附子-肉桂对慢传输型便秘大鼠5-HT信号通路及c-Kit表达的影响.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究附子-肉桂对慢传输型便秘大鼠5-HT信号通路及c-Kit表达的影响张远哲1，黎豫川2，赵罗娜1（1.贵州中医药大学基础医学院 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第二附属医院 贵阳 550025）摘要：目的研究不同比例附子-肉桂配伍通过调控STC大鼠5-HT信号通路及c-Kit表达改善肠道动力的作用机制。方法运用盐酸洛哌丁胺灌胃建立STC大鼠模型，随机分为空白组、模型对照组、附子-肉桂（2 1）组，附子-肉桂（1 2）组、附子-肉桂（1 1）组、莫沙必利组。各组按照对应药物或蒸馏水灌胃14天。观察大鼠一般情况，计算大鼠粪便粒数、肠道推进率，HE观察大鼠结肠病理改变，ELISA法测定大鼠血清、结肠5-HT含量，免疫荧光染色检测结肠CgA阳性表达，免疫组化法检测结肠5-HT3R/5-HT4R、c-Kit表达情况，RT-PCR法检测5-HT3R/5-HT4R mRNA表达水平。结果各组大鼠结肠无明显病理改变，与空白组相比，模型对照组大鼠粪便含水率、肠道推进率显著降低（P0.01），5-HT含量明显下调，CgA、5-HT3R/5-HT4R蛋白与基因表达水平均显著下降（P0.01），c-Kit表达减少。与模型组相比，附子-肉桂（2 1）组、附子-肉桂（1 1）组、莫沙必利组粪便粒数、肠道推进率、5-HT含量、c-Kit、CgA阳性表达显著增加（P0.01），5-HT3R/5-HT4R蛋白与基因表达水平显著上调（P0.01）。结论附子-肉桂2 1及1 1比例配伍能明显增加粪便粒数，提高肠推进率，其作用可能与通过调节结肠c-Kit、CgA表达，增加Cajal间质细胞数及5-HT含量，从而上调5-HT3R/5-HT4R表达有关。关键词：慢传输型便秘 附子-肉桂配伍 肠道动力 Cajal间质细胞 5-HTdoi:10.11842/wst.20220128012 中图分类号:R285.5 文献标识码:A慢传输型便秘（Slow transit constipation，STC）属于功能性便秘，主要表现为排便次数减少或粪便难以自主排出，以肠道传输能力降低为主要病理特征。相关研究表明，全球慢性便秘的发病率逐年上升1。长期STC会诱发结肠癌、直肠癌，此外还会引起相关心脑血管疾病，研究显示STC的发生给患者带来了较大程度的心理负担及经济压力2-5。目前 STC的临床治疗方法存在一定的局限性，缺乏治疗 STC 的特效药和方法。现代医学治疗主要采用缓泻剂和促动力剂、生物反馈和手术等方法，但均有一定的禁忌症和副作用6-8。由于中药具有多途径、多靶点、多层次的特点9，近年来成为治疗 STC药物研究的热点领域。中医学认为便秘的病位在大肠，大肠主传导糟粕的动力来自于体内阳气的推动。由于大多数便秘患者滥用泻剂等原因，导致长期患病后脾肾阳气损伤，阳气不足则大肠推动无力，导致便秘进一步加重，因此温阳药物的应用在便秘的治疗中非常重要。研究证实肠道动力异常是STC的重要病理改变，与肠道动力相关的 Cajal 间质细胞（Interstitial cells of Cajal，ICC）及相关神经递质被广泛用于STC治疗药物及手段的研究。Cajal间质细胞可以介导肠神经传递，通过促进结肠运动以推进粪便在肠道内的运转，其数 收稿日期：2022-01-28 修回日期：2022-08-09 贵州省科学技术厅贵州省省级科技计划项目资助（黔科合基础20201Y362）：基于“阳主动”理论对附子配肉桂调控慢传输型便秘大鼠肠动力及结肠SCF/c-kit基因表达的研究，负责人：黎豫川；贵州省中医药管理局一般项目（QZYY-2021-016）：基于5-HT-5-HT3R/5-HT4R探讨附子配伍肉桂对STC模型大鼠肠道动力的影响，负责人：张远哲。通讯作者：黎豫川，副主任药师，医学博士，主要研究方向：方剂配伍规律及临床应用研究。1111 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 量分布、形态结构及功能正常是维持肠道动力的重要保证，而c-Kit是维持Cajal间质细胞发育、生长的必备条件，研究发现 STC 患者乙状结肠内 c-Kit 阳性的Cajal间质细胞面积明显减少10-11。