基于网络药理学研究复方精油治疗颈肩痛的关键活性成分及透皮吸收性能.pdf

544药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）基于网络药理学研究复方精油治疗颈肩痛的关键活性成分及透皮吸收性能邱晓雨1，金浩鑫2，吴东2，黄文平2，曾文辉3，龚建平1,21.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006；3.江西省药品检查员中心，江西 南昌 330029摘要：目的 探究复方精油（艾叶、没药、乳香、肉桂、干姜、毛冬青精油混合）对颈肩痛的活性成分、作用机制及透皮吸收性能。方法 参照中国药典通则挥发油测定法提取药材的挥发油成分并按比例配制成复方精油，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）结合文献数据对复方精油成分进行分析鉴定；以网络药理学探究对颈肩痛的作用成分及靶点，采用 Franz 扩散池法考察复方精油的透皮吸收性能。结果 通过 GC-MS 分析结合文献筛选补充得到 77 个主要成分进行网络药理学分析，预测得到其潜在镇痛靶点 46 个；通过网络拓扑筛选获得核心靶点 11 个；KEGG 分析表明复方精油多通路治疗颈肩痛。体外透皮试验结果显示，复方精油中的指标成分桉油精、樟脑、龙脑的 24 h 累计透过量分别为 297.661、811.586、403.128 g/cm2，释放数据均符合零级方程和 Higuchi 方程。结论 复方精油中多种活性成分能够作用于 TRPV1（辣椒素受体）、PTGS2（前列腺素内过氧化物合成酶 2）、IL1B（重组人白介素 1）、TNF（肿瘤坏死因子）等靶点，并通过多通路起治疗颈肩痛作用，透皮吸收具有控缓释效果。关键词：颈肩痛；投药,皮肤；精油；网络药理学；芳香疗法；气相色谱-质谱联用 DOI:10.19939/ki.1672-2809.2023.05.06Active Ingredients and Transdermal Behavior of Mixed Volatile Oils in the Treatment of Neck and Shoulder Pain Based on Network PharmacologyQIU Xiaoyu1,JIN Haoxin2,WU Dong2,HUANG Wenping2,ZENG Wenhui3,GONG Jianping1,21.Jiangxi University of Chinese Medicine,Nanchang Jiangxi 330004,China;2.Solid Preparation of Traditional Chinese Medicine Manufacturing Technology National Engineering Center,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang Jiangxi 330006,China;3.Jiangxi Drug Inspector Center,Nanchang Jiangxi 330029,China.Abstract:Objective To explore active ingredients,mechanism and transdermal behavior of mixed volatile oils on shoulder pain.Methods Extraction of volatile oils according to Chinese Pharmacopoeia,the constituents in volatile oil were characterized qualitatively by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS),and supplement them by literature data.Exploring the components and targets of action on neck and shoulder pain by network pharmacology.The behavior of mixed volatile oils were investigated by Franz diffusion cell method.Results Combined with literature data supplement to obtain 77 major components for network pharmacological analysis,46 related targets were predicted,11 core targets were obtained by network topology screening,KEGG analysis shows multiple access to compound essential oils for neck and shoulder pain.The results of in vitro transdermal tests showed that the 24 h cumulative permeation amounts of eucalyptus oleoresin,camphor and lobster,the index components of the compound