关岭牛MSTN基因3’-27-UTR与bta-miR-27b的靶向验证.pdf

【目的】明确关岭牛bta-miR-27b与肌肉生长抑制素基因（MSTN）的结合位点及靶向调控关系，为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据，也为贵州地方黄牛分子遗传改良工作提供新的切入点。【方法】通过TargetScan预测牛MSTN基因3端非翻译区（3-UTR）的潜在miRNA结合区域及互作miRNA，对比关岭牛与不同关岭牛杂交品种的生理表型及MSTN基因和3-UTR端miRNA表达差异，并分析bta-miR-27b在不同关岭牛杂交群体中的靶位点特异性。将MSTN基因3-UTR序列野生型（WT）和3-UTR序列突变型（MUT）分别克隆至pMIR-REPORT Lucife-rase（H306）载体构建重组双荧光素酶报告基因载体，与bta-miR-27b共转染293T细胞以验证bta-miR-27b与MSTN基因的作用关系，并利用实时荧光定量PCR验证bta-miR-27b对MSTN基因表达的影响。【结果】在牛MSTN基因3-UTR端发现7个miRNA结合位点；关岭牛各系杂交品种的3个miRNA（bta-miR-27a-3p、bta-miR-27b和bta-miR-128）相对表达量均极显著高于关岭牛（P0.01，下同），MSTN基因相对表达量极显著低于关岭牛，体质量、体高、体斜长、胸围等生长指标却明显优于关岭牛。关岭牛及其杂交牛MSTN基因3-UTR端的bta-miR-27b结合区域均无突变、无缺失；MSTN-3-UTR（WT）与bta-miR-27bmimics共转染293T细胞后其相对荧光值下降53.80%，极显著低于MSTN-3-UTR（MUT）+bta-miR-27bmimics共转染；转染bta-miR-27b mimics后，bta-miR-27b在关岭牛原代成肌细胞株（N2）中成功超表达，而MSTN基因相对表达量呈极显著下调趋势，表明bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。【结论】bta-miR-27b与MSTN基因的结合区域位于3-UTR端第6269位碱基处，且靶位点保守性较高。bta-miR-27b对MSTN基因有很强的靶向调控作用，表现为bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。关键词：关岭牛；MSTN基因；3端非翻译区（3-UTR）；bta-miR-27b；双荧光靶向验证中图分类号：S823.81文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）04-1235-09收稿日期：2022-08-14基金项目：国家科技支撑计划项目（2015BAD03B02-3）；贵州省农业重大产业科学研究攻关项目（黔教合KY字 2019 011号）通讯作者：许厚强（1957-），https:/orcid.org/0000-0002-4696-5671，博士，教授，博士生导师，主要从事细胞分子生物学及动物育种研究工作，E-mail：第一作者：卢贤君（1995-），https:/orcid.org/0000-0003-1067-815X，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（4）：1235-1243ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.04.028Targeted verification of the relationship between Guanling cattleMSTN gene 3-UTR and bta-miR-27bLU Xian-jun，XU Hou-qiang*，XU Jia-li，RUAN Yong（College ofAnimal Sciences，Guizhou University/Key Laboratory ofAnimal Genetics，Breeding and Reproduction in thePlateau Mountains Region，Ministry of Education/Key Laboratory ofAnimal Genetics，Breeding and Reproduction inGuizhou，Guiyang，Guizhou 550025，China）Abstract：【Objective】This paper clarified the relationship between the binding site and targeted regulation betweenbta-miR-27b and myostatin gene（MSTN）in Guanling cattle，to provide a theoretical basis for improving the meat produc-tion of Guanling cattle by regulating miRNA，and a new entry point to molecular genetic improvement of local cattles inGuizhou.