环境相关浓度的氟西汀和帕罗西汀对章鱼脑组织五羟色胺能系统的影响.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.18,No.3 Jun.2023 基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(LY19C030001)第一作者:彭希健(1998),男,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20220628001彭希健,徐秋霞,张博,等.环境相关浓度的氟西汀和帕罗西汀对章鱼脑组织五羟色胺能系统的影响J.生态毒理学报,2023,18(3):398-409Peng X J,Xu Q X,Zhang B,et al.Effects of environmentally relevant concentrations of fluoxetine and paroxetine on serotonergic neurotransmitter sys-tems in octopus brain tissue J.Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(3):398-409(in Chinese)环境相关浓度的氟西汀和帕罗西汀对章鱼脑组织五羟色胺能系统的影响彭希健1,2,徐秋霞1,2,张博1,2,郭远明1,2,*1.浙江海洋大学海洋与渔业研究所,舟山 3160212.浙江省海洋水产研究所/浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室,舟山 316021收稿日期:2022-06-28 录用日期:2022-09-08摘要:近年来,随着抑郁症患者数量激增,抗抑郁性药物的使用量显著增加。由于药物具有特殊活性,常会对非目标生物的生理功能产生不良影响,干扰这些生物的生长发育,对其健康产生严重威胁。因此,本研究选取通过抑制五羟色胺(serotonin,5-HT)转运体提高突触间隙 5-HT 水平发挥治疗作用的 SSRI(selective serotonin reuptake inhibitor)类抗抑郁代表性药物氟西汀和帕罗西汀,探讨 2 种药物对章鱼脑组织 5-HT 能神经递质系统功能的影响。野生成体短蛸章鱼(O.ochellatus)于环境浓度的氟?西汀、帕罗西汀溶液中连续暴露 14 d,收集脑组织。通过 qPCR 和 Western blot 技术分析药物对章鱼脑组织 5-HT 能神经递质系统主要功能分子转录及表达水平的影响。结果显示,氟西汀和帕罗西汀引起章鱼脑组织中 5-HT 能系统重要功能分子转录及表达水平异常,表现为5-HTR1、5-HTR1B、5-HTR2A、SERTmRNA 转录水平降低及5-HTR1、5-HTR1B、5-HTR2A、SERT蛋白?表达水平升高,且具有药物特异性和剂量依赖性。此外,氟西汀与帕罗西汀混合暴露对章鱼脑 5-HT 能系统的影响程度弱于两者单独暴露,提示 2 种药物在干扰章鱼脑 5-HT 能系统正常功能过程中可能存在拮抗作用,通过比较二者的半衰期,认为氟西汀对于水生生态系统的影响更大。本研究结果表明,SSRI 类抗抑郁药物氟西汀和帕罗西汀暴露可引起章鱼脑组织 5-HT 能神经系统主要功能分子转录与表达水平异常,可能干扰其正常功能,严重威胁章鱼健康。本研究为进一步研究抗抑郁症药物对章鱼神经系统的不良影响提供科学依据,为研究其他药物对海洋生物的健康损害效应提供参考。关键词:氟西汀;帕罗西汀;短蛸章鱼;5-HT 能神经系统文章编号:1673-5897(2023)3-398-12 中图分类号:X171.5 文献标识码:AEffects of Environmentally Relevant Concentrations of Fluoxetine and Par-oxetine on Serotonergic Neurotransmitter Systems in Octopus Brain TissuePeng Xijian1,2,Xu Qiuxia1,2,Zhang Bo1,2,Guo Yuanming1,2,*1.Marine and Fishery Institute of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316021,China2.