5-HT作为机体的重要神经递质，与人体胃肠道动力的调节有密切联系。人体大约95%的5-HT产生于肠道，经肠嗜铬细胞（Enterochromaffin cells，ECs）和肠肌间神经丛合成，经肠道合成释放的5-HT通过作用于5-HT3受体（5-hydroxytryptamine3 receptor，5-HT3R）和 5-HT4 受体（5-hydroxytryptamine 4 receptor，5-HT4R）来调节胃肠道动力和肠内容物转运12。研究显示总5-HT表达水平在STC患者结肠壁中呈下降趋势13，5-HT3R明显减少、表达降低，同时5-HT4R在黏膜层、黏膜下神经丛、肌间神经丛及肌层中的表达下降14。而5-HT4R激动剂莫沙必利等能够促进胃肠道平滑肌收缩和蠕动，同时能够增加近端结肠传输动力15-19。可见STC的发生与5-HT3R/5-HT4R受体减少而影响了肌间神经丛内5-HT的正常传递继而影响肠道蠕动、肠分泌反射活动有关。因此通过c-Kit及5-HT-5-HT3R/5-HT4R来影响胃肠动力和传导功能是治疗 STC的重要途径之一。本 研 究 基 于 c-Kit、ECs 及 5-HT-5-HT3R/5-HT4R，应用温阳经典药对附子-肉桂观察对STC大鼠肠动力的影响及其部分机制。1 材料与方法 1.1实验药物附子-肉桂配伍水煎液制备方法：白附片、肉桂饮片购自贵州中医药大学第二附属医院（生产厂家：贵 阳 济 仁 堂 中 药 饮 片 厂，生 产 批 号：20200801，20200901）。分别称取饮片白附片 10 g/肉桂 5 g（2 1比例）、白附片5 g/肉桂5 g（1 1比例）、白附片5 g/肉桂10 g（1 2比例）。成人附片10 g/肉桂5 g（2 1比例）用量含生药为15 g，依据人与大鼠体表面积系数法换算大鼠用药剂量，大鼠1日剂量=6.25（15 g/70 kg），计算得出大鼠给药剂量为1.3 gkg-1d-1；成人白附片5 g/肉桂5 g（1 1比例）用量含生药为10 g，计算得出大鼠给药剂量为0.9 gkg-1d-1；成人白附片5 g/肉桂10 g（1 2比例）用量含生药为 15 g，计算得出大鼠给药剂量为1.3 gkg-1d-1。采用以下方法制备两药不同比例水煎液：两药混合浸泡30 min，煎煮2次，每次煎30 min，过滤，合并滤液，60水浴浓缩为每毫升 0.13 g、0.09 g、0.13 g生药材浓度的药液，4保存备用。枸橼酸莫沙必利（生产厂家：亚宝药业集团股份有限公司，210123，规格：5 mg/片）。将枸橼酸莫沙必利片研磨至粉末状，再用蒸馏水配制成0.13 mgmL-1混悬液（根据成人剂量换算成大鼠剂量，成人每日口服剂量为15 mg，标准成人体质量为70 kg，得出大鼠每日给药剂量为1.3 mgkg-1现用现配）。盐酸洛哌丁胺（生产厂家：西安杨森制药有限公司，产品批号：JGJOM4J，规格：2 mg/粒），用蒸馏水配制成0.2 mgmL-1混悬液，现用现配。1.2动物SD大鼠70只（SPF级），雌雄各半，6-8周龄，体质量为20020 g。由成都达硕实验动物中心提供，生产许可证号为：SYXK（川）2015-010。采用分笼饲养，每笼5只大鼠，自由饮食、饮水。1.3试剂苏木素染液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：ZH202509，规格：500 mL/瓶）；伊红染液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：CR2011064，规格：500 mL/瓶）；DAPI染色试剂（北京中杉金桥生物有限公司，批号：ZLI-9557）；正常山羊血清（北京中杉金桥生物有限公司，批 号：SP9002）；一 抗（CgA，Proteintech，批 号：10529-1-AP）；二抗（FITC 标记山羊抗兔，Servicebio，批 号：GB22303）；一 抗（5-HT3R，Abclonal，批 号：A5647）；一抗（5-HT4R，abcam，批号：Ab5149244）；二抗（碧云天，批号：A0208）；RNA Trizol Reagent（合肥博美生物科技有限公司，批号：BM1144）；PrimeScript RT reagent Kit（宝日医生物技术有限公司，批号：RR047A）；TB Green TM Premix Ex TaqTM （Tli RNaseH Plus，宝日医生物技术有限公司，批号：RR820A）；Rat 5-HT ELISA KIT（上海茁彩生物科技有限公司，批号：ZC-35959）。