【Method】The experiment used TargetScan to predict the possible miRNA binding region and potential interac-tion miRNA at the 3-UTR of the bovine MSTN gene，and compared the physiological phenotype，expression differencesof MSTN gene and its 3-UTR end miRNAbetween Guanling cattle and different Guanling cattle hybrids，and then selectedbta-miR-27b to analyze its target site specificity in different Guanling cattle hybrid populations.After that，the MSTN gene3-UTR sequence wild type（WT）and the 3-UTR sequence mutant type（MUT）were cloned into a pMIR-REPORT Luci-54卷南 方 农 业 学 报 12360引言【研究意义】关岭牛（Bos taurus）是我国贵州省的特色畜牧品种之一，皮薄骨细、肉质鲜嫩，但产肉量较低（孙金魁等，2022），如何有效提高其产肉量是推进关岭牛养殖业健康发展的关键。为了兼顾肉质和产肉量，实际生产中通常将关岭牛与其他肉牛品种进行杂交，以获得优良的杂交后代，但该方法较繁琐且养殖成本较高。有研究表明，普通非双肌牛较双肌皮埃蒙特牛产肉量低的原因可能是普通牛肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）含量更高（Miretti etal.，2013），故推测MSTN基因是调控动物肌肉生长的重要基因。因此，分析关岭牛MSTN基因的表达调控关系，寻找与其密切相关的信号调控通路并应用于分子育种方案，对促进优良肉牛品种培育具有重要意义。【前人研究进展】MSTN是肌肉生长的负调节因子，其表达量下调或功能缺失，致使动物出现双肌现象，即肌纤维数量远高于正常个体（Kambadur etal.，1997；龙广丽等，2020）。有研究证实，MSTN基因敲除小鼠的体质量较正常小鼠增长3倍，且肩、臀部的肉质量明显增大，即MSTN基因直接影响动物的产肉性能（McPherron and Lee，2002）。至今，针对牛MSTN基因的研究较多。Azhar等（2020）研究表明，MSTN基因不同HAE II限制性位点的存在是亚齐牛基因多态性的原因，即MSTN基因可作为杂交选育的度量指标。Jakaria等（2021）利用分子生物学技术在不同牛的MSTN基因编码区（CDS）成功鉴定出4个SNPs位点，但这4个SNPs位点不是造成牛正常表型和双肌表型差异的主要原因；同时发现11 bp的碱基缺失会导致MSTN基因片段化。在动物的生长过程中，当蛋白需求不足时MSTN基因表达上调，抑制骨骼肌生长，进而将蛋白供应给代谢需要，这种内生肽关联调控存在于多种动物机体中（Gorssen et al.，2021；Tebbe et al.，2021）。此外，MSTN基因的转录和翻译过程受miRNA调控，miRNA含量对MSTN基因表达的影响较明显（Miretti et al.，2013）。miRNA是一类由DNA转录、长度在22个核苷酸左右的非编码单链RNA分子，miRNA与mRNA的3端非翻译区（3-UTR）的重复序列部分或完全互补，通过二者的相互作用能减弱mRNA的翻译能力或促使mRNA降解，在动植物中参与基因转录后的表达调控（Leeet al.，1993；杨敏等，2021；张小霞等，2022）。McFar-lane等（2014）研究表明，miR-27b能降低MSTN基因的表达，促进卫星细胞激活、成肌细胞增殖及防止肌肉萎缩。Zhang等（2018）研究证实，绵羊卫星细胞内高水平表达的miR-27b能降解MSTN基因mRNA，并抑制其翻译。Ge等（2020）研究发现，通过突变MSTN基因的3-UTR可创建1个mmu-miR-1/206靶点，与mmu-miR-206结合而阻断MSTN翻译，促进成肌细胞的增殖与分化。【本研究切入点】MSTN基因是肌肉生长的负调节因子，而miRNA能显著抑制MSTN基因表达，但miRNA是如何影响MSTN基因表达及是否具有靶向调控作用还有待进一步探究。