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang,Key Laboratory of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Re-source of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,ChinaReceived 28 June 2022 accepted 8 September 2022Abstract:In recent years,the use of antidepressants has increased significantly with the widespread epidemic ofdepression.Because of their special activity,they often have adverse effects on the physiological functions of non-第 3 期彭希健等:环境相关浓度的氟西汀和帕罗西汀对章鱼脑组织五羟色胺能系统的影响399 target organisms,interfere with the growth and development of these organisms,and seriously threaten their health.Fluoxetine and paroxetine are the representative selective serotonin reuptake inhibitor(SSRI)antidepressants,whichplay a therapeutic role in improving the level of serotonin(5-HT)of the synaptic cleft by inhibiting the 5-HT trans-porter(SERT).In this study,we selected them to explore their effects on the function of 5-HT energy neurotrans-mitter system in the brain of octopus(O.ochellatus).Adult octopus were exposed to fluoxetine and paroxetine so-?lutions for 14 d.And the brain tissues were collected after exposure.Quantitative RT-PCR(qPCR)and Westernblot were applied to detect the main functional molecules of 5-HT neurotransmitter system,both gene and proteinexpression in octopus brain tissue.The results showed that fluoxetine and paroxetine induced abnormal transcrip-tion of the important functional molecules of 5-HT energy system in octopus brain tissue.The transcriptional ex-pression levels of5-HTR1、5-HTR1B、5-HTR2A,andSERTdecreased,and the translational expression levels of5-HTR1、5-HTR1B、5-HTR2A,andSERTincreased with drug specificity and dose dependence.In addition,the?effects of fluoxetine and paroxetine combined exposure on octopus brain 5-HT energy system were weaker thanthose of the two alone,suggesting that the two drugs might have antagonistic effects on the normal functioning ofoctopus brain 5-HT energy system.By comparing their half-life,we believed that fluoxetine had a greater impacton the aquatic ecosystem.Our results indicated that the exposure to fluoxetine and paroxetine could cause abnormaltranscription of the main functional molecules of 5-HT energy nervous system in the octopus brain,leading to