1.4仪器RS36型全自动染色机（常州派斯杰医疗设备有限公司）；PHY-型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司，型号：BA410）；数字切片扫描仪（OLYMPUS（JAPAN），型号：VS200）；酶标仪（美谷分子仪器有限公司生产，型号：SpectraMAX Plus384）；高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号：KZ-III-F）；电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司，型号：DZKW-4）；实时荧光定量（RT-PCR）仪（美国ThermoFisher仪1112 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究器有限公司，型号：QuantStudio TM3）。1.5实验方法1.5.1造模及分组所有大鼠适应性饲养1周，随机分为空白组（15只）和模型组（55只）。模型组大鼠每日给予3 mgkg-1盐酸洛哌丁胺混悬液灌胃，连续给药14天。空白组相同时间予蒸馏水灌胃，连续灌胃14天。造模结束后每组随机选择5只大鼠计算24 h粪便粒数及肠推进率。粪便粒数减少、肠道推进率减缓提示造模成功。造模成功后，模型组大鼠随机分为模型对照组、附子-肉桂（2 1）组、附子-肉桂（1 2）组、附子-肉桂（1 1）组、莫沙必利组，每组10只。1.5.2干预方法附子-肉桂（2 1）组、附子-肉桂（1 1）组、附子-肉桂（1 2）组分别给予相应浓度水煎液灌胃，莫沙必利组给予1.3 mgkg-1枸橼酸莫沙必利混悬液灌胃，空白组和模型对照组大鼠给予 10 mLkg-1体积蒸馏水灌胃，各组大鼠均连续灌胃给药14天。1.5.3粪便粒数检测各组随机选择5只大鼠，分别于造模结束后、末次给药后取24 h大便，计算大便粒数；给药期间观察大鼠一般情况、粪质干湿情况。1.5.4肠道推进率检测分别于造模结束后、末次给药后各组随机选择5只大鼠，灌胃10%碳末，20 min后处死，迅速取出肠道，直尺记录幽门至回盲部总长度、幽门到墨汁推进前端的距离，按照“推进距离/幽门至回盲部总长度100%”计算肠推进率。1.5.5HE染色观察结肠病理变化末次给药后取大鼠结肠组织，石蜡包埋。石蜡切片脱蜡至水，苏木精染色，冲洗，分化，返蓝；冲洗后放入85%的酒精，伊红染色；水洗，脱水，透明，封固。采用 3DHISTECH（Hungary）生产的 Pannoramic 250数字切片扫描仪对切片进行图像采集，观察病变。1.5.6免疫荧光检测结肠嗜络粒蛋白A（CgA）表达石蜡切片脱蜡至水，浸入pH=6.0的柠檬酸盐缓冲液中，高火加热 10 min，停火 8 min，中高火再加热10 min；冷却后，PBS冲洗，重复3次，每次5 min抗原修复；加封闭液；滴加一抗过夜；PBS冲洗，重复3次；滴加二抗；PBS 冲洗，重复 3 次；滴加 DAPI，室温孵育10 min；PBS洗3次，每次5 min；使用抗荧光衰减封片剂封片。使用显微摄像系统进行图像采集。1.5.7ELISA法检测血清、结肠5-HT表达取部分结肠组织准确称取质量，除去残留血液，按质量体积比1 9加入PBS，使用组织研磨仪进行组织匀浆，匀浆液在5000g条件下，离心10 min，取上清液待测。空白对照孔加入显色剂A、B和终止液；加入配好的标准品、样本，盖封板膜，轻轻振荡混匀，37温育。弃去液体，甩干，加洗涤液，静置后弃去，拍干。先后加入底物液，震荡混匀后避光显色。加终止液终止反应。15 min内、450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。同样方法检测血清5-HT含量。1.5.8RT-PCR法检测结肠5-HT3R/5-HT4R mRNA表达水平取适量组织转移至已加入1 mL TRIzol的1.5 mL无酶EP管中，用高速低温组织研磨仪捣碎。将样品在室温（15-30）放置5-15 min，使核酸蛋白复合物完全分离。取澄清的匀浆液，每使用1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡，室温放置。