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2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 基于数据挖掘和实验验证探讨舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚腰椎管狭窄症的作用机制冯蓬1，李路广1，李建国1，覃仁安2，刘海英2，高景华1，孙东2（1.中国中医科学院望京医院 北京 100020；2.广州白云山陈李济药厂有限公司 广州 510220）摘要：目的结合数据挖掘和实验验证，探讨舒筋健腰丸抑制黄韧带肥厚的作用机制。方法借助TCMSP和TCMID数据平台筛选舒筋健腰丸的有效活性成分和靶点，利用GEOquery包获取GEO数据库中黄韧带肥厚腰椎管狭窄症的差异表达蛋白芯片数据，提取药物与疾病的共同靶点，利用STRING数据库构建蛋白质相互作用网络，利用Cytoscape 3.7.1软件对关键靶点进行网络拓扑学分析。再利用DAVID在线工具对核心靶点进行GO富集分析和KEGG信号通路分析，以探究舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚腰椎管狭窄症可能的分子机制和关键靶点。建立大鼠黄韧带肥厚模型，随机将大鼠分为正常组、模型组、氯磷酸盐组（阳性药物组，Clodronate Liposomes，5 mgmL-1，每次0.5 mL）和中药组（60 kg人用药等效剂量，1.5 gkg-1d-1），采取预防性灌胃给药策略，于造模8周后取材。利用HE和Masson染色从组织病理学角度评估对舒筋健腰丸黄韧带肥厚的干预作用，利用免疫组化法检测PPI网络中关键蛋白表达。结果网络药理学方法筛选出舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚的靶点77个，利用网络拓扑参数筛选出关键蛋白TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1。GO富集和KEGG通路分析表明该药可能通过炎症因子的调控、细胞外基质调节和胶原蛋白的分泌等发挥作用。通过HE和Masson染色，与模型组相比，中药组显著抑制大鼠肥厚黄韧带的病理产物堆积，抑制其胶原容积分数增高（P0.05），但其抑制作用不及氯磷酸盐组（P0.05）；通过免疫组化分析，与模型组相比，中药组能够显著抑制关键蛋白TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1的表达（P0.05）。结论舒筋健腰丸可能通过抑制TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1蛋白的表达发挥干预黄韧带肥厚腰椎管狭窄症的作用。关键词：舒筋健腰丸 数据挖掘 组织病理学 黄韧带 纤维化 炎症反应doi:10.11842/wst.20220510010 中图分类号:R285.5 文献标识码:A腰椎管狭窄症（Degenerative lumbar spinal stenosis，DLSS）是骨科难治性疾病，该病已成为全球范围内引起中老年人群腰腿痛和活动功能受限的主要原因之一1。在我国人口老龄化的大背景下，该病在日益严重威胁中老年人群的生活质量和身心健康的同时，也给社会、医疗造成巨大的负担。临床中，黄韧带肥厚腰椎管狭窄症较为常见，其典型临床症状为腰腿疼痛伴间歇性跛行。黄韧带肥厚可以压缩50%-80%的腰椎管有效容积，可伴随急、慢性炎症反应，继发疼痛和组织水肿，是DLSS的重要病理因素之一2-3。黄韧带肥厚导致腰椎管狭窄是一个缓慢进展且涉及复杂病理机制的过程，这种退行性疾病严重限制了患者的腰椎功能、行走能力和生活质量，并已成为脊柱手术最常见的适应症之一4。收稿日期：2022-05-10 修回日期：2022-10-06 中国中医科学院望京医院院级科研课题（2021-HX-7）：基于TGF-1/PI3K/AKT通路研究舒筋健腰丸调控黄韧带成纤维细胞增殖、凋亡在黄韧带肥厚中的作用机制，负责人：高景华。通讯作者：高景华，教授，主任医师，博士研究生导师，主要研究方向：退行性脊柱疾患的诊断及中医疗法的研究；孙东，主管中药师，广州白云山陈李济药厂有限公司总经理，主要研究方向：中药学研究。