ab-normal manifestations such as delayed physiological development and inhibition of feeding behavior of octopus,which seriously threatened its health.This study provided a scientific basis for further study of the adverse effectsof antidepressants on the nervous system of octopus and a reference for the study of health damage effects of otherdrugs on marine organisms.Keywords:fluoxetine;paroxetine;short-arm octopus;5-HT neurotransmitter systems 药物的出现给人类身体健康和预期寿命带来不可否认的益处。然而,在许多个国家的内陆湖、地下水等多种环境水体中均可检测出人类使用的药物1-3。尽管这些药物的浓度较低(通常为纳克级别),但由于其源源不断地进入环境水体中,导致环境中的水生生物长期处于暴露状态,引起药物蓄积效应。由于药物本身所具有特殊生理活性,通常会对污染水体中的水生生物的生理功能产生影响,进而威胁其健康。因此,水体药物污染以及对水生生物健康的影响研究已然成为生态毒理学的研究热点之一。选择性五羟色胺重摄取抑制剂(selective seroto-nin reuptake inhibitor,SSRI)为通过特异性结合突触前膜血清素转运体(serotonin transporter,SERT),抑制突触前膜对突触间隙内 5-HT 的重摄取,从而增加细胞外 5-HT 浓度的一类药物4。SSRI 类药物主要包括氟西汀(fluoxetine)、帕罗西汀(paroxetine)、西酞普兰(citalopram)、舍曲林(sertraline)等。SSRIs 的广泛使用开始于 20 世纪 90 年代中期,由于安全性高、副作用小及在减少抑郁症和焦虑症状方面的有效性,使得 SSRIs 在过去的几十年里已经成为应用最为广泛的抗抑郁药物5-6。其中,氟西汀和帕罗西汀为 SSRIs 的代表性药物。人类排泄、未使用或过期而直接丢弃的 SSRIs药物通过卫生间、下水道等管道系统进入生活废水,并主要通过污水处理厂进入环境水体中7,最终汇入海洋。大量研究发现,在美国、加拿大以及欧洲的一些国家的污水处理厂废水中均检测到了不同浓度的 SSRIs8。已有研究证实,污水处理厂无法彻底清除生活污水中的 SSRIs 药物9,导致其成为药物持续低浓度进入环境水体的主要途径2,10-12。有学者研究发现,在欧洲和北美的一些城市附近的污水排放口和其下游地表水中分别检测到氟西汀和其代谢物诺氟西汀残留,其浓度范围为 0.001 g L-1到 1.3g L-1之间13-14。另有研究发现,水体环境中氟西汀半衰期通常为 100 d 以上,且抗光解、水解和生物降解能力强,导致其可长时间存在于环境中15-16,因此在地表水、污水排放口、地表水和海水中被检出,其浓度分别为 0.54、0.929、0.056 和 0.0026 gL-18,14,17。而帕罗西汀半衰期则较短,通常1 d8,因此未见相关研究报道。基于二者半衰期比较,氟西汀对生态环境的影响可能比帕罗西汀更大。400 生态毒理学报第 18 卷头足类动物是研究复杂的大脑发育机制和激动剂的新兴模型之一18-21。章鱼是头足类代表性的动物之一,无脊椎动物相比于其他海洋生物对 SSRIs更敏感22。头足类动物最显著的特征是拥有无脊椎动物中最高级、最复杂的中枢神经系统,具备处理信息和学习能力。头足类大脑由数百万个神经元构成,脑体质量比与脊椎动物相似。在脊椎动物中,5-HT 受体有 7 种类型,即 5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4、5-HT5、5-HT6 和 5-HT7 受体。目前,根据结构和功能的差别已鉴定出 15 种亚型23。而无脊椎动物 5-HT 受体类型尚不明确且 5-HT 受体分布位置与脊椎动物也不完全相同。现有研究表明,5-HT 在头足类动物中枢神经系统含量较低,仅在少数区域富集,如中壳缝和额叶皮质等24,但 5-HT 神经递质系统在调节水生软体动物的生存和繁殖中发挥着重要作用。在对于乌贼心脏的研究中发现,心肌壁振动频率和幅度受 5-HT1 和 5-HT2 受体调节25。5-HT 可调节海兔的摄食运动26、收缩反射27和防御28;并参与调节太平洋牡蛎的配子体发生、胚胎发育、诱导卵母细胞成熟和排卵29。此外,Andrews等30用主动脉灌注技术向章鱼体内注射 5-HT 可以清楚观察到喷墨和排泄行为。