仿刺参β-胸腺素基因的克隆和表达分析.pdf

D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 1 2 0 4第4 2卷第4期2 0 2 3年7月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.4J u l.2 0 2 3仿刺参-胸腺素基因的克隆和表达分析孙红娟,蒋经伟,董 颖,高 杉,关晓燕,陈 仲,王 摆,潘泳嘉,肖 瑶,姜萍哲,李佩佩,张宸瑜,周遵春(辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁省海洋水产分子生物学重点试验室,辽宁 大连1 1 6 0 2 3)摘 要:-胸腺素是一种具有抗菌活性的多肽。采用R A C E方法克隆仿刺参-胸腺素(-T h y m o s i n),命名为A j-T h y m o s i n。A j-T h y m o s i n基因的序列全长1 8 7 7b p,开放阅读框为1 2 6b p,编码4 1个氨基酸;分子质量为4.6k u,理论等电点为5.2 5。仿刺参-胸腺素中存在着保守的功能序列E VA S F D-K S K L K和保守的G-a c t i n结合结构域L KK T E T。系统发育进化分析结果显示,仿刺参-胸腺素和紫色球海胆的-胸腺素聚为一支。采用实时荧光定量P C R检测A j-T h y m o s i n基因在仿刺参不同组织和不同发育时期的表达量,发现其在体腔细胞中的表达量最高,在小耳幼虫期开始高表达。经过假交替单胞菌、灿烂弧菌、蜡样芽孢杆菌和希瓦氏菌4种病原菌刺激后,仿刺参体腔细胞中A j-T h y m o s i n基因的表达量在4h均受到抑制;在蜡样芽孢杆菌和希瓦氏菌组,A j-T h y m o s i n基因的表达量在1 2h开始上调;在假交替单胞菌组,A j-T h y m o s i n基因的表达量在2 4h开始上调;在灿烂弧菌组,A j-T h y-m o s i n基因的表达量在4 8h才开始上调。病原刺激产生的动态表达模式表明,A j-T h y m o s i n基因参与仿刺参体腔细胞免疫应答的过程,并且对不同病原菌的免疫应答能力不同。对A j-T h y m o s i n基因的序列和表达进行分析,可为新型抗菌肽和养殖病害防控策略的研发奠定基础。关键词:仿刺参;-胸腺素;序列分析;免疫刺激;基因表达中图分类号:Q 7 8 6文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 4-0 6 5 7-0 7收稿日期:2 0 2 1-1 0-1 8;修回日期:2 0 2 2-0 4-2 6.基金项目:国家重点研发计划项目(2 0 1 8 Y F D 0 9 0 1 6 0 4);辽宁省百千万人才工程资助项目(2 0 2 1 9 2 1 0 7 1);辽宁省农业科学院基本科研业务费计划项目(2 0 2 2 X T C X 0 5 0 4);辽宁省农业科学院学科建设计划项目(2 0 2 2 D D 2 6 8 1 4 3);辽宁省海洋与渔业厅科研项目(2 0 1 8 1 6,2 0 1 8 3 3,2 0 1 8 2 3);辽宁省博士启动基金资助项目(2 0 2 0-B S-2 9 7);大连市高层次人才创新支持计划项目(2 0 2 0 R Q 1 1 7,2 0 2 1 R T 0 8,2 0 1 8 R D 1 0,2 0 1 8 R Q 6 0).作者简介:孙红娟(1 9 8 7),女,副研究员,硕士;研究方向:生物化学与分子生物学.E-m a i l:h o n g 1 2 3 j u a n 1 6 3.c o m.通信作者:周遵春(1 9 6 7),男,研究员,博士;研究方向:海洋生物技术.E-m a i l:z u n c h u n z h o t m a i l.c o m.胸腺素是具有生物活性的多肽,是从小牛胸腺中提取出来的,按照等电点(P I)分为(P I 5)、(5P I 7)亚型1。该家族从低等棘皮动物到高等脊椎动物均为高度保守的,但是在细菌和其他微生物中尚未发现2。-胸腺素家族分子质量约5k u,由4 04 4个氨基酸组成,在生物体内的表达具有物种特异性。-胸腺素能够调节肌动蛋白浓度,参与细胞骨架重排以及细胞的分化、迁移 等 细 胞 活 动3-4。另 外-胸 腺 素 作为抗菌肽,也具有抗菌和抗病毒等方面的活性。仿刺参(A p o s t i c h o p u sj a p o n i c u s)属棘皮动物门海参纲仿刺参属,因其缺乏适应性免疫系统,只能依靠先天性免疫系统抵御外界病原刺激5。抗菌肽在先天性免疫系统中发挥着至关重要的作用。