952 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药数据研究黄韧带肥厚腰椎管狭窄症的主要致病因素为黄韧带病理性肥厚，其主要表现为：弹性蛋白减少，胶原蛋 白 增 多，病 理 产 物 堆 积，胶 原 容 积 分 数 增 大（Collagen volume fraction，CVF），细胞外基质沉积、重塑，伴随大量炎性细胞和炎症因子浸润5-7。正常黄韧带是一种弹性结构，细胞外基质成分较为稳定，包含约80%的弹性蛋白和20%的胶原蛋白，其CVF稳定在20%左右8。然而现有证据表明，随着黄韧带肥厚的进展，其表现出病理产物堆积，CVF增大，提示纤维化改变5。黄韧带的主要功能为维持椎体间的稳定性和限制脊柱前屈。因此，当椎体节段性失稳时，则有可能造成黄韧带的损伤，激活炎症反应和组织损伤修复程序，诱发疼痛刺激和纤维化6。而纤维化的黄韧带弹性下降，韧性增加，弹性纤维受力更容易发生断裂，继而恶性循环，逐渐增厚，直至挤压神经纤维，引发疼痛刺激。因此，对该恶性循环进行干预，改善临床症状，抑制炎症和疼痛刺激，抑制椎管有效容积进一步压缩，减少手术介入，具有重要意义。舒筋健腰丸是全国中药行业著名的老字号“陈李济”自主研制的纯中药复方制剂，具有补益肝肾、强健筋骨、驱风除湿、活络止痛的功效。研究团队前期开展了舒筋健腰丸的多中心、随机、对照临床研究，观察了舒筋健腰丸治疗黄韧带肥厚DLSS的临床疗效。结果表明，在舒筋健腰丸治疗黄韧带肥厚DLSS四周后，患者的腰膝酸痛VAS评分、中医证候总积分、间歇性跛行距离较治疗前均有显著改善（P0.05），其具有明确的临床疗效9-10。在基于主动监测的真实世界临床研究中，舒筋健腰丸上市后有效性和安全性评价也得到了大样本循证支持11。舒筋健腰丸临床应用专家共识 中也对该药物临床应用有效性给予了肯定，并提供了该药物的临床应用指导和参考11-12。然而鉴于舒筋健腰丸具有多成分、多途径、多靶点作用的特点，目前该方干预黄韧带肥厚DLSS的物质基础、作用机制及作用环节仍缺乏探索。数据挖掘、网络药理学等技术近年来逐步发展，是初步筛选中药有效活性成分和预测方剂多组分治疗机制的有效方法，与实验验证结合能够为中药复杂成分机制探索提供方向13-14。因此，本研究结合数据挖掘和实验研究，探索舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚DLSS的作用机制。1 材料 1.1动物8周龄SPF级雄性SD大鼠40只，体质量220-250 g，购于中国食品药品鉴定研究院（北京大兴），实验动物生产许可证号：SCXK（京）2017-0005。实验动物均饲养于中国中医科学院动物房，动物饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供。实验室保持通风良好，温度、湿度适宜（温度20-25，湿度40%-50%，光照12 h与黑暗12 h交替循环），自由进食水。所有动物均适应性饲养1周。动物实验方案经北京隆安实验动物伦理委员会批准（BJLongan-L-L-003）。1.2主要试剂和仪器舒 筋 健 腰 丸（广 州 陈 李 济 药 厂，国 药 准 字Z44021058，规格：120 g/瓶）；中性甲醛（武汉塞维尔生物科技有限公司，货号：G1101-500ML）；10%EDTA、苏木素染液、伊红染液（北京索莱宝科技有限公司，货号分别为：E8030、G1080、G1100）；Weiger铁苏木素A/B液、丽春红酸性品红染液、磷钼酸溶液、苯胺蓝染液（北京索莱宝科技有限公司，货号分别为：G1142、P0012、G3720、G3665）；TGF-1兔单克隆抗体、TNF-兔单克隆抗体、IL-1鼠单克隆抗体、IL-6兔单克隆抗体、LOXL2 兔 单 克 隆 抗 体（Abmart，货 号：T58262，PU787889，MK56352，TD6087，T57106）；PBS 缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，货号：P1020）；打磨机磨钻（韩国世新精密工业社，型号：STRONG204）；石蜡切片机（德国Leica，型号：RM2235）。