5-HT 在章鱼学习记忆中也起到重要作用,Shomrat 等31认为 5-HT 能够通过增强与记忆形成相关的神经元之间的信号传递,以此 促 进 长 时 程 增 强(long-term potentiation,LTP)的产生。综上所述,抗抑郁药会通过多种渠道持续进入自然水体中并对其中生活的生物健康造成威胁。截至目前,关于抗抑郁药物水体环境污染对水生生物健康影响的研究较少。基于以上背景,本研究选取抗抑郁症代表性药物氟西汀和帕罗西汀,探讨 2 种药物对章鱼脑组织 5-HT 能神经递质系统的影响,为进一步研究水体环境药物污染对章鱼脑组织重要生理功能的影响提供基础数据。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 药物氟西汀(F132,CAS:56296-78-7)和帕罗西汀(Y0000578,CAS:78246-49-8)购于 Sigma-Aldrich 公司。将氟西汀和帕罗西汀于 1%乙醇溶液中分别溶解,配制成终浓度为 1 mgL-1的药物溶液,置于 4保存备用。1.2 实验动物与处置方法100 只野生成体短蛸章鱼(O.ochellatus)(雌雄各?半)捕捉自舟山市岱山县附近海域,雌性体质量为105.3 124.5 g;雄性体质量为 98.7 128.1 g。于光照和温度受控的水培设施中驯化一周,水箱体积为(60 cm30 cm40 cm),光照周期为 14 h 10 h,温度恒定在(161),每日2 次喂食脊尾白虾(Exopal-aemon carinicauda)。选择参考文献报道的药物环境?浓度水平32-33,章鱼分别于 100、50、20 ngL-1氟西汀溶液、100、50、20 ng L-1帕罗西汀溶液和 100、50、20 ng L-1氟西汀及帕罗西汀混合药物溶液中连续暴露14 d,同时设置1%乙醇溶液暴露组(溶剂对照组),10 只组-1,实验采用生物重复,取样数为 5只组-1。为保障暴露浓度稳定,每 24 h 更换一次暴露液,换水体积为 100%。于暴露结束后收集脑组织。1.3 RNA 提出及 qPCRMgCl2溶 液 麻 醉 章 鱼 后 收 集 全 脑34,采 用RNAeasyTM动物 RNA 抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)提取脑组织中 RNA,所有步骤按照试剂盒说明书进行。取 15 20 mg 组织块,置于1.5mL 离心管中,迅速加入 600 L 冰浴预冷的裂解液,用微型电动匀浆器匀浆。匀浆后,轻轻吹打匀浆液使其充分混合,室温放置 3 min。然后约 14 000g离心 2 min,将上清液移至新的离心管中。加入等?体积结合液至裂解液中,轻轻颠倒混匀 3 5 次。将混合物转移至纯化柱内,12 000g离心30 s,倒弃收集管内液体。加入 600 L 洗涤液,12 000g离?心 30 s,倒弃收集管内液体。加入 600 L 洗涤液,12 000g离心 30 s,倒弃收集管内液体,重复一?次。16 000 g离心 2 min,去除残留的液体。将?RNA 纯化柱置于该试剂盒提供的 RNA 洗脱管中,加入 40 L 洗脱液,室温放置 3 min,最高速离心 30s,所得溶液即为纯化的 RNA。采用 NANODROP2000c 对 RNA 浓度进行测定。采用 BeyoRTTMcDNA 合成试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)进行反转录,每个反转录体系中加入 1 g RNA。为了解药物对章鱼脑中 5-HT 神经递质系统正常功能的影响,分别选取了 5-HT 神经递质系统中重要的功能分子,包括5-HT 转运体(SERT)、5-HT 受体(5-HTR2A、5-HTR1B、5-THR1)等,各基因扩增效?率均满足条件。引物序列见表 1。q-PCR 扩增采用CFXConnect 系 统(Bio-Rad,美 国),使 用 Beyo-FastTMSYBR Green qPCR Mix(上海碧云天生物技术有限公司),进行3 次重复实验以消除数据误差。采用第 3 期彭希健等:环境相关浓度的氟西汀和帕罗西汀对章鱼脑组织五羟色胺能系统的影响401 表 1 引物序列Table 1 Primers for Real-time PCR基因Genes引物方向Primer orientation核苷酸序列Nucleotide sequence5-HTR2AForwardCATCTCCTGCGAGTCCAAGACATTCReverseTTAGTAGCCTTCCGTTCCGTTTGC5-HTR1BForwardCGGAAGGCTGCCAGAGTGATTGReverseTCCGATCAAGGCAACCATGAAGAAG5-HTR1ForwardTGGACGGCGAGAAGTGAAGAGGReverseTCTAAAGAGGCACGAGCGAAATTGGSERTForwardAGTCTGGATAACAGCCACCGTACCReverseTCCCATCACTGGAACCAGGAAGAG-actinForwardGTGATGGACTCTGGTGATGGTGTGReverseCACGCTCGGTCAGGATCTTCATC的 PCR 方案为:95 下变性 10 min,进行 40 次循环,熔解曲线为65 95 范围内获得。