essential oil,were 297.661,811.586 and 403.128 g/cm2,respectively,and the release data were in accordance with the zero-level equation and the Higuchi equation.Conclusion The active ingredients in mixed volatile oils regulate multiple signaling pathways to ameliorate inflammation and pain through TPPV1,PTGS2,IL1B,and TNF,transdermal absorption has a controlled slow release effect.Key words:Neck and shoulder pain;Administration,cutaneous;Essential oils;Network pharmacology;Aroma therapy;GC-MS基金项目:江西省重大科技研发专项（20194ABC28009）；江西省药品监督管理局科研项目（2022JS31）作者简介：邱晓雨，硕士。研究方向：中药制剂研发。E-mail:xiaoyu_通信作者：龚建平，教授。研究方向：保健食品及功能性食品研发。E-mail:颈肩痛是指颈、肩、肩胛等处的疼痛，伴有一侧或两侧上肢痛、颈脊髓损害症状等，主要源于颈椎病、肩周炎等疾病1。颈肩痛的治疗方式包括手术治疗和非手术治疗2。大多数患者选择非手术治疗，主要分为药物治疗、推拿手法治疗、针灸治疗、牵引治疗等3-6。目前暂无针对颈肩痛的特效药，临床上主要应用消炎镇痛药物如阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸等，此类药物可有效镇痛，但长期服用对胃肠道、心血管、神经系统、肝脏、肾脏545药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）等有不良反应7，且随着疼痛加重服药剂量也随之增加。芳香疗法是一种替代疗法，主要使用精油通过推拿按摩的方式进行治疗，可缓解疲劳、疼痛等症状8。中药精油的止痛作用近年来颇受关注，并展现出多种治疗疼痛效果，如痛经、偏头痛、颈椎痛等9，而精油多来源于具有活血化瘀、通经止痛等功效的中药。精油治疗颈肩痛多选用经皮给药的给药方式10。研究发现两种或者多种不同中药精油组合得到的复合中药精油递释系统相较于单一中药精油的生物活性可显著增强11。本实验研究选取包括艾叶、没药、乳香、肉桂、干姜及冬青六种精油组成复方精油，文献12-14报道上述六种精油主要含有成分为 1,8-桉叶素（桉油精）、-姜黄烯、蒎烯、D-莰烯、芳樟醇、肉桂醛等。而研究15表明颈肩痛的发病机制与外周敏化和中枢敏化有关，钾离子、钠离子、5-羟色胺、ATP 等炎性介质激活花生四烯酸通路引发痛敏反应，此外颈肩痛和神经源性炎症也有关系16。“网络药理学”是一门运用网络方法分析药物与疾病和靶点之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系的药理分析手段17。因此，本研究将以网络药理学探究对颈肩痛的作用成分及靶点，并结合气相色谱-质谱（GC-MS）技术鉴定复方精油的化学成分，最后选取指标成分以 Franz 扩散池法考察透皮吸收性能。以期探究复方精油治疗颈肩痛的主要靶点和通路，为深入研究精油经皮给药提供参考。1 材料1.1 动物KM 小鼠，1822 g，雌雄各半，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2022-0004。1.2 药材与试剂艾叶（批号 20211106）、乳香（批号 20210405）、没药（批号 20210504）、肉桂（批号 20211009）、干姜（批号 20211211）、冬青（批号 20210608）药材均购于江西一方药业有限公司。乙酸乙酯（中国医药集团有限公司）；无水硫酸钠（上海罗恩试剂有限公司）；甲醇（中国医药集团有限公司）。对照品：桉油精对照品（批号 110788-201506,含量 98.4%），樟脑对照品（批号 110747-201409,含量 98.7%）购买于中国食品药品研究院。龙脑对照品（批号 DST210312-194,含量 98.0%）购买于成都乐美天医药科技有限公司。1.3 仪器Agilent 7890B-7000D 三重四级杆气相质谱仪，KDM 型控温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器），Agilent 6890N 气相色谱仪，TG328A 十万分之一天平（北京赛多利斯仪器），TP-6 型智能透皮扩散仪及垂直式 Franz 型扩散池（天津精拓仪器科技），HC-3016R 高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器）。2 方法与结果2.1 挥发油的提取参照 2020 年版中国药典通则 2204 挥发油测定法提取，以得油量为指标单因素考察料液比、浸泡时间、蒸馏时间对提取量的影响，得到最佳提取工艺参数，见表 1。