2 方法 2.1舒筋健腰丸有效成分检索与筛选舒筋健腰丸药由狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女贞子、桑寄生、菟丝子、延胡索、两面针、乳香、没药构成。基于中药系统药理学数据库和分析平台在线数据库15（TCMSP，http:/ Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 2.2黄韧带肥厚相关靶点的获取通 过 GEOquery 包 从 GEO 数 据 库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载 GSE113212 蛋白芯片数据。该芯片数据总共包含8个样本，其中对照组为4个腰椎 间 盘 突 出 症 患 者 的 黄 韧 带（GSM3100386-GSM3100389），4 个样本为 DLSS 黄韧带肥厚样本（GSM3100390-GSM3100393）。在数据处理过程中，去除掉一个探针对应多个分子的探针，当遇到对应同一个分子的探针时，仅保留信号值最大的探针。然后通过箱式图查看样本标准化的情况，通过PCA图查看样本分组间聚类情况。利用R包limma包分析、筛选和绘制差异基因表达图，筛选条件为 adj.P2。2.3构建药物活性成分-疾病靶点的蛋白互作网络（PPI Network）利用PubChem数据库20（https:/pubChem.ncbi.nlm.nih）获取舒筋健腰丸所有药物的有效活性成分的SMILE 结构，通过 DrugBank Database21（https:/www.drugbank.ca/）和 SwissTarget Prediction Database22（http:/www.swisstar getprediction.ch/）数据库基于有效活性成分的二级结构预测其对应的靶点蛋白，相似性阈值默认为0.85。为阐明舒筋健腰丸的潜在靶点与黄韧带肥厚相关靶点之间的相互作用，将疾病靶点与药物靶点取 交 集 并 绘 制 韦 恩 图（http:/ 11.0（https:/www.string-db.org/）23平台构建PPI网络，生物种类选定“Homo sapiens”，最小互相作用阈值“Highest Confidence”设置为0.85，得到蛋白间的相互作用关系，利用 Cytoscape24实现网络的可视化。最终选取拓扑分析参数自由度值和平均最短路径值前五名作为关键靶点。2.4GO富集分析和KEGG信号通路分析将 PPI 网络靶点上传至 DAVID 数据库（https:/david.ncifcrf.gov/）25，进行 GO 富集，分析生物学过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）以及KEGG信号通路分析。利用 R 语言将获得的 GO 富集分析和KEGG通路分析制作成气泡图。综合分析舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚DLSS的机制。2.5舒筋健腰丸药物制备、分组、造模及给药实验所用舒筋健腰丸均来自广州陈李济制药厂（同一批次，规格：120 g/瓶），药物均为浓缩水蜜丸。根据厂家提供舒筋健腰丸质控标准，所有丸剂分批次每天晨经过4、24 h蒸馏水密封浸泡，后经充分的搅拌，制成含药浓度为0.05 gmL-1的混悬液，随后装于药用高密度聚乙烯密封瓶中并做好标记。为保证混悬液稳定性，所有药液均提前24 h配置并用于第2天大鼠灌胃。按照随机数表法将实验大鼠分为4组，分别为正常组、模型组、氯磷酸盐组和中药组，每组6只，各组自由摄食、摄水。舒筋健腰丸给药剂量按照60 kg人与大鼠体表面积关系换算出大鼠每日中药等效剂量，得出每日等效剂量为1.5 gkg-1。大鼠每周称重并调整给药剂量。中药组灌胃舒筋健腰丸混悬液，每日1次，持续8周；正常组、模型组和氯磷酸盐组每日灌胃等量生理盐水，持续 8周；氯磷酸盐组在每日灌胃生理盐水的基础上，于造模后即刻、2周、4周和6周于原位注射Clodronate Liposomes（溶于PBS，4储存，浓度5 mgmL-1，0.5 ml/次）。造模 3 天后即开始按计划给药。中药组、模型组和氯磷酸盐组均采用大鼠腰椎失稳损伤法造模。大鼠腰椎黄韧带肥厚模型采用腰椎失稳损伤法造模26。