采用熔解曲线分析的方法检测引物的特异性。表达数据与-actin 的表达进行归一化处理。采用 2-Ct法计算?各组间各基因水平的相对定量。1.4 Western blot 分析动物 麻 醉 后 收 集 全 脑,使 用 RIPA 裂 解 液(P0013C,上海碧云天生物技术有限公司)提取蛋白质。组织块用预冷的 PBS 洗涤 2 3 次,加入 10 倍组织体积的裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),设置匀浆程序进行匀浆。将匀浆完成的匀浆管取出,放置冰上裂解 30 min,每隔 5 min 震荡一次确保组织完全裂解。12 000 rmin-1、4,离心 10min,收集上清,即为总蛋白溶液。采用 BCA 蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)进行蛋白质浓度测定。将 30 g 蛋白质通过 10%浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将载有蛋白质的 PVDF膜进行5%脱脂奶粉室温封闭30 min 后进行4 一抗 孵 育 过 夜,包 括 兔 抗 5-HTR1(ab227165,abcam,1 1 000)、兔抗 5-HTR 1A(K009515P,Solar-bio,1 2 000)、兔抗 5-HTR 1B(PA5-111905,Ther-mofisher,1 500)、兔抗 5-HTR 2B(K004123P,Solar-bio,12 000)、兔抗 SERT(ab272912,abcam,1 500)及小鼠抗-actin(66009-1-lg,武汉三鹰,1 3 000)。次日,回收一抗,用 TBST 快速涮洗膜 3 次,然后加入 TBST,放置脱色摇床上快速洗脱,每次 5 min,洗3 次。将二抗用 TBST 按照 15 000 的比例进行稀释,然后加入孵育槽中,放置摇床上慢摇,室温下孵育 30 min。用 TBST 快速涮洗膜 3 次,然后再加入TBST,放置脱色摇床上快速洗脱,每次 5 min,洗 3次。在暗室中将 ECL A 液和 ECL B 液 2 种试剂在离心管中等体积混合,在曝光匣上贴双层 PE 手套或者其他透明薄膜,将 PVDF 膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间,加入混合好的 ECL 溶液充分反应,1 2 min 后,去尽残液,盖上层薄膜开始压胶片。压完的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影(EPSON,V370)。根据不同的发光强度调整曝光条件。将胶片进行扫描存档,PhotoShop 整理去色,Al-pha(FluorChem E)系统分析目标带的光密度值。1.5 数据分析使用 GraphPad Prism 9.2 进行数据分析与制图。结果以平均值标准误差表示。采用 Levene 和 Kol-mogorov-Smirnov Levene 分别检验数据的方差齐性和正态性。SERT、5-HTR1、5-HTR1B和5-THR2A的相 对 转 录 差 异,SERT、5-HTR1、5-HTR1A、5-HTR2B、5-HTR1B不同组的条带强度采用重复测量?双向方差分析,然后采用 Dunnett 多重比较检验。概率(P)值为 0.05 被认为有统计学意义。2 结果(Results)2.1氟西汀和帕罗西汀对章鱼脑 5-HT 能神经递质系统相关基因表达的影响2.1.1氟西汀暴露对章鱼脑 5-HT 能神经递质系统相关基因表达的影响 由图 1 可知,经过 14 d 连续暴露,20 ngL-1氟西汀暴露组章鱼脑组织中的5-HTR1B、5-HTR2A基?因表达量低于对照组且差异具有显著性(P0.05);?50 ngL-1氟西汀暴露组出现5-HTR1、5-HTR1B、?SERT基因表达量低于对照组(P0.05),5-HTR2A基402 生态毒理学报第 18 卷?因表达量低于对照组且差异具显著性(P0.01);100?ngL-1氟 西 汀 暴 露 组 对 比 对 照 组5-HTR1、5-HTR1B、SERT、5-HTR2A(P0.05)基因表达量差异?均显著(P0.05),其中氟西汀对5-HTR2A影响最为?显著,与对照组相比基因表达下调倍数最高为100 倍。