【拟解决的关键问题】以关岭牛及其杂交牛群体为研究对象，通过双荧光素酶报告基因系统验证bta-miR-27b对MSTN基因的靶向调控关系，以期为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据，也为贵州地方黄ferase（H306）vector to form a dual-luciferase reporter gene vector，which co-transfected with bta-miR-27b in 293T cellsto verify the relationship between bta-miR-27b and MSTN gene expression.And the effects of bta-miR-27b on MSTN geneexpression were confirmed by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】Results showed that seven potential miRNAbinding sites were found at the 3-UTR end of MSTN gene.The relative expression levels of miRNAs（bta-miR-27a-3p，bta-miR-27b and bta-miR-128）of Guanling cattle hybrid breeds were extremely significantly higher than that of Guanlingcattle（P0.01，the same below），and the relative expression level of MSTN gene was extremely significantly lower thanthat of Guanling cattle.But their body weight，body height，body diagonal length，chest circumference and other growthindicators were greatly better than that of Guanling cattle.There were no mutations or losses in the bta-miR-27b bindingregion at 3-UTR end of MSTN gene in Guanling cattle and its hybrid cattle.The fluorescence value of 293T cells co-trans-fected with MSTN-3-UTR（WT）and bta-miR-27b mimics decreased by 53.80%，which was extremely significantly lowerthan that of MSTN-3-UTR（MUT）+bta-miR-27b mimics co-transfection.After transfection with bta-miR-27b mimics，bta-miR-27b was successfully overexpressed in Guanling cattle primary myoblast cell line（N2），while the relativeexpression of MSTN gene showed extremely significant downward trend，indicating that bta-miR-27b could inhibit MSTNgene expression.【Conclusion】The binding region of bta-miR-27b and MSTN gene is located at the 62-69 base of 3-UTR，and the target site is highly conserved.Bta-miR-27b has a strong target regulation effect on MSTN gene，indicating bybta-miR-27b can inhibit MSTN gene expression.Key words：Guanling cattle；MSTN gene；3 end untranslated region（3-UTR）；bta-miR-27b；dual-luciferase targetverificationFoundation items：National Science and Technology Support Program（2015BAD03B02-3）；Key Scientific Re-search Project of MajorAgricultural Industries in Guizhou（Qianjiaohe KY 2019 011）4期1237牛分子遗传改良工作提供新的切入点。1材料与方法1.1试验材料24月龄健康关岭牛、关岭牛西门塔尔牛杂交混池（关西杂）、关岭牛利木赞牛杂交混池（关利杂）、关岭牛安格斯杂交混池（关安杂）均由贵州关岭牛投资集团关岭牛产业园提供，每组公牛各3头，同时测量牛体质量、体高（地面至髻甲最高点）、体斜长（肩胛骨前缘到坐骨结后缘）、胸围（肩胛骨后缘胸部的圆周长度）及腹围。