基于WGCNA分析反复种植失败胚胎种植窗口期关键生物标志物及免疫相关性.pdf

基金项目:国家自然科学基金(项目名称:调控细胞粘附在胚胎着床中的作用及其机制研究项目编号:)作者简介:覃韦丽女在读研究生研究方向:不孕不育与辅助生殖技术通讯作者:.基础研究基于 分析反复种植失败胚胎种植窗口期关键生物标志物及免疫相关性覃韦丽王嘉伟黄汉记覃爱平(.广西医科大学第一附属医院生殖医学中心广西南宁.广西医科大学生命科学院广西南宁)摘要 目的 应用加权基因共表达网络分析()探讨反复种植失败()胚胎种植窗口期关键生物学标志物以及子宫内膜局部免疫细胞浸润情况 方法从 数据库中下载基因芯片数据以 .为筛选条件以 和 作为模型组获取 和正常妊娠志愿者差异表达基因()使用 和 对 进行功能富集分析 使用 和 回归筛选 关键生物学标志物并使用、和 作为验证组进行验证 基于 分析 浸润免疫细胞相对丰富度以及与关键生物学标志物相关性 结果 相对于正常妊娠者 患者共筛选出 个 其中高表达 个低表达 个 和 回归证实模型组(.)和(.)是 密切相关的诊断性标志物在验证组(:.:.)同样发现佐证了该结果 而且模型组和验证组均发现 患者 呈低表达 呈高表达与浸润免疫细胞存在明显的相关性 和正常妊娠志愿者 子宫内膜样本之间免疫细胞浸润存在一定的差异 结论 和 能够用于 患者的诊断与识别与子宫内膜浸润免疫细胞密切相关关键词 反复种植失败加权基因共表达网络分析差异表达基因种植窗子宫内膜容受性中图分类号.文献标识码 文章编号 ():./.(.)()().().(.)(.).(:.:.).蛇 志 ()年第 卷第 期.成功的胚胎植入需要胚胎与子宫内膜动态相互结合、滋养细胞侵袭以及局部免疫微环境的调节其受许多重要的分子对接以及生理进程的调控在很大程度上依赖于子宫内膜正常结构、合适的子宫内膜容受性以及最佳胚胎种植窗()反复种植失败()可严重影响辅助生殖技术的临床妊娠率主要与子宫内膜容受性密切相关特别是 子宫内膜变化 雌激素和孕激素协同促进子宫内膜包括间质、腺体、腔上皮、免疫细胞以及内皮细胞发生周期性变化以调控子宫内膜容受性的建立因此分析子宫内膜容受性以及动态变化过程对改善 结局、提高临床妊娠率尤为重要 本研究整合 数据探讨 密切相关的生物学标志物与 患者 子宫内膜浸润免疫细胞之间的相关性为 治疗提供一定的研究基础 材料与方法.数据获取本研究从 数据库(:/./)中下载 的转录组数据作为模型组包括 和 两个数据集 其中 包括 例 患者和 例正常妊娠志愿者 包括 例 患者和 例正常妊娠志愿者均在胚胎 行诊断性刮 宫 获 取 子 宫 内 膜 的 活 检 组 织 同 时 下 载、和 转录组数据作为验证组其中 包括 例 患者和 例正常妊娠志愿者 包括 例 患者和 例正常妊娠志愿者 包括 例 患者和 例正常妊娠志愿者验证所筛选的胚胎 期关键生物标志物 使用 语言对所有患者转录组数据进行基因 转换基于“”和“”软件分析包对数据进行合并、校正和质量控制 对数值较大的值取 进行数据转换 使用“”包对模型组校正前后的 图进行可视化 本研究使用网络公共数据库资源无需医院伦理批准.差异表达基因()的鉴定设定 .为筛选条件使用“”包确定在 患者胚胎 高低差异性表达的基因同时使用“”绘制差异表达基因的火山图使用“”包将前 个差异表达基因进行热图分析和可视化.功能富集分析以 .为 设 定 条 件 使 用 语 言 中“”“.”