胸腺素作为抗菌肽家族中的一员,在仿刺参中的作用机制尚无研究报道。研究仿刺参-胸腺素的结构特征以及在病原菌刺激后是否参与机体的免疫应答,将为仿刺参活性多肽的研究提供材料,同时为仿刺参养殖过程中的病害防控以及生态调控提供参考。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 组织和发育样品试验用仿刺参取自辽宁省海洋水产科学研究院引育种中心,体质量(6.01.5)g,养殖水温1 61 8,盐度2 9,p H8.38.5。试验共取6种组织,包括体壁、肌肉、管足、呼吸树、肠道和体腔细胞。不同发育时期包括受精卵、囊胚、原肠胚、小耳幼体、中耳幼体、大耳幼体、樽型幼体、五触手幼体和稚参。1.1.2 免疫菌株免疫刺激试验采用从仿刺参腐皮综合征病灶处分离出来的4种病原菌:希瓦氏菌(S h e w a n e l l ab a l t i c a)、假交替单胞菌(P s e u d o a l t e r o m o n a sn i g r i-f a c i e n)、蜡样芽孢杆菌(B a c i l l u sc e r e u s)和灿烂弧菌(V i b r i os p l e n d i d u s)。4种病原菌均在2 2 1 6 E培养基中,于2 8,1 5 0r/m i n条件下培养。当密度达到1 08c f u/m L时,可用于免疫刺激。1.2 试验方法1.2.1 基因全长克隆用动物组织R NA提取试剂盒(T I ANG E N)提取仿刺参体腔细胞R NA,以前期转录组测序得到的 部 分 仿 刺 参-胸 腺 素 序 列 为 基 础,采 用S MA R T e r5/3 R A C E试剂盒(C l o n t e c h)对该基因5 端进行克隆,3 端的克隆采用3 -F u l lR a c eP r i m e-S c r i pTMR T a s e试剂盒(T a k a r a),R A C E特异引物(G S P)见表1。反应体系见表2。表1 仿刺参-胸腺素克隆和表达引物信息 T a b.1 P r i m e r s i n f o r m a t i o no n-t h y m o s i n i n s e a c u c u m b e rA.j a p o n i c u s引物名称P r i m e r序列(5 3)S e q u e n c e用途F u n c t i o nT h y-5 rA C C AGA C A T C A G C GAA G T C AA C T C CR A C E克隆T h y-3 rG A A A G C A A C A T A G C A G G A T G C G G T C A CR A C E克隆T h y-5 qC T AA C C GAG T T C C A C T A T T GA T T G荧光定量T h y-3 qAAA GA G C C T G G G C A C C GAA G荧光定量C y t b-5 pT GA G C C G C AA C A G T AA T C内参基因C y t b-3 pAA G G GAAAA G GAA G T GAAA G内参基因表2 仿刺参-T h y m o s i n的RA C EP C R反应体系 T a b.2 R A C EP C Rs y s t e mo fA j -t h y m o s i n试剂R e g e n t使用量/LV o l u m e试剂R e g e n t使用量/LV o l u m e5 R A C EP C R3 R A C EP C RA d v a n t a g e2B u f f e r2.0反转录产物R e v e r s e t r a n s c r i p t i o np r o d u c t i o nXd N T P(1 0m o l/L)0.41c D NAD i l u t i o nB u f f e r 1 0.0 0-XA d v a n t a g eP o l y m e r a s eM i x0.4T h y-3 r(1 0m o l/L)2.0 0U PM2.03 R A C EO u t e rP r i m e r(1 0m o l/L)2.0 0T h y-5 r0.41 0L AP C RB u f f e r(M g2+P l u s)5.0 05 c D NA1.0T a k a r aL A T a q(5U/L)0.2 5S t e r i l eH2O1 3.8S t e r i l eH2O3 0.7 5总体积T o t a l v o l u m e2 0.0总体积T o t a l v o l u m e5 0.0 0注:X为反转录时加入R NA的量.N o