe hemolytic activity and degradation of Camellia oleifera saponinsby Lactobacillus crustorum and Bacillus subtilis J.FEMS Microbiol-0gy Letters,2018,365(7):fny014.8任泽文，肖志红，吴红，等.高效降解茶皂素菌株的分离鉴定及其发酵优化研究J.中国粮油学报，2 0 19，34（3）：99-10 4.REN Z W,XIAO Z H,WU H,et al.Isolation and identification oftea saponin strain in a highly efficient degradation and optimizationof its fermentationJ.Journal of the Chinese Cereals and Oils Asso-ciation,2019,34(3):99-104.9ZHENG L,LI 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