造模方法为：完全切除大鼠L5和L6棘突，磨削双侧L5/6小关节，切除整个L5-L6椎旁肌，直至椎板暴露，术后3天给予注射头孢呋辛钠抗感染处理，造模持续8周。模型评价标准：取大鼠L5/6包含黄韧带椎体节段，垂直黄韧带制作组织切片，利用Masson染色，计算大鼠黄韧带胶原容积分数，若CVF大于30%即认定纤维化模型成功26，组织切片可随后用于免疫组化染色等实验。2.6HE染色和Masson染色HE染色：二甲苯脱蜡后梯度酒精水化，将大鼠腰椎节段切片置于苏木素染液中染色15 min，分化液分化30 s，伊红复染5 s，双蒸水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。Masson染色：切片水化后，Weigert铁苏木素染液染色 5 min，盐酸分化 2 s至返蓝，双蒸水冲洗，丽春红品红染色液染色15 min，磷钼酸溶液洗3 min，苯胺蓝色液中染色3 min，冰醋酸洗1 min，脱水，透明，中性树胶封固。利用Masson染色分析CVF，即胶原蛋白阳性的蓝色面积与组织总面积的百分比。将同等放大倍数的镜下图像导出，采用Image J软件测量黄韧带厚度、长度、面积等数值，每组随机选取3张Masson染色图片测算CVF并取平均值，954 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药数据研究用于后续统计分析。2.7免疫组织化学染色法检测纤维化相关蛋白和炎性相关蛋白根据PPI网络利用拓扑分析方法筛选网络中的关键作用靶点，采用免疫组化法检测各组黄韧带中相关蛋白的表达和定位。采用专业图像分析系统Image J 1.50 对免疫组化切片进行分析，以平均光密度值（MOD，MOD=IOD/Area）作为表达强度的评价参数。表1舒筋健腰丸预测靶点靶点名称PTGS2PGRESR1LSSRORANR1I3VDRCLEC4ESULT2B1NR1I2ARHMGCRCYP51A1F2CHRM1SCN5ANOS3RXRAACHEADRA1ACHRM2ADRB2OPRM1GABRA1DPP4CHRNA7NCOA2TGF-1GABRA2SLC6A2MAOBSLC6A3DRD1ADRB1PDE3AHTR2AADRA1BAKR1B1PTGS1SCN3AAKR1A1AKR1E2PLA2G1BACP1LOXL1PTPRSNR1H2NR1H3ESR2CYP17A1TBXA2RKCNA3IL-1PTPN6PRGRSLC6A4CYP19A1CHRM5NOS1NOS2CDC25BPPARGPPARDPPARAPTGER2ALOX5ALOX12ALOX15BALOX12BGABRB3GRIA2GABRA5AKR1C3LYZAMY2APTGER4PTGER3ANXA1CD300ASCN11ACHRNECHRNA9SLC22A1SLC18A1CEND1GGT1GLO1GPX7GPX6GSTT1GSTM3GPX2GSRMGST2GSTZ1GSTA4MGST1LTC4SGSTA3HAGHMGST3GSSGSTO2GPX8GPX5GSTK1HPGDSGSTA1GPX4GSTA5GPX3GLRXGSTM1GPX1GSTP1ESDGSTM2GSTM5GSTA2ADRA2ACOX2TYRATCAYCOX1FECHCOX6B1COX8ASRD5A2EIF2AK1MTNR1ASOAT1CRYZSNW1MTNR1BMTTPVKORC1PAWRHTR2CSOAT2NQO1GPR27CBR4CYP27B1VKORC1L1GCPDE7BPRKDCPIK3CAPIK3CBITPR3ATMPDE11APIK3R1ADAPDE5APIK3CDADORA2BITPR2POLA2DRD5CCL23SLAMF8CCL18AOC3AOC2HIF1AIL-1IL-10BCL2SRPK2POSTNHSP90PTGS3SMAD3CD86CALCASOX2BAXRAB7APIK3SMAD7CTSDMAPK14AKT1APLNIL6JUNCNR1CXCL8SMAD2TGFA1AGTR1ARRDC3ADRB3ADRA2BARRB2ADRA1DAPRTPNPSCN1BSCN2BSCN7ASCN2ASCN4BABATHDAC9SCN1ASCN10AACADSBSCN3BSCN9ASCN8ALPLRDH11RDH5ALDH1A1RBP3ALDH1A3RLBP1RETSATRDH12RDH14RDH13DHRS4RDH8DHRS3RBP1LRATKCNQ1RARAALDH1A2RXRBRARBRARRES1GPRC5ANR0B1RXRGRARGMCRPTPN2PTPN1TDP1PCK1TOP2BHSD11B1MAPTHSD11B2NR3C1FNTAFNTBAKR1B10AKR1B15POLBNR3C2ESRRGAKR1C2COX4I1FABP6NR1H4ABCB4COX6CCOX5ACES1AKR1D1ALADCOX7BCOX7CCOX7A1TNF-SP1PCK2PECRFABP4ACACBDDCTRPA1DRD4DRD2HTR3ANPR1CHRNGCHRNA10CHRFAM7ACHRNA4CHRNA6CHRNB3CHRNDCHRNB4CHRNA7BCHECHRNB1CHRNA1PDE1BVPS18SERPINE2LOXL2FOXD3FAPEGR3DESDCTN6SCG5P4HA1COL10A1CPZCHRM3CD70SCTACACAPRKAA2CALCOCO2KCNJ8PRKAA1ADRA2CKCNJ1CYP2B6SCNN1BPDE6BGSTM4PTGER1RHOALDH5A1SCN4AUGCGIGHG1GABRA3GABRA6GRIA2TNFKIF14HSP90AB1GLRA3HSD17B1CNR2GSTO1GLRX2TXNDC12SRD5A1OPRK1PDE8AWNT4HAP1PDE9APDE1AMTAPADH1BADH1CALDH3A2ADKSCNN1ATLR8HRH1SCNN1DTLR7ADH1A955 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 在同等放大倍数的显微镜视野下，每张切片随机拍摄 6个视野，取平均值作为每张切片的观察结果。2.8统计分析统计学分析采用SPSS 21.0软件分析处理实验数据，计量资料以均数标准差表示，多组比较运用单因素方差分析，P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果 3.1舒筋健腰丸化学成分分析及靶点的预测根据OB30%及DL0.18要求，利用TCMSP数据库和TCMID数据库检索舒筋健腰丸活性成分，同时利用文献检索补充中药指标成分和重要有效活性成分。经过去重，筛选出151种有效化合物，补充有效化合物25种。分别利用Pubchem获得的化合物SMILE结构，共预测到舒筋健腰丸靶点355个，见表1。3.2疾病靶点筛选与 PPI 网络构建根据箱式图可以看出，该蛋白组学芯片数据各个样本中位数基本在一个水平线上，说明样本间归一化程度较好。根据PCA图（Principal component analysis）可以看出，各组的样本分开，并且 PC1和 PC2的比例高，说明分组间差异明显，后续差异分析有意义的结果可能会比较多。根据差异表达倍数和统计分析结果（筛选条件adj.P2）共获得差异表达蛋白 312 个，其中表达上调的蛋白 172 个，表达下调的蛋白140个。将所获得的药物靶点与疾病相关靶点取交集，得到与疾病相关的差异表达蛋白77个。PPI网络图可见77个关键蛋白的网络结构及相互关系。对PPI网络进行拓扑分析，结果可见TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和 IL-1占据网络中的重要位置。结果见图1。3.3基因功能和通路富集分析利用DAVID数据库，对取交集后的77个靶点进行GO富集分析和KEGG通路分析。可以看出，在分子功能层面，舒筋健腰丸关键活性成分可能对炎症反图1舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚DLSS的关键靶点筛选图注：A黄韧带肥厚DLSS蛋白组学芯片数据样本间归一化箱式图；B：黄韧带肥厚DLSS蛋白组学芯片数据PCA图；C：正常样本与黄韧带肥厚DLSS样本差异蛋白火山图；D：舒筋健腰丸靶点与疾病靶点韦恩图；E：舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚DLSS关键蛋白PPI网络图；F：舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚DLSS关键蛋白的平均最短路径和自由度分布散点图。