检疫合格后，颈静脉采血，以肝素钠抗凝管采集并颠倒混匀，防止凝集；同时屠宰采集第10根肋骨处的背最长肌组织。组织样品采集后使用液氮暂存，运回实验室后置于-80 冰箱保存备用。bta-miR-27b mimics（化学修饰的bta-miR-27b抑制剂）委托吉玛生物科技有限公司合成；关岭牛原代成肌细胞株（N2）通过胎牛背最长肌分离自培获得；293T细胞株由中国科学院细胞库提供；pMIR-REPORT Luciferase（H306）载体购自和元生物技术（上海）股份有限公司；血液基因组DNA柱式中量提取试剂盒（CW0541）购自康为世纪生物科技股份有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂（11668019）购自Invitrogen公司；胎牛血清（FBS，10270-106）、DMEM（C11965500BT）和Opti-MEM（31985-070）购自美国Gibco公司；胰酶（Trypsin-EDTA，0458）购自美国Amresco公司；双荧光素酶报告基因系统Dual-Luciferase Reporter Assay System（E1960）购自美国Promega公司。1.2miRNA靶点生物信息学分析及多态性检测通过TargetScan（http:/www.targetscan.org/vert_72/）预测牛MSTN基因3-UTR的miRNA结合位点，选取能与MSTN基因3-UTR端5-CUCAACAAUUUUGAAACUGUGAA-3区域结合的bta-miR-27b进行研究。在NCBI数据库中检索牛MSTN基因（NC_037329.1），使用Primer Premier 5.0设计引物（F：5-AGCCATAAAGGAAGAATCAAG-3和R：5-TAGGAATGGTAACCTGCGTAT-3），委托北京擎科生物科技股份有限公司合成。参照血液基因组DNA柱式中量提取试剂盒说明提取关岭牛总DNA，以紫外分光光度计检测总DNA浓度和纯度，-20 保存备用。PCR反应体系20.0 L：2Taq PCR Master Mix 10.0L，DNA模板1.0 L，上、下游引物各1.0 L，ddH2O7.0 L。扩增程序：95 预变性2 min；94 30 s，56 1 min，72 40 s，进行30个循环；72 延伸10 min，4 保存。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，合格样品送至北京擎科生物科技股份有限公司测序。1.3双荧光素酶报告分析将携带有bta-miR-27b结合位点的MSTN基因3-UTR序列野生型（Wild-type，WT）和3-UTR序列突变型（Mutant，MUT）片段分别克隆至pMIR-REPORTLuciferase（H306）载体开放阅读框（ORF）下游，命名为MSTN-3-UTR（WT）和MSTN-3-UTR（MUT）双荧光素酶报告基因载体。克隆成功的重组质粒转化大肠杆菌DH5感受态细胞，加入LB液体培养基，37 下恒温振荡（200 r/min）培养1 h。取50.0 L培养好的菌液均匀涂布在含氨苄抗生素的培养基上，挑取阳性转化子送至北京擎科生物科技股份有限公司测序，扩培测序成功的菌液用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒。复苏液氮冻存的293T细胞，接种于含1%双抗（卡那霉素和氨苄青霉素）和10%FBS的DEME培养基中（96孔细胞板），在37、5%CO2培养箱内培养1220 h，即细胞融合度达50%70%。将1.0 L LipofectamineTM2000转染试剂和49.0 L Opti-MEM混匀，得到含2%脂质体的转染稀释剂；再用转染稀释剂将构建的重组质粒与bta-miR-27b mimics混匀，共同转染293T细胞。每组设3个重复，转染后的293T细胞放入37、5%CO2培养箱内培养。共转染48 h后弃培养基，以100.0 L的PBS进行洗涤。96孔细胞板中每孔加100.0 L稀释的1PLB（Passive LysisBuffer），常温下裂解15 min。取裂解后各孔上清液5.0 L转移至白色不透光的96孔酶标板中，加入50.0 L的LAR II，混匀，通过瑞士帝肯多功能荧光酶标仪（Spark 10M）检测数据；再向每孔加入50.0 L预先混好的Stop&Glo试剂，混匀，通过荧光酶标仪检测荧光素酶活性（陈旺等，2020）。1.4细胞转染将培养好的N2细胞接种至6孔细胞板中，待细胞生长良好后参照LipofectamineTM2000转染试剂操作说明将bta-miR-27b mimics和bta-miR-27b mimicsNC（Negative control，阴性对照）分别转染N2细胞，以未转染任何载体的N2细胞为对照，每组设3个重复。1.5实时荧光定量PCR检测细胞、血液或组织样品加入液氮研磨成粉末，根据TRIzol试剂盒说明提取总RNA，再以反转录试剂盒反转录合成cDNA。