“”“”“”“”“”“”等软件包对 进行包括生物过程()、细胞组分()和分子功能()种分析在内的基因本体()注释和京都基因和基因组数据库()分析并进行可视化.基因共表达网络的构建加权基因共表达网络分析()是一种系统生物学分析方法能够用来寻找疾病高度相关的基因簇或者模板为识别疾病的候选生物学标志物和寻找可能的治疗靶点提供参考加载 语言中“”工具包对 和 数据合并表达数据构建加权相关网络去除选择绝对偏差 的基因子集进一步研究使用 函数验证数据完整性 函数来选择和验证最佳软阈值 将表达数据矩阵转化为邻接矩阵然后进行聚类分析找出基于拓扑重叠的模块并利用表型数据和模块评估基因和临床数据的重要性检查模型和模块之间的关系.诊断性标志物的筛选从模块间关联度最高的基因库中挑选基因作为下一步分析的候选基因本研究使用“”包取交集作为后续分析的显著性基因使用 语言中“”包对所获得的候选基因与 的交集基因进行 分析确定与 患者胚胎 密切相关的基因 使用“”绘制 患者和正常妊娠者差异表达基因的箱线图使用“”绘制 曲线评估区分 患者和正常妊娠者样本的诊断性标志物水平同 时使用、和 转录组数据集作为验证组来评估诊断性标志物水平和诊断价值.基于 分群分析 对于 的共识分子亚型通过“”软件包进行共识聚类分析并且共识聚类方法可以识别数据集中的非监督类 对不同组别进行后续分析.浸润免疫细胞分析使用 包(“”、“”、“”和“”)对 患者和正常妊娠者子宫内膜样品进行 分析并计算浸润免疫细胞类型的相对丰富度使用“”包绘 制 小 提 琴 图 进 行 可 视 化 加 载“”、“”、“”和“”包 使 用蛇 志 ()年第 卷第 期.相关性分析浸润免疫细胞和诊断性标志物的相关性.统计学分析采用.(:/./)分析所有数据 分析过程中使用的包有“”“”“”“.”“”“”“”“”“”“”和“”等 曲线检验诊断性标志物诊断的准确性 以 .为差异有统计学意义 结果.筛选 作为模型组的 和 两个数据集合并以后相对于正常妊娠者 患者共筛选出 个 其中高表达的 个低表达 个 使用火山图展示出差异表达基因(图)同时使用基因热图将具体 进行可视化(图)图 患者 筛选 注:火山图:热图.功能富集分析 使用 和 分析 相关的生物学过程 分析显示与生物过程有关的主要是营养物质代谢和转运、排卵、血管平滑肌细胞增殖的正向调控、前列腺素生物合成过程和细胞对流体剪应力的反应等与 有关的主要是细胞质膜、依赖于 的跨膜转运复合体、胶原蛋白、细胞外基质、环泛素连接酶复合体和细胞的纤毛结构与分子功能有关的主要是激素活性、叶酸等各种营养物质的结合、内肽酶抑制物和调节物活性、激活蛋白激酶活性和 依赖蛋白激酶调节活性见图 分析显示 主要富集在营养物质代谢和转运、前列腺素生物合成过程、对营养物质水平的反应、排卵以及泌尿生殖系统发育等途径中见图.诊断性标志物的筛选与验证在 分析中将模块与临床特征相关联构建 个共表达模块发现多个模块与 相关其中棕色模块与 有显著的相关性见图、将棕色模块中基因与 取交集发现 个基因与 相关性最强见图 回归进一步确定缩小和鉴定缝隙连接 蛋白()和 锌指蛋白()是 密切相关的诊断性标志物见图、同时发现 在 患者子宫内膜 期呈低表达(.)在 患者子宫内膜 期呈高表达(.)见图 在使用、和 数据验证时发现 在 患者子宫内膜 期呈低表达(.)在 患者子宫内膜 期呈高表达(.