956 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药数据研究应、转录因子结合DNA活性、细胞分泌和对细胞外刺激的反馈具有调控作用；在细胞组分层面，舒筋健腰丸主要调控细胞外基质胶原含量、转录因子复合物、细胞核内转录因子复合物；在生物过程层面，舒筋健腰丸参与调控细胞因子受体结合、受体与配体活性和细胞因子活性。在KEGG通路分析中可以看出，炎性通路占据重要地位。结果见图2。3.4舒筋健腰丸对大鼠黄韧带纤维化的作用3.4.1各组大鼠Masson染色模型组与中药组均可见弹性纤维与胶原纤维不图2舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚DLSS的靶点GO富集分析（左）和KEGG通路分析图（右）图3各组大鼠L5/6黄韧带Masson染色结果注：A：正常组；B：模型组；C：氯磷酸盐组；D：中药组；E：各组大鼠腰椎黄韧带胶原容积分数（CVF）统计图；与模型组和氯磷酸盐组相比，#P0.05；与模型组相比，*P0.05，图片放大倍数400，n=10。957 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 同程度的扭曲变形，弹性纤维断裂，“弹性-胶原”纤维比值明显降低，胶原沉积。与模型组相比，氯磷酸盐组可见弹性纤维和胶原纤维的上述情况明显减轻，未见炎症细胞浸润。与模型组相比，中药组可见弹性纤维和胶原纤维扭曲和断裂情况有所减轻，胶原沉积减轻，伴有炎症细胞浸润。对 CVF 的统计分析表明，与正常组相比，模型组 CVF 显著增高（P 0.05）；与模型组相比，氯磷酸盐组CVF显著降低（P 0.05）；与模型组相比，中药组 CVF 显著降低（P 0.05），而与氯磷酸盐组相比，中药组 CVF 显著增高（P 0.05），结果见图3。3.4.2各组大鼠HE染色从HE染色中可以看出，正常组和氯磷酸盐组纤维横切面积较小且均匀，韧带纤维纤细且排列紧密、整齐，韧带中细胞核数目较少，细胞核分布较为疏散；模型组纤维组织横切面积增大且染色不均，纤维排列扭曲、变形，细胞核数目多。与模型组相比，中药组HE染色相对均匀，但仍然可见弹性纤维扭曲变形，基质沉积。结果见图4。3.4.3各组大鼠 TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6 和 IL-1免疫组化结果从结果来看，TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1在各组中均有不同程度的表达，且均表达在细胞外基质中。与正常组相比，模型组和氯磷酸盐组TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和 IL-1蛋白表达均显著增高（P0.001）；与模型组相比，中药组TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6 和 IL-1 蛋 白 表 达 均 显 著 降 低（P0.001）。与氯磷酸盐组相比，中药组TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1蛋白表达明显较高（P0.001）。结果见图5和表2。图4各组大鼠L5/6黄韧带HE染色结果注：A：正常组；B：模型组；C：氯磷酸盐组；D：中药组，放大倍数400，比例尺40 m，n=10。正常组模型组氯磷酸盐组中药组TNF-IL-1 LOXL2IL-6 TGF-1图5各组中TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1免疫组化结果（放大倍数400，n=10）958 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药数据研究4 讨论 传统中医学中将黄韧带肥厚腰椎管狭窄症这类疾病归入“腰痛病”、“腰腿痛”和“痹症”范畴，属于慢性筋伤骨病。从中医病位来看，该病以筋骨失衡为病理基础，“湿”、“痰”和“瘀”等病理产物夹杂，发病过程涉及五体（筋、脉、肉、皮、骨）病机演变27。