2-8 12000 rmin-1离心15 min。把水相转移到新的无酶EP管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀，室温放置。2-8 12000 rmin-1离心15 min，弃其上清液。用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol至少加1 mL 75%乙醇。室温放置，2-8 5000 rmin-1离心3 min，弃上清。用枪头小心吸出残余酒精。加入10 L DEPC水，4放置备用。依次加入各试剂后，42，2 min进行基因组DNA去除反应，依次加入各试剂，置 PCR 仪上进行逆转录反应。NCBI数据库搜索基因全序列，使用Primer Premier引物设计软件设计筛选各基因特异性引物。所有引物均交由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，并以ULTRAPAGE纯化（详见表1）。Thermo Scientific PikoReal 软件分析 PCR 过程各表1本次检测所用引物及碱基序列引物名称-actin5-HT3R5-HT4R上游GGGAAATCGTGCGTGACATTTGCTGATAGCCCAGGGAGAAGGGCTCACGTTCTTCGCAATGGTTATC下游GCGGCAGTGGCCATCTCAGTTAGCCAGGAGGTGATCTGACAGAGCAGATCAGCAAAGGCAAGAGAC1113 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 检测样本的CT（Threshold cycle）值。1.5.9免疫组化法检测结肠c-Kit及5-HT3R、5-HT4R表达水平石蜡切片脱蜡至水，进行抗原修复，阻断内源性过氧化物酶；滴加山羊血清封闭液，滴加一抗，4过夜；PBS洗3次，滴加二抗，DAB显色液显色，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，洗涤切片终止显色；复染细胞核：苏木素复染3 min，自来水洗，清水返蓝后流水冲洗；将切片依次置于75%、85%、95%、无水乙醇、二甲苯中分别浸泡10 min，中性树胶封片。使用显微摄像系统对切片进行图像采集，使用Halo数据分析系统 计 算 每 张 图 像 阳 性 面 积 占 比（%DAB Positive Tissue）。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。1.6统计学分析各组数值采用均值标准差（x s）表示，用SPSS 19软件分析，各组采用单因素方差分析及LSD法比较，当P0.05时认为差异具有统计学意义。2 结果 2.1各组大鼠一般情况变化模型建立期间，空白组大鼠活动自如、反应迅速、抓爬有力、毛发光泽、饮食饮水正常、大小便正常。模型组灌胃后期出现大便减少、干燥，同时大鼠活动减少、反应迟缓、毛发苦涩脱落，进食量减少。各组大鼠干预后上述情况均有所改善，不同比例附子-肉桂配伍组大鼠大便性状、排便量好转外，毛发脱落、活动量、进食量有明显改善，其中以附子-肉桂2 1配伍组最为明显，附子-肉桂1 1、1 2配伍组次之。莫沙必利组与各比例附子-肉桂配伍组相比，大鼠毛发脱落、进食量无明显改善。2.2各组大鼠 24 h 粪便粒数及大鼠肠道推进率变化造模后，与空白组相比各造模组24 h粪便粒数、肠道推进率明显降低，差异具有统计学意义（P0.01），说明STC模型造模成功且较为稳定，见图1。给药后，与模型组比较，以附子-肉桂（2 1）组、莫沙必利组大鼠粪便粒数、肠道推进率增高，统计学差异明显（P0.01），其中以莫沙必利组最高，附子-肉桂（2 1）组次之。附子-肉桂（1 1）组粪便粒数、肠道推进率较模型组增加（P0.05），但低于附子-肉桂（2 1）组。附子-肉桂（1 2）组粪便粒数较模型组增加（P0.05），肠道推进率与模型组相比无差异，其粪便粒数与肠道推进率在各给药组中最低。见图2。2.3各组结肠病理学改变情况光镜下400倍观察结肠病理染色图片发现，空白组大鼠结肠黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层结构较完整，未见明显病理改变。