表1 药材最佳提取工艺参数药材料液比浸泡时间/h提取时间/h得油量/mL干姜1001 200251.7乳香100600452.55冬青100800440.18艾叶501 200430.5没药100800357.3肉桂1001 000441.92.2 复方精油的 GC-MS 分析2.2.1 色谱条件 气相条件：分流模式，分流比为21；载 气 流 速，1.0 mL/min；色 谱 柱，Agilent VF-WAXms 30 m250 L0.5 m；程序升温，初始温度40，保持2 min，以3/min升温至180，再以 5 /min 升温至 250，保持 5 min；传输线温度为 260 ；进样量为 1 L；载气为氦气。质谱条件：Scan 全扫描模式；溶剂延迟：3.5 min；离子源温度：230 ；电子能量：70 eV；扫描范围：15650 m/z。2.2.2 GC-MS 分析 GC-MS 测定复方精油中的化学成分，总离子流见图 1。结合文献资料解析，鉴定出化学成分 75 个，占比最高的是桉油精、反式肉桂醛、丁香酚、芳樟醇、-姜黄烯、莪术烯、樟脑、蒈烯、莰烯等。2.3 网络药理学探讨2.3.1 精油成分及颈肩痛靶点筛选 基于 GC-MS定性成分和已发表的文献报道，并通过 TCMSP 数据库、HERB 数据库补充收集复方精油成分。基546药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）于精油的经皮给药特点和里宾斯基五规则，ALogP是反映生物膜之间通透性的主要物理化学参数之一18，以 1ALog P5 为指标，筛选精油的目标活性靶点。以“Cervical Syndrome 颈椎综合征”“Myalgia 肌痛”“Neck Pain 颈部疼痛”“Pain Syndrome Myofascial疼痛综合征肌筋”“Shoulder Pain 肩部疼痛”为颈肩痛相关的疾病关键词，通过挖掘 GeneCards 数据库、OMIM 数据库、Drugbank 数据库、DisGeNET 数据库获取颈肩痛的疾病靶点。结果显示筛选后活性成分共 77 种，导入 Uniprot蛋白质数据库合并删除重复值后共 183 个化合物靶点和 1 126 个疾病靶点。2.3.2 中药精油-成分-靶点网络的构建 将药物疾病交集靶点及成分输入 Cytoscape3.9.1 软件得到网络图，见图 2。图1 复方精油的GC-MS总离子流图图2 中药-活性成分-靶点网络时间/min响应值/mAU547药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）2.3.3 中药精油成分-颈肩痛疾病靶点 PPI 网络构建 将成分靶点与疾病靶点做 Veen 图汇集得到共同靶点 46 个，见图 3。导入 STRING 数据库，将生物种类设定为“Homo sapiens”，得到核心靶点，见图 4。图3 活性成分和疾病靶点的Venn图图4 核心靶点2.3.4 中药精油-颈肩痛疾病靶点功能与通路的富集分析 在 Metascape 的基因面板中导入关键靶点，物种限定设置为“Homo sapiens”，进行 GO 富集分析和KEGG 信号通路富集分析。分析时设置 P0.01，重叠值（Overlap）3，富集值（Enrichment）1.5。分析获得 974 个 GO 功能条目，选取排名前 10的条目绘制 GO 功能分析图，见图 5。在生物过程（biological process，BP）中，涉及对异种刺激的反应，循环系统过程、血液循环、细胞对氮化合物的反应，对细胞外刺激的反应等；在细胞组分（cellular component，CC）中，涉及膜筏、膜微区、质膜筏、小窝突触膜等；在分子功能（molecular function，MF）中，涉及 G 蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素受体活性、金属离子跨膜转运蛋白活性、1-肾上腺素能受体活性等。KEGG 通路富集分析得到化学致癌-受体激活、脂质和动脉粥样硬化、5-羟色胺能突触、神经活性配体-受体相互作用、cGMP-PKG 信号通路、IL-17 信号通路、TRP 通道的炎症介质调节、胆碱能突触、花生四烯酸代谢、细胞色素 P450 对异生素的代谢、cAMP 信号通路类风湿关节炎等相关信号通路，见图 6。图5 潜在靶点的GO富集分析图6 潜在靶点的KEGG通路富集分析2.4 复方精油 GC 含量测定2.4.1 气相色谱条件 采用 HP-5（0.32 mm30 m 0.25 m）毛细管色谱柱，以氮气为载气，程序升温，初始温度为 90，保持 2 min；以 5 /min 上升到 110 ；再以 10 /min 上升到 150，保持10 min。检测器温度为 250，进样口温度 200，进样量 1 L，分流比为 51。2.4.2 方法学考察 专属性考察：取空白溶剂、供试品透皮接收液和含桉油精 157.792 g/mL、樟脑479.68 g/mL、龙脑 468.48 g/mL 的混合对照品溶548药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）液，按“2.4.1”色谱条件进样检测。结果如图 7 所示，空白溶剂没有干扰测定。A响应值/pA时间/minB时间/min响应值/pAC时间/min响应值/pA图7 色谱图：A.空白溶剂，B.混合对照品溶液，C.供试品透皮接收液 线性考察：精密量取混合对照品溶液，加乙酸乙酯稀释为系列质量浓度的溶液，分别按“2.4.1”项下色谱条件进样分析。以质量浓度 X 为横坐标，峰面积 Y 为纵坐标，进行线性回归。结果表明，桉油精、樟脑、龙脑在表 2 所示的质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。