在中药的运用上，舒筋健腰丸利用狗脊、女贞子、桑寄生、菟丝子、金樱子等药物调补“肝”、“肾”以补自身正气之虚，利用鸡血藤、黑老虎、延胡索、两面针、乳香、没药等药物舒筋活络、行气活血以化“湿”、“痰”、“瘀”等病理产物积聚。从而达到扶正祛邪兼顾，阴阳同调的目的。从现代药理学角度而言，组成舒筋健腰丸的每味中药均具有广泛的药理学作用。例如药理学研究表明金樱子的提取物能够显著降低损伤大鼠血清的血清肌酐和血尿素氮水平，显著下调损伤细胞的炎症通路NF-B p65的核转位28。狗脊的甲醇提取物能够以剂量依赖的方式表现出对细胞的抗氧化活性29。鸡血藤和乳香等药物也表现出了极强的抗炎活性，对 NF-B、MAPK 和 c-Jun 的磷酸化均具有抑制作用30-31。舒筋健腰丸的药理学作用是多味药物综合作用的结果，单味药物或单体成分难以代表整体的药理学作用。在 GO 富集分析和 KEGG 通路分析中，可以看出舒筋健腰丸在炎症因子的调控、细胞外基质调节和胶原蛋白的分泌等方面发挥着重要作用，这与炎症反应和纤维化密切相关。组织损伤、炎症和纤维化本身就存在极为密切的关系，难以截然区分，也是黄韧带肥厚的主要病理因素5-6。从网络拓扑分析结果可以看出，舒筋健腰丸调控的关键靶点 TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1与炎症反应和纤维化同样关系密切。转化生长因子-1（TGF-1）被认为是纤维化发生的中心介质，其在纤维化疾病中表达显著上调，能够介导纤维化表型和促进细胞外基质合成32。TGF-1与黄韧带纤维化具有明确的相关性，在人和大鼠黄韧带中的表达已经得到了证实5。LOXL2同样与纤维化密切相关，其能催化细胞外基质胶原蛋白和弹性蛋白的共价交联，在维持组织刚度和机械性能中发挥重要作用33。LOXL2的过度表达可能会使细胞外基质病理性过度沉积和交联，而其表达减少有可能会抑制成纤维细胞增殖，引发细胞周期停滞34。同时，我们注意到一些与黄韧带肥厚 DLSS 密切相关的信号通路。TGF-beta信号通路是经典的纤维化诱导通路。研究表明，TGF-1/Smad通路的失调是黄韧带肥厚重要病理机制，其能使弹性纤维无序化并增加细胞外胶原的沉积，促进纤维化的发生35。Yoshida等36研究发现，TGF-信号通路还能够与p38 MARK信号通路发挥协同作用，促进了成纤维细胞的细胞外基质的表达，推动了血管的生长和上皮间质的转化。NF-B介导的慢性炎症是黄韧带肥厚DLSS的重要因素之一。我们发现舒筋健腰丸可能通过其关键激活剂TNF-激活NF-B介导的慢性炎症。研究表明NF-B信号通路的效应蛋白TNF-、IL-6和IL-1在黄韧带肥厚DLSS中显著高表达，且表达强度与纤维化程度和黄韧带厚度显著相关37-38。此外，雌激素信号通路、钙离子信号通路和 PI3K/AKT 信号通路与黄韧带肥厚 DLSS 均存在相关性39-41。研究团队首先明确了舒筋健腰丸能够抑制黄韧带肥厚，发挥抗纤维化作用。以氯磷酸盐组作为实验的强阳性对照组，可以对比判断舒筋健腰丸对黄韧带肥厚的抑制强度。氯磷酸二钠脂质体是一种巨噬细胞清除剂，能够耗竭动物体内巨噬细胞，能够显著抑制黄韧带纤维化进展42。Masson染色结果表明，与模型组相比，舒筋健腰丸能够显著降低 CVF（P0.05）。舒筋健腰丸能够抑制细胞外基质胶原的堆积，但其强度不及氯磷酸盐组。结合HE染色可以看出，舒筋健腰丸干预后，黄韧带弹性纤维仍存在扭曲和断裂情况，基质中可见炎性细胞浸润，CVF仍大于30%，提示纤维化依然存在。综合Masson和HE染色结果可以看表2各组大鼠黄韧带中TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1免疫组化IOD/Area值比较（x s，n=10）组别TGF-1LOXL2TNF-IL-6IL-1正常组0.02170.00100.06380.00690.02130.00230.01340.00120.02130.0024模型组0.10180.0029*0.14060.0046*0.13520.0042*0.04580.0034*0.04550.0026*氯磷酸盐组0.04040.0009*0.09200.0072*0.04430.0031*0.02150.0022*0.03330.0025*中药组0.06410.0028*0.10660.0039*0.08850.0039*0.03530.0037*0.03980.0009*注：与正常组相比，*P0.001；与模型组相比，P0.001；与氯磷酸盐组对比，P0.001。