模型对照组大鼠结肠形态结构较完整，有个别样本出现杯状细胞减少，偶见少量炎性细胞浸润，结缔组织内偶见散在分布单个淋巴细胞或中性粒细胞，组织未见明显坏死和大量炎细胞浸润。各干预组大鼠结肠偶见杯状细胞数量减少和炎性细胞浸润，大多数样本形态结构正常，未见明显组织病理损伤,提示造模及给药干预未引发结肠组织病理学改变，见图3。2.4各组大鼠结肠CgA的表达变化嗜铬粒蛋白A（Chromogranin A，CgA）是一种存在于嗜铬细胞分泌颗粒中的酸性可溶性蛋白，在此用来标记嗜铬细胞。通过免疫荧光单染发现，给药后，模型组大鼠结肠CgA表达明显低于空白组，且差异具有统计学意义（P0.01）；与模型组相比，附子-肉桂（2 1）组、莫沙必利组 CgA 表达明显升高，差异显著（P0.01），其中附子-肉桂（2 1）组最高，莫沙必利组次之。图1造模后各组大鼠粪便粒数、肠道推进率比较（x s，n=5）注：A：空白组，造模后粪便粒数与模型组相比明显增高；B：模型组，造模后粪便粒数与空白组相比明显降低；与空白组比较，*P0.01。1114 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究附子-肉桂（1 1）组CgA表达虽有增高（P0.05），但低于附子-肉桂（2 1）组及莫沙必利组；附子-肉桂（1 2）组CgA表达较模型组增高，但不具备统计学差异，其表达在各治疗组中最低。见图4、图5。2.5各组大鼠结肠及血清5-HT变化给药后与空白组比较，模型组大鼠结肠、血清5-HT 浓度明显降低差异，差异具有统计学意义（P0.01）。与模型组相比，附子-肉桂（2 1）组、莫沙必利组结肠、血清 5-HT 含量增高，差异具有显著性（P0.01）；附子-肉桂（1 1）组大鼠结肠5-HT含量较模型组增高（P0.05），但含量值低于附子-肉桂（2 1）组及莫沙必利组；附子-肉桂（1 2）组大鼠结肠、血清 5-HT、附子-肉桂（1 1）组大鼠血清5-HT含量较模型组虽有所升高，但不具备统计学差异，且低于附子-肉桂（2 1）组及莫沙必利组。见表2。2.6不同比例附子-肉桂配伍对 STC 大鼠结肠 5-HT3R、5-HT4R mRNA表达的影响与空白组相比，模型组大鼠结肠组织中5-HT3R、5-HT4R mRNA表达明显下调，差异具有统计学意义（P0.01）。与模型组相比，莫沙必利组大鼠结肠 5-HT3R、5-HT4R mRNA 增高，差异具有显著性（P0.01）。附子-肉桂（2 1）组、附子-肉桂（1 1）组、附子-肉桂（1 2）组大鼠结肠5-HT3R mRNA均增高明显（P0.01），但以附子-肉桂（1 1）组最高、附子-肉桂（2 1）组次之，附子-肉桂（1 2）组最低。附子-肉桂（1 1）组5-HT4R mRNA 表达较模型组增高，差异明显（P图2不同比例附子-肉桂配伍对STC大鼠粪便粒数、肠道推进率的影响（x s，n=5）注：A：正常组，给药后与模型组相比粪便粒数、肠道推进率明显增高；B：模型组，给药后与空白组组相比粪便粒数、肠道推进率明显降低（P0.01）；C：附子-肉桂（2 1）组，给药后与模型组相比粪便粒数、肠道推进率明显增高（P0.01）；D：附子-肉桂（1 2）组，给药后与模型组相比粪便粒数增高（P0.05）、肠道推进率增高；E：附子-肉桂（1 1）组，给药后与模型组相比粪便粒数、肠道推进率明显增高（P0.05）；F：莫沙必利组，给药后与模型组相比粪便粒数、肠道推进率明显增高（P0.01）；与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。图3各组大鼠结肠组织病理形态学变化（HE，400）注：A：空白组，未见明显组织病理损伤；B：模型组，可见轻微炎性细胞浸润；C：附子-肉桂（2 1）组，可见轻微杯状细胞数量减少；D：附子-肉桂（1 2）组；未见明显组织病理损伤；E：附子-肉桂（1 1）组，可见轻微炎性细胞浸润；F：莫沙必利组，未见明显组织病理损伤。1115 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 0.01）；附子-肉桂（2 1）组5-HT4R mRNA表达较模型组增高（P0.015），但表达低于附子-肉桂（1 1）组；附子-肉桂（1 2）组 5-HT4R mRNA 表达虽较模型组增高，且差异不具备统计学意义，其表达在各治疗组中最低。见表3。