表2 线性关系考察结果成分线性方程r线性范围/（g/mL）樟脑Y=3.769 9X-36.9210.999 914.99479.68龙脑Y=3.410 2X-32.5560.999 914.64468.48桉油精Y=3.990 8X-10.155 0.999 74.931157.792精密度考察：取含樟脑 479.68 g/mL、龙脑468.48 g/mL、桉油精 157.792 g/mL 的混合对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件，平行进样 6 次，结果表明，桉油精、樟脑、龙脑峰面积的 RSD 分别为 1.20%、0.53%和 0.87%，表明仪器精密度良好。稳定性考察：取同一接收液样品，按“2.4.1”色谱条件下分别于 0、2、4、8、12、24 h 时进样分析，结果显示，桉油精、樟脑、龙脑的峰面积 RSD分别为 3.84%、1.78%、3.47%，表明样品在 24 h 内稳定。2.5 体外透皮吸收考察2.5.1 小鼠离体皮肤的制备 用脱毛膏除掉小鼠腹部体毛，小鼠处死后立即剪下腹部皮肤，将皮肤附带的脂肪和皮下组织清理干净，用生理盐水小心清洗并擦干多余水分，再用锡箔纸包裹后放置-20 冷冻保存，备用。2.5.2 Franz 扩散池试验 将转子置于接收池中，量取 15 mL 空白接收液（无水乙醇和生理盐水以 37的比例混合，超声 10 min 即得）加入。将冷冻保存的小鼠离体皮肤放入生理盐水中浸泡 30 min，取出后用滤纸吸干水分，剪成适当大小，真皮层朝向接受池平铺，夹紧固定且排尽气泡。精密吸取 1 mL复方精油样品，置于鼠皮上并用封口膜将释放池封闭，平行六组。智能透皮试验仪循环水浴温度 37.5，搅拌速度为300 r/min，预平衡30 min。在计时开始后的第1、2、4、6、8、10、12、24 h 精密吸取接收液 1 mL，并补充 1 mL 空白接收液。将所取的接收液 4 低温离心 20 min 后加入 1 mL 乙酸乙酯萃取，静置取上清液用 0.22 m 有机滤膜滤过，置于进样小瓶中，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，并计算指标成分桉油精、樟脑和龙脑的累积透过量 Qn（g/cm2）。计算公式为：?11/niQnVCnCiViA=+?其中：Qn 为第 n 个时间点单位面积的累积透过量（g/cm2），Cn、Ci 分别为第 n、i 个时间点测得的药物质量浓度（g/mL），V 为接收液加入体积（15 mL），Vi 为每次取样体积（1 mL），A 为有效透皮面积（1.13 cm2）。以累积透过量 Qn 为纵坐标，时间 t 为横坐标作图，结果见图 8。将数据分别用零级方程、一级方程、Higuchi 方程拟合19。结果显示三种指标成分均符合零级方程和 Higuchi 方程，表明复方精油具有缓控释效果。549药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）时间/h累积透过量/（g/cm2）图8 桉油精、樟脑、龙脑的累积透过量 对三种指标成分的 Qn-t 曲线中的直线部分进行线性回归，求出的直线斜率即为稳态透皮速率（Js）20。由表 3 结果可知，桉油精、樟脑、龙脑在复方精油中的透皮速率分别为 34.442、88.515、35.213 gcm-2h-1。表3 指标成分的渗透动力学参数成分线性方程Q24/（g/cm2）Js/（gcm-2h-1）桉油精Y=34.442X-19.54297.66134.442樟脑Y=88.515X+10.722811.58688.515龙脑Y=35.213X+76.109403.12835.2133 讨论精油具有高渗透性、代谢快、不滞留，毒性小，又易于透过血脑屏障的优点21，可广泛适用于颈肩痛患者。中药精油的止痛作用机制是通过多种途径实现的，有研究表明芳樟醇可促进神经递质抑制剂的增加起到调节中枢来达到缓解慢性疼痛的作用22，-蒎烯能阻止 NF-B 炎症通路的传导和白细胞介素-6（IL-6），肿瘤坏死因子-（TNF-），一氧化氮 NO 的释放达到抗炎镇痛的作用23；桉油精通过调节氧化应激和抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）生成，从而减轻疼痛24；樟脑的镇痛作用则其可能与作用于 TRPV1 通道有关25。通过 GC-MS 分析与网络药理学预测结果所得的治疗颈肩痛的关键活性成分基本重合。活性成分通过抑制 5-羟色胺（5-HT）、-氨基丁酸（GABA）的释放调节中枢神经以此镇痛；抑制炎症因子 NO、IL-6、TNF-的合成释放从而抗炎镇痛；抑制环氧合酶-2（COX-2）的表达缓解疼痛。选取桉油精、樟脑和龙脑作为指标性成分，透皮试验结果显示释放数据均符合零级动力学方程和Higuchi 方程，表明复方精油的体外透皮行为均具有缓释作用。综上所述，复方精油通过多种成分和靶点相互调节治疗颈肩痛的发作机制，且透皮吸收具有控缓释效果。为进一步研究精油的止痛作用和剂型研究提供参考。参考文献1 吴在德,吴肇汉.外科学 M.8 版.北京:人民卫生出版社,2013:872-873.2 DEVARAJA K.Approach to cervicogenic dizziness:a comprehensive review of its aetiopathology and management J.Eur Arch Otorhinol,2018,275(10):2421-2433.3 黄立莉,陈泽林,钟红英,等.中医药治疗颈性眩晕的研究进展 J.中医临床研究,2018,10(18):39-41.4 胡零三,詹红生,熊轶喆,等.