2.1.2帕罗西汀暴露对章鱼脑 5-HT 能神经递质系统相关基因表达的影响由图 2 可知,帕罗西汀连续暴露 14 d 后引起章鱼脑组织5-HTR2A基因表达水平相对于对照组下?调显著(P0.05)。其中,20 ngL-1帕罗西汀暴露组?出现5-HTR1、5-HTR2A、SERT基因表达水平与对?照组相比差异显著(P0.05);?与对照组相比50 ng L-1帕罗西汀暴露组5-HTR1B、5-HTR2A基因表达水平差异显著(P0.05);与对照组相比 100 ngL-1?帕罗西汀暴露组出现5-HTR1、5-HTR1B、5-HTR2A基因表达水平下调显著(P0.05),但SERT基因相对?表达水平无显著下调。5-HTR2A对帕罗西汀同样?敏感,其基因表达水平下调倍数最高为 25 倍。图 1 氟西汀连续暴露 14 d 引起章鱼脑 5-HT 能神经递质系统功能分子基因转录水平改变注:*表示P0.05,*表示P0.01,*表示P0.001;n=5。Fig.1 Fluoxetine exposure for 14 d induced changes in gene transcription levels of functional molecules of 5-HT neurotransmittersystems in octopus brain tissueNote:*representsP0.05,*representsP0.01,*representsP0.001;n=5.图 2 帕罗西汀连续暴露 14 d 引起章鱼脑 5-HT 能神经递质系统功能分子基因转录水平改变注:*表示P0.05;n=5。Fig.2 Paroxetine exposure for 14 d induced changes in gene transcription levels of functional molecules of 5-HTneurotransmitter systems in octopus brain tissueNote:*representsP0.05;n=5.第 3 期彭希健等:环境相关浓度的氟西汀和帕罗西汀对章鱼脑组织五羟色胺能系统的影响403 2.1.3 氟西汀和帕罗西汀混合暴露对章鱼脑 5-HT能神经递质系统相关基因表达的影响 如图 3 所示,氟西汀和帕罗西汀混合暴露 14 d对章鱼脑组织5-HTR1基因相对表达水平并无显著?影响。但导致5-HTR2A、5-HT1B、SERT基因相对?表达水平下调显著(P0.05)。其中,20 ngL-1、100?ng L-1氟西汀和帕罗西汀混合暴露导致5-HTR1B、SERT基因相对表达水平对比对照组下调(P0.05)?且5-HT2A基因相对表达水平下调具显著性(P0.01);50 ngL-1氟西汀和帕罗西汀混合暴露组5-HTR1B、5-HTR2A、SERT基因相对表达水平对比对?照组降低同样显著(P0.05)。2.2氟西汀和帕罗西汀对章鱼脑 5-HT 能神经递质系统功能分子蛋白表达水平的影响 使用蛋白质印迹技术(Western-blotting)对药物不同浓度暴露后章鱼脑组织中 5-HTR1、5-HTR1B、5-HTR1A、5-HTR2B 和 SERT 的表达水平进行分析,结果如图 4 所示。并使用 Alpha 凝胶成像系统将图片信息转换为数据信息,进一步分析得出图 5 7。图 3 氟西汀和帕罗西汀混合暴露 14 d 引起章鱼脑 5-HT 能神经递质系统功能分子基因转录水平改变注:*表示P0.05,*表示P0.01;n=5。Fig.3 Fluoxetine and paroxetine combined exposure for 14 d induced changes in gene transcription levels of functionalmolecules of 5-HT neurotransmitter systems in octopus brain tissueNote:*representsP0.05,*representsP0.01;n=5.图 4 氟西汀和帕罗西汀对章鱼脑组织中 5-HT 能神经递质系统功能分子蛋白表达水平的影响注:(a)、(b)、(c)图依次为氟西汀、帕罗西汀与混合暴露组,其中 1 为空白对照组;2 4 为 2.20 ng L-1、3.50 ng L-1、4.100 ng L-1组。Fig.4 Effect of fluoxetine and paroxetine on the expression levels of functional molecular proteins in the 5-HT-ergicneurotransmitter system in the octopus brain tissueNote:(a),(b),(c)are respectively shown for fluoxetine,paroxetine and the mixed exposure group,of which 1 control group;2 4 means 2.20 ng L-1,3.50 ng L-1,4.100 ng L-1groups.404 生态毒理学报第 18 卷2.2.1氟西汀暴露对章鱼脑 5-HT 能神经递质系统功能分子表达水平的影响 氟西汀连续暴露 14 d 对章鱼脑组织 5-HTR1、SERT 表达水平无显著影响(图 5)。