2.7不同比例附子-肉桂配伍对 STC 大鼠结肠 5-HT3R、5-HT4R表达的影响与空白组比较，模型组大鼠结肠 5-HT3R、5-HT4R表达明显下调，差异具有统计学意义（P0.01）。与模型组比较，附子-肉桂（2 1）组、附子-肉桂（1 1）组5-HT3R阳性表达增高，差异具有显著性（P0.01），其中附子-肉桂（2 1）组高于附子-肉桂（1 1）组。附子-肉桂（1 2）组、莫沙必利组5-HT3R阳性表达较模型组增高，但低于附子-肉桂（2 1）、（1 1）组，且不具备统计学差异，其中以莫沙必利组最低。附子-肉桂（2 1）组、附子-肉桂（1 1）组及莫沙必利组大鼠结肠5-HT4R表达明显增高，差异具有显著性（P0.01），其中以莫沙必利组最高，附子-肉桂（1 1）组次之，附子-肉桂（2 1）组最低；附子-肉桂（1 2）组5-HT4R阳性表达虽较模型组增高，但不具备统计学差异，其表达在治疗组中最低。见图6、图7、图8。2.8不同比例附子-肉桂配伍对STC大鼠结肠c-Kit表达的影响c-Kit是Cajal间质细胞的特异性标志蛋白，可以根据c-Kit阳性表达水平反应Cajal间质细胞的变化。与空白组比较，模型组大鼠结肠c-Kit表达明显下调，差异具有统计学意义（P0.01）。与模型组比较，附子-肉桂（2 1）组、附子-肉桂（1 1）组、莫沙必利组表达明显上调，差异具有统计学意义（P0.01），其中以莫沙必利组最高，附子-肉桂（2 1）组次之，附子-肉桂（1 1）组最低。附子-肉桂（1 2）组大鼠结肠c-Kit表达明显增高（P0.05），但表达值低于附子-肉桂（1 1）图4不同比例附子-肉桂配伍对STC大鼠结肠CgA表达的影响注：A：正常组，给药后与模型组相比CgA表达明显增高；B：模型组，给药后与空白组组相比CgA表达明显降低（P0.01）；C：附子-肉桂（2：1）组，给药后与模型组相比 CgA 表达明显增高（P0.01）；D：附子-肉桂（1：2）组，给药后与模型组相比CgA表达增高；E：附子-肉桂（1：1）组，给药后与模型组相比CgA表达明显增高（P0.05）；F：莫沙必利组，给药后与模型组相比CgA表达明显增高（P0.01）；与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。图5不同比例附子-肉桂配伍对STC大鼠结肠CgA细胞表达的影响（400）注：DAPI染细胞核为蓝色，CgA显出的阳性表达为绿色；A：空白组，可见明显CgA阳性表达；B：模型组，CgA阳性表达不明显；C：附子-肉桂（2 1）组，可见明显CgA阳性表达；D：附子-肉桂（1 2）组，CgA阳性表达不明显；E：附子-肉桂（1 1）组，可见明显CgA阳性表达；F：莫沙必利组，可见明显CgA阳性表达。1116 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究组。见图9、图10。3 讨论 慢传输型便秘是慢性功能性便秘的高发病率类型，通常以不频繁的排便和硬便排便次数减少，便意不强或者有便意但粪便难以自主排出为特征1，肠道动力异常是STC的重要病理改变。研究证实STC患者存在明显胃肠道动力障碍，以结肠传输时间延长、进食后结肠高振幅推进收缩减少为特征20。本实验应用盐酸洛哌丁胺建立STC模型，大鼠出现精神萎靡、活动量、饮食量减少症状。结肠HE染色显示模型大鼠个别出现轻微杯状细胞数量减少或炎性细胞浸润，大体上未见明显病理改变，结肠形态结构较完整，结合粪质干燥、排便减少、肠推进率降低等综合分析，本实验成功制备慢传输型便秘的大鼠模型。本病病位在大肠，但与肺、脾、肾均有联系，多数便秘患者长期服用苦寒类攻伐药物，导致脾肾阳气耗伤，气化失司、津液枯涸、大肠传导无力21也是导致本病加重的重要因素。中医学认为“阳主动”，阳气是人体生命活动原动力，人体各种脏腑组织功能活动均依赖阳气的推动、温煦，大肠的传导功能也离不开阳气的鼓舞。因此本病治疗上当重视阳气对肠道的推动作用，正如黄宫绣在 本草求真 中所云：“若使水寒而冻，火不生水，水反凝结如土如石，则补不在于水而在于火，是有宜于附桂硫黄细辛之味矣”。现代医家也逐渐关注配伍温阳药在临床便秘治疗中的重要性，研究显示临床配伍应用辛温之附子、肉桂、干姜之类治疗STC获得了显著疗效22-23。附子-肉桂是中医经典温阳药对，在众多温阳方剂或温下剂中高频率出现，如右归丸、桂附理中丸、肾气丸等。