t e:Xd e n o t e s t h ev o l u m eo fR NAi nr e v e r s e t r a n s c r i p t i o n.1.2.2 生物信息学分析在美国国家生物技术信息中心网站(h t t p:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/g o r f/g o r f.h t m l)进行开放阅读框的预测和保守结构域分析;采用E x p e r tP r o-t e i nA n a l y s i sS y s t e r m(h t t p:/www.e x p a s y.o r g/t o o l s/)进行核酸和氨基酸序列的翻译;在S MA R T平台(h t t p:/s m a r t.e m b l-h e i d e l b e r g.d e/)进行蛋白二级结构预测。采用M E G A4.0软件对不同物种氨基酸序列进行比对后构建系统发育进化树,自展值设置为1 0 0 0次重复。1.2.3 仿刺参免疫将同一批次的3 0 0头健康仿刺参平均分为5组:对照组与4个免疫刺激组。试验采用灭菌注射器对仿刺参进行体腔注射,对照组注射灭菌海水,刺激组分别注射不同的菌液。试验采用的注射剂量均为1 0 0L/头6。每组在注射后4、2 4、4 8、7 2h和9 6h分别选取9头仿刺参解剖并获取体腔液,随机分成3份,每3头混合成1份,4,3 0 0 0r/m i n(离心半径1 0c m)离心1 0m i n,弃上清液收集体腔细胞保存用于R NA提取。1.2.4 荧光定量试验使用P r i m e S c r i p tTMR T M a s t e rM i x(P e r f e c tR e a lT i m e)试剂盒对总R NA进行反转录。反转录后获得c D N A样品。使 用T BG r e e nTMP r e m i xE xT a qTM(T l iR N a s e HP l u s)试剂盒进行实时荧光定量P C R,以C y t b作为内参基因(表1)7。反应体系为:0.4LR O XR e f e r e n c eD y e(5 0),1Lc D N A模板,1 0LT BG r e e nP r e m i xE xT a q(T l iR N a s eHP l u s)(2C o n c.),正、反引物各0.8L,7Ld H2O。每个样本重复3次。采用2-Ct法对实时荧光定量P C R所获取的Ct值进行分析。不同组之间表达差异水平采用S P S S1 7.0软件进行单因素方差分析和邓肯多重比较,P0.0 5表示差异显著。856水 产 科 学第4 2卷2 结果与分析2.1 仿刺参-胸腺素基因结构分析根据仿刺参-胸腺素已知的部分序列,设计3 和5 末端引物(表1),采用R A C E法进行克隆,将得到的3 和5 末端序列和已知序列进行拼接,获得仿刺参-胸腺素的mR NA全长1 8 7 7b p,命名为A j-T h y m o s i n。序列提交至美国国家生物技术信息中心数据库,获得登录号:MF 9 8 9 2 2 6。开放阅读框(O R F)长1 2 6b p,翻译后氨基酸序列为4 1个,分子量为4.6k u,理论等电点为5.2 5,结构分析发现存在保守的-胸腺素肌动蛋白结合基序(THY),不存在跨膜结构(图1)。2.2 仿刺参-胸腺素蛋白序列的进化分析将A j-T h y m o s i n基因的氨基酸序列和其他物种的氨基酸序列(表3)进行比对分析发现,在仿刺参-胸腺素中存在着保守的功能序列E VA S F D K-S K L K(9-1 9)8和保守的G-a c t i n结合结构域L KK-T E T9(图1)。系统进化分析显示A j-T h y m o s i n基因和紫色球海胆(S t r o n g y l o c e n t r o t u sp u r p u r a t u s)、图1 仿刺参-胸腺素的序列(a)和结构(b、c)分析F i g.1 S e q u e n c e(a)a n ds t r u c t u r e(b,c)a n a l y s e s o fA j -t h y m o s i na.灰色标记部分为开放阅读框,黄色标记部分为G-a c t i n结合结构域,红色氨基酸序列为保守功能区;b、c分别为功能结构域和二级结构.a.t h eO R Fa n dG-a c t i nb i n d i n g r e s i d u e s a r eh i g h l i g h t e d i ng r e ya n dy e l l o w,r e s p e c t i v e l y;t h e r e da m i n oa c i ds e q u e n c e i s c o n s e r v a t i v e f u n c t i o n-a l r e s i d u e s;ba n dc.t h e f u n c t i o n a l s t r u c t u r ea n ds e c o n d a r ys t r u c t u r e,r e s p e c t i v e l y.