詹红生诊治颈椎病经验 J.上海中医药杂志,2018,52(7):26-28.5 周建伟,蒋振亚,叶锐彬,等.针灸推拿为主治疗神经根型颈椎病:多中心随机对照研究 J.中国针灸,2006,26(8):537-543.6 叶秀兰,唐占英,胡志俊,等.“整颈三步九法”治疗颈椎病多中心随机对照临床研究 J.上海中医药杂志,2012,46(4):47-49.7 易洁梅,岑宁,黄小英.镇痛药在慢性非癌痛中的应用分析 J.今日药学,2009,19(4):17-19,11.8 付勇,黄小英,章海凤,等.芳香推拿治疗交感神经型颈椎病:随机对照研究 J.江西中医药大学学报,2021,33(1):68-71.9 许攀,沈倩,杨明,等.中药精油止痛研究进展 J.中国实验方剂学杂志,2021,27(17):211-216.10 王锐,张贝贝,杨婧,等.经皮给药系统中促渗方法的研究进展 J.中华中医药杂志,2021,36(5):2855-2858.11 吴意,万娜,刘阳,等.基于递释系统改善中药精油稳定性及其在医药领域的应用研究 J.中国中药杂志,2022,47(3):603-610.12 LI X J,YANG Y J,LI Y S,et al.-pinene,linalool,and 1-octanol contribute to the topical anti-inflammatory and analgesic activities of frankincense by inhibiting COX-2 J.J Ethnopharmacol,2016,179:22-26.13 KHAN A,VAIBHAV K,JAVED H,et al.1,8-cineole(eucalyptol)mitigates inflammation in amyloid Beta toxicated PC12 cells:relevance to Alzheimers disease J.Neurochem Res,2014,39(2):344-352.14 艾勇,朱思阳,艾艳.肉桂挥发油的提取方法与抗炎镇痛作用研究 J.广东化工,2020,47(15):50-53,56.15 YUAN R F,ZHANG D K,YANG J H,et al.Review of aromatherapy essential oilstheir mechanism of action against migraines J.J Ethnopharmacol,2021,265:113326.DOI:10.1016/j.jep.2020.113326.16 何勇,刘威,王大明,等.肩周炎疼痛机制研究进展 J.中国运动医学杂志,2016,35(10):987-990.17 HOPKINS A L.Network pharmacology J.Nat Biotechnol,2007,25(10):1110-1111.18 王春柳,万兆新,周洁,等.艾叶挥发性成分对膝骨关节病作用机制的网络药理学探讨 J.世界中医药,2021,16(20):2975-2979.19 叶玉杰,李芳,任德全,等.Origin 软件拟合制剂体外释药规律的应用 J.数理医药学杂志,2014,27(1):93-94.20 管咏梅,胡育森,刘佳,等.混合组分挥发油纳米乳的处方筛选550药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）夏枯草乙酸乙酯提取物对一氧化氮合酶作用的研究郑洋滨，洪燕，龚玮，周年，刘宁江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029摘要：目的 研究夏枯草乙酸乙酯提取物对人脐静脉内皮细胞融合细胞（EAhy926）中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的作用。方法 体外培养 EAhy926，将其分为夏枯草乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组和阴性对照组，分别用31.20、15.60、7.80 g/mL 夏枯草乙酸乙酯提取物和 5 DMSO 的培养基孵育 24 h。通过试剂盒检测一氧化氮（NO）和eNOS 含量。采用 Western blot 检测 eNOS、磷酸化内皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）、热激蛋白 90（HSP-90）、窖蛋白-1（Cav-1）的表达。结果 试剂盒结果显示中、高剂量组细胞内 NO 和 eNOS 含量高于阴性对照组，差异有统计学意义（P0.05）。Western blot 结果显示中、高剂量组 eNOS 和 HSP-90 的蛋白表达高于阴性对照组，Cav-1 的蛋白表达低于阴性对照组，差异有统计学意义（P0.05）；高剂量组 p-eNOS 的蛋白表达高于阴性对照组，差异有统计学意义（P0.05）。结论 夏枯草乙酸乙酯提取物通过增加血管内皮细胞内 eNOS、p-eNOS 的表达，增加 NO 释放；此外，其还能提高 HSP-90 的蛋白表达，降低 Cav-1 的蛋白表达，促进 eNOS 释放 NO，从而舒张血管，降低血压。