目前对于附子-肉桂配伍改善肠道动力的研究尚属空白，本研究基于“阳主动”理论，探讨附子-肉桂配伍对肠道动力的影响，有助于扩大临床附子-肉桂临床应用范围，同时为温阳药在STC的合理配伍应用提供实验基础。本实验结果显示，附子-肉桂2 1、1 1比例配伍能够明显改善肠道推进率，增加粪便粒数，同时通过对大鼠一般情况观察发现，不同比例附子-肉桂配伍能够有效改善大鼠活动减少、反应迟缓、毛发苦涩脱落等表现，表明两药配伍在改善大鼠肠动力的同时能够明显改善生理病态情况。图6不同比例附子-肉桂配伍对STC大鼠结肠5-HT3R、5-HT4R表达的影响注：A：空白组，给药后与模型组相比5-HT3R、5-HT4R明显增高；B：模型组，给药后与空白组相比5-HT3R、5-HT4R明显降低（P0.01）；C：附子-肉桂（2 1）组，给药后与模型组相比5-HT3R、5-HT4R明显增高（P0.01）；D：附子-肉桂（1 2）组，给药后与模型组相比5-HT3R、5-HT4R增高；E：附子-肉桂（1 1）组，给药后与模型组相比5-HT3R、5-HT4R明显增高（P0.01）；F：莫沙必利组，给药后与模型组相比5-HT4R明显增高（P0.01）；与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。表3不同比例附子-肉桂配伍对STC大鼠结肠5-HT3R、5-HT4R mRNA的影响（x s，n=10）组别空白组模型组附子-肉桂（2 1）组附子-肉桂（1 2）组附子-肉桂（1 1）组莫沙必利组剂量-1.3 gkg-11.3 gkg-10.9 gkg-11.3mgkg-15-HT3R（2-Ct）1.0100.1560.2200.101*0.7230.186#0.6880.470#0.7500.335#0.7950.342#5-HT4R（2-Ct）1.0030.0960.1280.053*0.5930.114#0.3830.1430.8080.380#0.8480.194#注：与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。表2各组大鼠结肠及血清5-HT浓度的变化（x s，n=10）组别空白组模型组附子-肉桂（2 1）组附子-肉桂（1 2）组附子-肉桂（1 1）组莫沙必利组剂量-1.3 gkg-11.3 gkg-10.9 gkg-11.3 mgkg-1结肠5-HT（ngmL-1）3.490.311.740.51*3.270.36#2.130.262.340.35#3.180.22#血清5-HT（ngmL-1）9.061.575.371.55*8.091.32#6.5340.736.8201.578.2550.94#注：与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。1117 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 为探索附子-肉桂配伍对STC大鼠肠道动力的干预机制，本实验进一步对与肠道动力活动密切相关的Cajal间质细胞、5-HT及5-HT3R/5-HT4R的变化进行了研究。Cajal间质细胞是一种胃肠道起搏器细胞，可以介导肠神经传递，通过调节胃肠运动促进结肠运动以推进粪便在肠道内的运转，在调节肠胃运动中起到了重要作用，其减少及分布异常可能是引起STC结肠运动功能障碍的重要原因之一10-11,24。近年研究显示图8不同比例附子-肉桂配伍对STC大鼠结肠5-HT4R表达的影响（免疫组化，IHC400）注：苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色；A：空白组，可见明显5-HT4R阳性表达；B：模型组，5-HT4R阳性表达不明显；C：附子-肉桂（2 1）组，可见明显5-HT4R阳性表达；D：附子-肉桂（1 2）组5-HT4R阳性表达不明显；E：附子-肉桂（1 1）组，可见明显5-HT4R阳性表达；F：莫沙必利组，可见明显5-HT4R阳性表达。图7不同比例附子-肉桂配伍对STC大鼠结肠5-HT3R表达的影响（免疫组化，IHC400）注：苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色；A：空白组，可见明显5-HT3R阳性表达；B：模型组，5-HT3R阳性表达不明显；C：附子-肉桂（2 1）组，可见明显5-HT3R阳性表达；D：附子-肉桂（1 2）组5-HT3R阳性表达不明显；E：附子-肉桂（1 1）组，可见明显5-HT3R阳性表达；F：莫沙必利组，可见明显5-HT3R阳性表达。