在NCBI数据库中检索牛MSTN基因（NC_037329.1），使用Primer Premier 5.0设计实时荧光定量PCR扩增引物（表1）。以GAPDH和U6（U6是一类snRNA，主要形成小核核糖核蛋白卢贤君等：关岭牛MSTN基因3-UTR与bta-miR-27b的靶向验证54卷南 方 农 业 学 报 1238颗泣，定位于细胞核内）为内参基因，分别检测细胞中MSTN基因和miRNA的表达量。实时荧光定量PCR反应体系20.0 L：SYBR GreenMaster 10.0 L，cDNA模板1.0 L，上、下游引物（10 mol/L）各0.3 L，无RNA酶水8.4 L。MSTN基因扩增程序：95 预变性30 s；95 5 s，60 34 s，进行40个循环。miRNA扩增程序：95 预变性10 min；95 10 s，60 20 s，72 30 s，进行40个循环。每个样品设3个重复，通过2-Ct法换算目的基因相对表达量，并以GraphPadPrism 5.0进行统计分析及制图。2结果与分析2.1牛MSTN基因miRNA结合区域预测结果通过TargetScan预测得知，牛MSTN基因3-UTR端共有4个miRNA结合区域（图1）。1号结合区域的片段为5-CUCAACAAUUUUGAAACUGUGAA-3（划波浪线部分为核心区，包含2种不同长度的结合位点），能与3个miRNA相结合，分别是：bta-miR-27a-3p（3-GCCUUGAAUCGGUGACACUU-5）（单下划线表示8mer类型miRNA，即靶位点与成熟miRNA的第28位碱基精确匹配）、bta-miR-27b（3-CGUCUUGAAUCGGUGACACUU-5）和bta-miR-128（3-UUUCUCUGGCCAAGUGACACU-5）（双下划线表示7mer-A1类型miRNA，即靶位点与成熟miRNA的第27位碱基精确匹配）。其余的miRNA结合区域分别与miR-26、miR-29-3p及miR-23-3p相结合。2.2不同关岭牛杂交品种间的生理表型和基因表达差异选取24月龄的不同品种公牛，分别测量其体质量、体高、体斜长、胸围和腹围等与产肉量相关的生长指标，结果发现相同生长时期的杂交牛品种各项生长指标均优于关岭牛（图2-A和图2-B），其体质量差异极显著（P0.01，下同）。在生长表型较好的杂交牛品种中，与MSTN基因3-UTR端第1个miRNA结合域相关的3个miRNA相对表达量均极显著高于关岭牛（图2-C）。值得注意的是，在miRNA相对表达量较高的牛群体中MSTN基因相对表达量反而极显著降低（图2-D）。说明关岭牛的生长情况、MSTN基因及其3-UTR端相关miRNA三者间存在一定关联性，miRNA可能通过抑制MSTN基因表达进而促进牛的生长发育，故选取bta-miR-27b进行下一步研究。2.3miRNA靶点多态性检测结果利用从血液提取的DNA扩增MSTN基因3-UTR端bta-miR-27b结合区域，结果在关岭牛、关西杂牛混池和关安杂牛混池中成功扩增出对应目的基因条带（图3-A）。测序结果表明，关岭牛及其杂交牛MSTN基因3-UTR端bta-miR-27b结合区域均无突变、无缺失（图3-B）。2.4重组双荧光素酶载体构建情况为验证bta-miR-27b与牛MSTN基因3-UTR的靶向结合作用，构建MSTN-3-UTR（WT）和MSTN-3-UTR（MUT）双荧光素酶报告基因载体（图4-A），基因或miRNAGene or miRNAMSTNGAPDHbta-miR-27a-3pbta-miR-27bbta-miR-128U6引物序列Primer sequenceF：5-AGTCAAGGTAACAGACACAC-3R：5-CAGTTAGAGGGTAACGACAG-3F：5-GTCTTCACCACCATGGAGAA-3R：5-TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-3F：5-TTCACAGTGGCTAAGTTCCG-3F：5-TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC-3F：5-TCACAGTGAACCGGTCTCTTT-3F：5-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAT-3R：5-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3扩增片段长度（bp）Product length10117189退火温度（）Annealing temperature606060606060表 1实时荧光定量PCR扩增引物序列信息Table 1Primers sequences for real-time fluorescence quantitative PCR amplification图 1牛MSTN基因3-UTR端miRNA结合区域预测结果Fig.1Prediction of miRNAbinding region at the 3-UTR end of bovine MSTN gene外显子 Exon3-UTR的第6269位碱基 Base 62-69 at 3-UTRbta-miR-27a-3pbta-miR-27bbta-miR-1284期1239MSTN-3-UTR（MUT）共有23个碱基缺失。