表3 不同物种-胸腺素的氨基酸序列 T a b.3 T h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f -t h y m o s i nf r o md i f f e r e n t s p e c i e s物种名S p e c i e s-胸腺素的氨基酸序列Am i n oa c i ds e q u e n c eo f-t h y m o s i nG e n B a n k编号G e n B a n kn u m b e r人H o m os a p i e n sM S D K P DMA E I E K F D K S K L KK T E T Q E KN P L P S K E T I E Q E KQA G E SAAA 3 6 7 4 5.1牛B o s t a u r u sM S D K P DMA E I E K F D K S K L KK T E T Q E KN P L P S K E T I E Q E KQA G E SAA P 3 3 2 7 9.1斑马鱼D a n i or e r i oM S D K P N L E E V T S F D K T K L KK T E T Q E KN P L P S K E T I E Q E KQA G S SN P_0 0 1 1 2 4 1 6 9.1九孔鲍H a l i o t i sd i v e r s i c o l o r s u p e r t e x t aMG D K P D V S AVA T F D K S K L KKT D T E I KN P L P T K E T I E Q E KA E Q GA BW 0 4 6 2 2.1紫色球海胆S.p u r p u r a t u sMA D K P D V S E VA S F D K S K L KKA E T Q E KN T L P T K E T I E Q E K T AN P_9 9 9 7 9 1.2海绵S y c nr a p h a n u sMG D K P D V S E VA S F D K T K L KK T E T A E KN P L P T K E T I E Q E K S A SAA G 0 8 9 6 3.1仿刺参A.j a p o n i c u sM S D K P D I S E VN S F D K T K L KK T E T A E KN T L P T K E T I E Q E KA TAY P 7 1 0 0 0.1956第4期孙红娟等:仿刺参-胸腺素基因的克隆和表达分析海绵和九孔鲍的-胸腺素聚为一支(图2)。2.3 仿刺参-胸腺素在不同组织和不同发育时期的表达模式实时荧光定量P C R测得A j-T h y m o s i n基因在不 同 组 织 的 表 达 结 果 见 图3。A j-T h y m o s i n基因在体 腔 细 胞 和 呼 吸 树 中 高 表 达,并 且 与 肠道、管足、肌肉和体壁组织中的表达量 存在显著差异。-胸腺素在仿刺参不同发育时期的表达结果见图4。A j-T h y m o s i n基因在受精卵期、原肠胚期和囊胚期低表达,从小耳幼体期开始显著上调,并 且 在 稚 参 期A j-T h y m o s i n基 因 的 表 达 量达到最高。图2 仿刺参-胸腺素的系统进化树F i g.2 P h y l o g e n e t i c t r e eo fA j -t h y m o s i n图3-胸腺素基因在仿刺参不同组织中的表达模式F i g.3 E x p r e s s i o n l e v e l o fA j -t h y m o s i na td i f f e r e n t t i s s u e s i ns e ac u c u m b e rA.j a p o n i c u s图4-胸腺素基因在仿刺参不同发育时期的表达模式F i g.4 E x p r e s s i o n l e v e l o fA j -t h y m o s i na td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a l s t a g e s i ns e ac u c u m b e rA.j a p o n i c u s066水 产 科 学第4 2卷2.4 不同病原菌刺激后仿刺参-胸腺素基因的表达变化采用4种病原菌对仿刺参进行免疫刺激,检测体腔细胞中A j-T h y m o s i n基因在刺激后4、1 2、2 4、4 8、7 2、9 6h的表达变化情况(图5)。对照组注射灭菌海水,在注射后6个时间点也同时取样。在蜡样芽孢杆菌组中,A j-T h y m o s i n基因在4h表达水平显著下调,在1 2h表达水平显著上调并达到最高水平,随后在2 4、4 8h表达水平下调,在7 2h表达水平小幅度上调后在9 6h表达水平又下调(图5 a)。在希瓦氏菌组中,A j-T h y m o s i n基因在4h表达水平也出现显著下调,从1 2h开始表达水平开始上调,在4 8h表达水平达到最高,随后在7 2h表达水平开始下调,9 6h表达水平显著下调(图5 b)。在假交替单胞菌组中,A j-T h y m o s i n基因在注射后4、1 2h表达水平下调,至2 4h表达水平上调并达到峰值,4 8h表达水平上调但是上调不显著,在7 2、9 6h表达水平均下调(图5 c)。在灿烂弧菌组中,A j-T h y m o s i n基因在4、1 2、2 4h均下调,4 8h表达水平显著上调达到最高,随即在7 2、9 6h表达水平均下调(图5 d)。图5 仿刺参体腔细胞中-胸腺素基因在4种病原菌刺激条件下的表达变化F i g.5 E x p r e s s i o no fA j -t h y m o s i n i nc o e l o m o c y t e s c h a l l e n g e db yf o u rp a t h o g e n s-胸腺素的相对表达量以C y t b的表达水平作为对照;柱形图代表相对表达量的平均值标准误;*表示相对于对照组有显著差异(P 0.0 5).R e l a t i v ee x p r e s s i o no fA j-t h y m o s i n i sn o r m a l i z e dt ot h ee x p r e s s i o no fC y t b;t h eb a r s i n d i c a t em e a ne x p r e s s i o no f3t e s t e dp o o l s S E;*r e p r e s e n t s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea t t h e l e v e l o fP0.0 5r e l a t i v e t oa p p r o p r i a t ec o n t r o l.3 讨 论抗菌肽具有广谱抗菌作用,在非特异性免疫系统中占据着重要位置。在海参抗菌肽研究方面,B e a u r e g a r d等1 0从冰岛刺参(C u c u m a r i af r o n d o s a)体腔液中分离出一种可以抑制绿脓杆菌(P s e u d o-m o n a sa r u g i n o s a)和 金 黄 色 葡 萄 球 菌(S t a p h y l o-c o c c u sa u r e u s)生长的抗菌肽。王明昌1 1从仿刺参消化道内分离出一种显著抑制蛭弧菌的抗菌肽。笔者克隆了一种仿刺参抗菌肽A j-T h y m o s i n基因,通过序列结构、组织、发育和免疫表达分析,探索A j-T h y m o s i n基因是否具有免疫活性并且参与机体的免疫应答反应。3.1 仿刺参-胸腺素基因的序列特征胸腺素广泛地存在于脊椎动物和无脊椎动物中,目前发现至少存在1 5种-胸腺素1 2。笔者在仿刺参中克隆得到了A j-T h y m o s i n基因,氨基酸序列为4 1个,分子质量为4.6k u,等电点为5.2 5,具有高度保守的G-a c t i n结合序列L KK T E T9,这些特征均表明A j-T h y m o s i n基因属于-胸腺素家族的成员。通过进化分析发现,仿刺参-胸腺素和紫色球海胆、海绵和九孔鲍的-胸腺素聚为一支。海166第4期孙红娟等:仿刺参-胸腺素基因的克隆和表达分析胆(P a r a c e n t r o t u s l i v i d u s)中的-胸腺素能够和G-a c t i n结合并参与机体抗菌免疫反应8。仿刺参和海胆-胸腺素都有相同的保守功能结构域E VA S-F D K S K L K(9-1 9)8,因此推测A j-T h y m o s i n基因中也具有免疫功能。3.2 仿刺参-胸腺素基因的功能分析在仿刺参不同发育时期,免疫系统也处在一个动态发育的过程。