1118 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究STC患者结肠Cajal间质细胞数量有不同程度减少25。因此增加结肠组织中Cajal间质细胞数量是治疗STC的有效途径之一。c-Kit受体属于型酪氨酸激酶受体家族，是Cajal间质细胞的特异性标记物26。本实验对各组大鼠结肠c-Kit检测发现，模型对照组大鼠结肠c-Kit阳性表达明显低于正常组，与现有报道一致。通过检测各干预组大鼠结肠c-Kit阳性表达发现，各比例附子-肉桂配伍 c-Kit 阳性表达增强，其中以附子-肉桂2 1及1 1比例最为显著，与莫沙必利相当。可见附子-肉桂2 1及1 1比例配伍能够有效上调c-Kit表达、增加结肠Cajal间质细胞数来增加肠道动力。5-HT作为肠道重要的神经递质，在引发胃肠蠕动中起关键作用12。人体大约95%的5-HT产生于肠道，由肠道中的ECs合成、分泌，ECs是肠内分泌细胞的一种，肠嗜铬粒蛋白（Chromogranin A，CgA）是其标记蛋白。CgA在神经末梢、周围神经系统、中枢神经系统、肠道内分泌组织等均有分布，在体内可维持胃肠道张力和动力27。5-HT主要通过相关受体参与调节胃肠道动力和肠内容物转运12。5-HT受体存在 7大类型28，其中 5-HT3R、5-HT4R 与 STC 发病密切相关，两者主要作用在于引发肠道平滑肌收缩、调控神经递质释放、而使胃肠道蠕动、发挥促动力的作用29-30。实验研究发现，STC患者结肠总5-HT受体的表达水平在呈下降趋势11，5-HT3R明显减少、表达降低，同时5-HT4R在黏膜层、黏膜下神经丛、肌间神经丛及肌层中的表达下降12。因此通过 5-HT 调节 5-HT3R/5-HT4R 来影响胃肠动力和传导功能是治疗STC的关键之一。本实验对各组大鼠结肠及血清5-HT、结肠 CgA、5-HT3R/5-HT4R 检测发现，模型对照组大鼠结肠及血清 5-HT 含量、结肠 CgA 蛋白、5-HT3R/5-HT4R表达均明显低于正常组，与现有报道相图9不同比例附子-肉桂配伍对STC大鼠结肠c-Kit表达的影响注：A：空白组，给药后与模型组相比c-Kit表达明显增高；B：模型组，给药后与空白组相比c-Kit表达明显降低（P0.01）；C：附子-肉桂（2 1）组，给药后与模型组相比c-Kit表达明显增高（P0.01）；D：附子-肉桂（1 2）组，给药后与模型组相比c-Kit表达增高（P0.05）；E：附子-肉桂（1 1）组，给药后与模型组相比c-Kit表达明显增高（P0.01）；F：莫沙必利组，给药后与模型组相比c-Kit表达明显增高（P0.01）；与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。图10不同比例附子-肉桂配伍对STC大鼠结肠c-Kit表达的影响（免疫组化，IHC400）注：苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色；A：空白组，可见明显c-Kit阳性表达；B：模型组，c-Kit阳性表达不明显；C：附子-肉桂（2 1）组，可见明显c-Kit阳性表达；D：附子-肉桂（1 2）组c-Kit阳性表达不明显；E：附子-肉桂（1 1）组，可见明显c-Kit阳性表达；F：莫沙必利组，可见明显c-Kit阳性表达。1119 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 一致。通过检测各干预组大鼠结肠及血清5-HT含量及结肠CgA表达发现，各比例附子-肉桂配伍均有上调5-HT含量及CgA表达的作用，其中以附子-肉桂2 1及1 1比例最为显著，与莫沙必利相当。可见附子-肉桂2 1及1 1比例配伍能够有效增加结肠CgA蛋白表达及5-HT含量来增加肠道动力。现有研究结果指出5-HT通过5-HT3R、5-HT4R激活黏膜下感觉神经元而激发肠壁的蠕动反射，因此本实验进一步对各组大鼠结肠5-HT3R/5-HT4R mRNA及蛋白表达进行检测，结果显示附子-肉桂2 1及1 1比例配伍能够明显上调结肠结肠5-HT3R/5-HT4R mRNA及蛋白表达。由此可见附