MSTN-3-UTR（WT）和MSTN-3-UTR（MUT）重组双荧光素酶报告基因载体转化DH5感受态细胞后提取其质粒DNA进行双酶切鉴定，结果（图4-B）显示，2个阳性克隆子 MSTN-3-UTR（WT）和MSTN-3-UTR（MUT）均在8000 bp附近出现1条明亮的条带 pMIR-RE-PORT Luciferase（H306）载体片段，且分别在6000和1500 bp附近各出现1条目的条带（泳道2和泳道4）。图 2不同关岭牛杂交品种的生理表型及基因相对表达量检测结果Fig.2Physiological phenotype and relative gene expression of different Guanling cattle hybrids*表示与关岭牛相比差异显著（P0.05），*表示与关岭牛相比差异极显著（P0.01）*indicated significant difference compared with Guanling cattle（P0.05），*indicated extremely significant difference compared with Guanlingcattle（P0.05）；MSTN-3-UTR（WT）与bta-miR-27bmimics共转染293T细胞后其相对荧光值下降53.80%，而MSTN-3-UTR（MUT）与bta-miR-27bmimics共转染后的相对荧光值仅下降21.34%，荧光值得到恢复。可见，MSTN-3-UTR突变后，bta-miR-27bmimics对MSTN基因的调控能力明显下降，即bta-miR-27b能通过预测结合位点有效结合MSTN基因3-UTR端，进而影响MSTN基因表达。2.6bta-miR-27b对MSTN基因表达量的影响以 bta-miR-27b mimics 和 bta-miR-27b mimicsNC分别转染N2细胞，转染48 h后提取细胞总RNA，通过实时荧光定量PCR检测bta-miR-27b和MSTN基因的相对表达量。如图6所示，转染bta-miR-27bmimics后，bta-miR-27b在N2细胞中成功超表达，其相对表达量极显著高于转染bta-miR-27b mimics NC及未转染任何载体的N2细胞。但bta-miR-27b相对表达量提高的同时，MSTN基因相对表达量呈极显著下调趋势，表明bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。3讨论MSTN基因与动物的产肉量密切相关，已有研究表明MSTN基因在牛、鱼、鸡、猪等动物中负向调控肌肉的生长发育，且在不同物种中存在丰富的多态性（李绍华等，2002；胡兰等，2003；唐永凯等，2010；梁春年等，2011）。Gill等（2010）研究发现，比利时种牛MSTN基因CDS区的碱基缺失导致双肌牛产生，且这种缺失提高了种牛的体质量、肩部背膘重、后腿重图 4MSTN-3-UTR（WT）和MSTN-3-UTR（MUT）双荧光素酶报告基因载体及其相关序列信息Fig.4MSTN-3-UTR（WT）and MSTN-3-UTR（MUT）double luciferase reporter gene vectors and their related sequence informationA：MSTN-3-UTR（WT）载体示意图；B：双荧光素酶报告基因载体双酶切结果 M：DL2000 DNAMarker；1：MSTN-3-UTR（WT）完整质粒；2：MSTN-3-UTR（WT）酶切产物；3：MSTN-3-UTR（MUT）完整质粒；4：MSTN-3-UTR（MUT）酶切产物；C：bta-miR-27b结合位点缺失序列（蓝色方框为一般序列）；D：bta-miR-27b结合位点5-CUCAACAAUUUUGAAACUGUGAA-3（红色方框为bta-miR-27b结合区域）A：MSTN-3-UTR（WT）vector map；B：Double enzyme digestion identification results of double luciferase reporter gene（M：DL2000 DNAMarker；1：MSTN-3-UTR（WT）plasmid；2：MSTN-3-UTR（WT）restriction product；3：MSTN-3-UTR（MUT）plasmid；4：MSTN-3-UTR（MUT）restric-tion product）；C：bta-miR-27b binding site deletion sequence（blue box in the figure was the normal sequence）；D：bta-miR-27b binding site5-CUCAACAAUUUUGAAACUGUGAA-3（red