说明二者对 诊断的敏感度和特异度较高是诊断 关键性标志物 参与形成的缝隙连接细胞间通讯对子宫内膜的分化发育起着重要作用有助于建立细胞之间的相互通讯促进子宫内膜间质分化同步能够为胚胎的正常植入提供保障 有研究指出 在几乎所有的免疫细胞中都存在一定的表达并且其介导的细胞通讯参与多种免疫和炎症过程炎症介质也可以反过来调控免疫细胞和非免疫细胞中 表达和功能 而 患者中 低表达并且与活化的树突状细胞、自然杀伤性 细胞以及效应记忆性 细胞等免疫细胞密切相关进一步说明 患者子宫内膜不同的细胞亚群之间通讯受到破坏内膜免疫细胞微环境受损导致子宫内膜容受性损伤阻碍胚胎种植 既往研究指出 可以消除组蛋白抑制标记在对前列腺癌和黑色素瘤研究中发现 可以调控肿瘤侵袭和转移相关信号的转录同时能够调控骨髓基质细胞炎症和成骨分化 本研究首次提出 在 中呈高表达并且与子宫内膜局部微环境中浸润的免疫细胞密切相关也间接说明 有可能通过调控子宫内膜中特定的细胞组蛋白甲基化以及免疫水平参与 的发生也为下一步探讨具体作用机制提供方向 在对 病因的研究中发现 细胞、树突状细胞、巨噬细胞、/比值以及 细胞等免疫细胞通常出现异常导致子宫内膜免疫微环境紊乱 但有研究指出免疫相关治疗能够显著改善 妊娠结局 本研究发现 患者 子宫内膜免疫微环境中活化的 细胞、活化树突状细胞、/自然杀伤细胞、未成熟 细胞、未成熟树突状细胞、单核细胞、自然杀伤/调节性 细胞、/型辅助性 细胞、效应记忆性/细胞和效应记忆性 细胞表达存在异常并且在以 为基础对 患者进行亚群分析发现不同分群中免疫细胞同样出现差异性表达 综上可知子宫内膜免疫微环境紊乱在 中发挥着重要的调节作用但并不是所有的患者均出现免疫紊乱甚至不同患者之间在局部浸润免疫细胞上存在显著性差别因此针对 患者的情况进行个体化治疗 本研究主要是整合网络数据资源进行相关探讨指出 发生与子宫内膜免疫微环境有关但缺乏 标本进行相关实验以及功能验证 此外本研究指出 和 是 患者明确的靶基因与 子宫内膜浸润免疫细胞密切相关二者能够用于诊断识别 患者为 的早期诊断和干预提供一定的参考参考文献 .:.:.:.():.():.():.:?.():.():.:.():.:?.():.吕萌刘琳.宫腔灌注对反复种植失败患者妊娠结局的研究进展.中华生殖与避孕杂志():.李娜张云山.反复植入失败与胚胎及内膜同步化关系的研究进展.中华生殖与避孕杂志():.蛇 志 ()年第 卷第 期.?.()():.():.:.():.():.():.():.():.():./:.:./.():.:.刘茜桐卢娜李佩等.胚胎反复种植失败的免疫学预测指标.中华生殖与避孕杂志():.():.(上接第 页)参考文献 中华医学会外科学分会脾及门静脉高压外科学组.肝硬化门静脉高压症食管胃底静脉曲张破裂出血诊治专家共识(版).中华消化外科杂志():.():.周存金唐小鹤马健等.聚桂醇和血凝酶局部注射联合密集套扎治疗肝硬化伴食管静脉曲张破裂出血的临床研究.中国内镜杂志():.():.张东旭骆子义.食管静脉曲张套扎术治疗肝硬化食管静脉曲张破裂出血的效果观察.临床肝胆病杂志():.黄会娟杨小莉.内镜下套扎术联合普萘洛尔预防肝硬化食管静脉曲张出血的研究进展.四川医学():.许秀华向晓星周年兰.肝硬化急性食管静脉曲张破裂出血的危险因素分析.肝脏():.江长文汪安江张金莲等.肝硬化食管静脉曲张破裂出血的内镜治疗.临床肝胆病杂志().万晓强郑紫丹杨杰.内镜套扎治疗 例肝硬化食管静脉曲张破裂出血的临床观察.重庆医学():.杨连粤.重视我国门静脉高压症外科治疗的问题.中华消化外科杂志():.蛇 志 ()年第 卷第 期.