959 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 出，舒筋健腰丸无法逆转纤维化病理改变，只能起到抑制作用。因此，就纤维化病理改变而言，本研究浓度条件下的舒筋健腰丸的早期干预是有效的，晚期干预可能效果较差。随后研究团队重点关注了TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1蛋白的表达。从免疫组化结果可以看出，舒筋健腰丸能够显著降低纤维化黄韧带中的TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1蛋白的表达。正如前面所述，对这些因子的干预能够直接抑制细胞外基质的堆积，抑制炎症反应，抑制黄韧带肥厚进展。阳性对照氯磷酸盐组表现出了对这些因子极强的抑制能力，但巨噬细胞的耗竭会带来更为严重的免疫和组织修复问题。舒筋健腰丸在抑制黄韧带肥厚的同时，仍可以在切片中看到较多的炎性细胞浸润，这在免疫层面或许是有利的。综上所述，研究团队分析了舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚DLSS的关键作用靶点，探讨了舒筋健腰丸在大鼠黄韧带肥厚模型中能够抑制黄韧带肥厚进展，抑制细胞外基质进一步堆积，抑制纤维化关键蛋白TGF-1和 LOXL2 表达，抑制关键炎症因子 TNF-、IL-6 和 IL-1 表达。舒筋健腰丸可能通过 TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6 和 IL-1 发挥干预黄韧带肥厚DLSS 的作用。然而，根据 网络药理学评价方法指南43-44，本研究存在一定的局限性：舒筋健腰丸的药物组成较多，成分较为复杂，难以完整获取所有有效化合物，且并未考虑化合物之间的相互作用，这需要中药数据库的进一步完善和更多的实验验证。参考文献 21Ammendolia C,Rampersaud Y R,Southerst D,et al.Effect of a prototype lumbar spinal stenosis belt versus a lumbar support on walking capacity in lumbar spinal stenosis:A randomized controlled trial.Spine J,2019,19(3):386-394.2Hansson T,Suzuki N,Hebelka H,et al.The narrowing of the lumbar spinal canal during loaded MRI:The effects of the disc and ligamentum flavum.Eur Spine J,2009,18(5):679-686.3Hori Y,Suzuki A,Hayashi K,et al.Long-term,time-course evaluation of ligamentum flavum hypertrophy induced by mechanical stress.Spine,2020,46(9):E520-E527.4Frsth P,lafsson G,Carlsson T,et al.A randomized,controlled trial of fusion surgery for lumbar spinal Stenosis.N Engl J Med,2016,374(15):1413-1423.5Sun C,Zhang H,Wang X,et al.Ligamentum flavum fibrosis and hypertrophy:Molecular pathways,cellular mechanisms,and future directions.FASEB J,2020,34(8):9854-9868.6Mack M.Inflammation and 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