box was the binding region of bta-miR-27b）ABDCpMIR-REPORTLuciferase7957 bp4期1241图 5荧光素酶报告基因的表达情况Fig.5Luciferase reporter gene expressionH306-NC：pMIR-REPORT Luciferase（H306）载体单独转染；H306-miR：pMIR-REPORT Luciferase（H306）载体+bta-miR-27b mimics共转染；WT-NC：MSTN-3-UTR（WT）单独转染；WT-miR：MSTN-3-UTR（WT）+bta-miR-27b mimics共转染；MUT-NC：MSTN-3-UTR（MUT）单独转染；MUT-miR：MSTN-3-UTR（MUT）+bta-miR-27b mimics共转染。*表示差异极显著（P0.01）H306-NC：pMIR-REPORT Luciferase（H306）vector transfected cells；H306-miR：pMIR-REPORT Luciferase（H306）empty vector+bta-miR-27b mixed transfected cells；WT-NC：MSTN-3-UTR（WT）transfectedcells；WT-miR：MSTN-3-UTR（WT）+bta-miR-27b mixed transfectedcells；MUT-NC：MSTN-3-UTR（MUT）transfected cells；MUT-miR：MSTN-3-UTR（MUT）+bta-miR-27b mixed transfected cells.*indi-cated extremely significant difference（P0.01）1.51.00.50.0相对荧光值Relative fluorescence value*H306-NCH306-miRWT-NCWT-miRMUT-NCMUT-miR处理 Treatment和肌肉组成比例，极大提高了产肉量。本研究发现，关岭牛各系杂交品种的MSTN基因相对表达量极显著低于关岭牛，在体质量、体高、体斜长、胸围等生长指标上却明显优于关岭牛，进一步佐证了MSTN基因与动物产肉量间的关系。TargetScan预测得知，牛bta-miR-27b的结合位点位于MSTN基因3-UTR端第6269位碱基处，该结合位点还能与bta-miR-27a-3p和bta-miR-128结合。Han等（2013）研究发现新西兰绵羊MSTN基因3-UTR存在5个突变位点；Miretti等（2013）对NCBI数据库中已公布的哺乳动物MSTN基因3-UTR序列进行比对，结果发现哺乳动物MSTN基因3-UTR存在miR-27b结合位点，且该位点具有高度互补性和序列保守性。本研究通过对关岭牛杂交群体MSTN基因3-UTR端的bta-miR-27b结合区域进行测序分析，结果发现bta-miR-27b在关岭牛MSTN基因3-UTR的结合区域无突变、无缺失，进一步佐证了该结合位点的保守性。最新研究表明，在鸡胚生长发育过程中MSTN基因是miR-27b-3p的靶标，参与调控成肌细胞增殖与分化（Zhang et al.，2021）。在皮埃蒙特牛中，bta-miR-27b的表达量与其双肌表型直接相关，MSTN基因可通过反馈调节机制调控bta-miR-27b表达（Rachagani et al.，2010）。本研究为验证牛MSTN基因与bta-miR-27b间的作用关系，合成MSTN-3-UTR（WT）序列并将其克隆至pMIR-REPORT Luciferase（H306）载体，然后与bta-miR-27b mimics共转染293T细胞，同时利用pMIR-REPORT Luciferase（H306）载体和MSTN-3-UTR（MUT）双荧光素酶报告载体进行对比，结果发现bta-miR-27b能有效结合MSTN基因3-UTR端，说明MSTN基因与bta-miR-27b存在靶向作用关系。Miretti等（2013）研究表明，在psi-CHECK2载体上miR-27b调控MSTN基因表达，通过快速多点图 6转染bta-miR-27b mimics和bta-miR-27b mimic NC后N2细胞中bta-miR-27b与MSTN基因的表达变化Fig.6Expression of bta-miR-27b and MSTN genes in N2 cells transfected with bta-miR-27b mimics and bta-miR-27b mimic NC*表示与转染bta-miR-27b mimic NC处理间存在极显著差异（P0.01）*indicated that there was extremely significant difference with bta-miR-27b mimic NC transfection treatment（P0.01）AMSTN基因相对表达量Relative expression ofMSTNgen