关键词：夏枯草属；乙酸乙酯；一氧化氮合酶；磷酸化一氧化氮合酶；热激蛋白；窖蛋白-1DOI:10.19939/ki.1672-2809.2023.05.07Effect of Ethyl Acetate Extract of Prunella Vulgaris on Nitric Oxide SynthaseZHENG Yangbin,HONG Yan,GONG Wei,ZHOU Nian,LIU NingJiangxi Institute for Drug Control,NMPA Key Laboratory of Quality Evaluation of Traditional Chinese Patent Medicine,Jiangxi Province Engineering Research Center of Drug and Medical Device Quality,Nanchang Jiangxi 330029,China.Abstract:Objective To study the effects of ethyl acetate extract of prunella vulgaris on endothelial nitric oxide synthase(eNOS)synthesis by human umbilical vein endothelial cells(EA hy926).Methods EA hy926 were cultured in vitro and divided into high,medium and low dose groups of prunella vulgaris ethyl acetate extract and negative control group,31.20,15.60,7.80 g/mL ethyl acetate extract of prunella vulgaris and 5 DMSO were incubated for 24 hours.Detect the content of nitric oxide(NO)and eNOS through the kit.The expressions of eNOS,phosphorylated endothelial nitric oxide synthase(p-eNOS),heat shock proteins 90(HSP-90)and caveolin-1(Cav-1)were detected by Western blot.Results The results of the kit showed that the contents of intracellular NO and eNOS in the medium and high dose groups were higher than those in the negative control group,and the difference was statistically significant(P0.05).Western blot results showed that the protein expression of eNOS and HSP-90 in the medium and high dose groups was higher than that in the negative control group,and the protein expression of Cav-1 was lower than that in the negative control group,the difference was statistically significant(P0.05);the protein expression of p-eNOS 基金项目：江西省药品监督管理局科研项目（2019JS39）作者简介：郑洋滨，硕士，主管药师。研究方向：药包材生物项目检验。E-mail:通信作者：刘宁，硕士，主任药师。研究方向：药包材生物项目检验。E-mail:与体外透皮性能研究 J.中国医药工业杂志,2020,51(11):1410-1417.21 王雅琪,杨园珍,伍振峰,等.中药挥发油传统功效与现代研究进展 J.中草药,2018,49(2):455-461.22 NATHALIA N D,ALINEA E,DAIANA C S,et al.Lavandula angustifolia essential oil inhalation reduces mechanical hyperalgesia in a model of inflammatory and neuropathic pain:the involvement of opioid and cannabinoid receptors-ScienceDirectJ.Journal of Neuroimmunology,2020,15(340):577145.23 KIM D S,LEE H J,JEON Y D,et al.Alpha-pinene exhibits anti-inflammatory activity through the suppression of MAPKs and the NF-B pathway in mouse peritoneal macrophages J.Am J Chin Med,2015,43(4):731-742.24 LEE G G,PARK J B,KIM M S,et al.Analgesic effects of eucalyptus essential oil in miceJ.Korean J Pain,2019,32(2):79-86.25 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