A j-T h y m o s i n基因的表达量从小耳幼体期开始表达上调。小耳幼体期是仿刺参胚胎发育结束幼体发育的开始,此时消化道开始分化,免疫系统也开始形成,表明A j-T h y m o s i n基因在机体发育过程中起到关键作用。-胸腺素在不同物种体内具有组织表达特异性,在仿刺参体腔细胞中表达最高。这与-胸腺素在斑节对 虾(P e n a e u sm o n o d o n)1 3、合 浦 珠 母 贝(P i n c t a d af u c a t a)1 4、皱纹盘鲍(H.d i s c u sd i s-c u s)1 5、九孔鲍1 6、中华绒螯蟹(E r i o c h e i rs i n e n-s i s)1 7中的组织分布研究结果相似。由于体腔细胞、血淋巴细胞和血细胞在无脊椎动物中发挥免疫作用1 3,因此推测A j-T h y m o s i n基因具有免疫活性。-胸腺素具有抗菌和抗病毒活性,许多研究发现病原体能够引起-胸腺素上调表达。在斑节对虾1 3、日本囊对虾(M a r s u p e n a e u sj a p o n i c u s)1 8、克氏原螯虾(P r o c a m b a r u sc l a r k i i)1 9、长牡蛎(C r a s-s o s t r e ag i g a s)2 0、皱纹盘鲍1 5、九孔鲍1 6、中华绒螯蟹1 7和卵形鲳鲹(T r a c h i n o t u s o v a t u s)2 1面对细菌、病毒或免疫刺激剂刺激时,-胸腺素的相对表达量出现了不同程度上升。仿刺参受到4种不同病原菌刺激后,A j-T h y m o s i n基因的表达量在4h均发生下调。有研究显示,仿刺参体内9个免疫相关基因在病原菌刺激后4h的表达水平也均发生了下调2 2-2 3,这表明仿刺参免疫系统中一些免疫因子在病原入侵初期会受到抑制。在蜡样芽孢杆菌和希瓦氏菌组,A j-T h y m o s i n基因的表达量在1 2h开始上调。在假交替单胞菌组,A j-T h y m o s i n基因的表达量在2 4h开始上调。在灿烂弧菌组,A j-T h y m o s i n基因的表达量在4 8h开始上调。A j-T h y m o s i n基因开始上调表达的时间不同可能是由不同细菌的细胞毒性不同造成的。A j-T h y m o s i n基因的动态表达模式表明其参与了仿刺参体腔细胞免疫应答的过程。4 结 论-胸腺素作为一种抗菌肽,具有广谱抗菌活性。A j-T h y m o s i n基因具有-胸腺素家族成员特有并且高度保守的结构域,参与了仿刺参机体发育和免疫防御过程,这将为新型抗菌肽研究和病害防控提供理论支持。参考文献:1GO L D S T E I N A L.H i s t o r yo ft h ed i s c o v e r yo ft h et h y m o s i n sJ.A n n a l so ft h eN e w Y o r k A c a d e m yo fS c i e n c e s,2 0 0 7,1 1 1 2(1):1-1 3.2S T O E VAS,HR G E RS,VO E L T E R W.An o v e l-t h y m o s i nf r o mt h es e au r c h i n:e x t e n d i n gt h ep h y l o g e-n e t i cd i s t r i b u t i o no f-t h y m o s i n sf r o m m a mm a l st oe-c h i n o d e r m sJ.J o u r n a l o fP e p t i d eS c i e n c e,1 9 9 7,3(4):2 8 2-2 9 0.3HU F FT,M L L E RCS,O T T O A M,e ta l.B e t a-t h y m o s i n s,s m a l l a c i d i c p e p t i d e s w i t hm u l t i p l ef u n c t i o n sJ.T h eI n t e r n a t i o n a lJ o u r n a lo fB i o 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l.-T h y m o s i n sp a r-t i c i p a t e i na n t i v i r a l i mm u n i t yo f r e ds w a m pc r a y f i s h(P r o-c a m b a r u s c l a r k i i)J.D e v e l o