20 ng L-1氟西汀暴露组 5-HTR1A、5-HTR2B 表达水平上调且具有显著性(P0.05);50 ng L-1氟西汀暴露组出现 5-HTR1B?表达水平显著升高(P0.05);100 ng L-氟西汀暴露组?出现5-HTR2B 表达水平显著降低(P0.0001)。2.2.2帕罗西汀暴露对章鱼脑 5-HT 能神经递质系统功能分子表达水平的影响 帕罗西汀连续暴露 14 d 引起章鱼脑组织 5-HTR1、5-HTR1B、5-HTR1A、5-HTR2B、SERT 表达水平均有上升趋势(图 6)。具体表现为帕罗西汀暴露使5-HTR1表达水平上调显著(P0.05);5-HTR1A、图 5 氟西汀暴露 14 d 引起章鱼脑 5-HT 能神经递质系统功能分子蛋白表达水平改变注:*表示P0.05,*表示P0.0001;n=5。Fig.5 Fluoxetine exposure for 14 d induced changes in protein expression levels of functional molecules of 5-HTneurotransmitter systems in octopus brain tissueNote:*representsP0.05,*representsP0.0001;n=5.图 6 帕罗西汀暴露 14 d 引起章鱼脑 5-HT 能神经递质系统功能分子蛋白表达水平改变注:*表示P0.05,*表示P0.01,*表示P0.001;n=5。Fig.6 Paroxetine exposure for 14 d induced changes in protein expression levels of functional molecules of 5-HTneurotransmitter systems in octopus brain tissueNote:*representsP0.05,*representsP0.01,*representsP0.001;n=5.第 3 期彭希健等:环境相关浓度的氟西汀和帕罗西汀对章鱼脑组织五羟色胺能系统的影响405 图 7 氟西汀和帕罗西汀混合暴露 14 d 引起章鱼脑 5-HT 能神经递质系统功能分子蛋白表达水平改变注:*表示P0.05;n=5。Fig.7 Fluoxetine and paroxetine combined exposure for 14 d induced changes in protein expression levels of functionalmolecules of 5-HT neurotransmitter systems in octopus brain tissueNote:*representsP0.05);?100 ng L-1帕罗西汀暴露组出 5-HTR1、5-HTR1B、5-HTR2B 表达水平上调显著(P0.01)。其中 5-HTR1、?5-HTR2B 出现明显剂量-效应关系。2.2.3 氟西汀和帕罗西汀混合暴露对章鱼脑 5-HT能神经递质系统功能分子表达水平的影响 根据图 7 可知,20 ngL-氟西汀和帕罗西汀混合暴露14 d 引起章鱼脑组织 SERT、5-HTR1A 表达水平下调(P0.05);并伴随着 5-HTR2B 表达水平升?高(P0.05)。;50 ng L-1氟西汀和帕罗西汀混合暴露?组出现 5-HTR1、5-HTR2B 表达水平上调(P0.05);?100 ngL-1氟 西 汀 和 帕 罗 西 汀 混 合 暴 露 组出 5-HTR1 表达水平上调(P0.05)。但氟西汀和帕?罗西汀混合暴露对 5-HT1B 影响无显著性差异。3 讨论(Discussion)5-HT 能神经递质系统在调控运动、动机与行为、学习和记忆、情绪等脑功能中发挥重要作用35。受体表达水平的改变对神经递质系统信号的传导具有重要影响;5-HT 转运蛋白(serotonin transporter,SERT)通过从突触间隙高亲和性摄取 5-HT 来调节5-HT 能神经传递的强度和持续时间。本研究通过检测章鱼脑中5-HTR1、SERT、5-HTR1A、5-HTR2B、5-HTR1B基因转录水平与蛋白质表达水平的改变,?探讨氟西汀与帕罗西汀对于章鱼脑组织中 5-HT 能神经传导系统的影响。3.1 氟西汀暴露对于章鱼中枢神经系统5-HT 影响氟西汀通过抑制突触间隙 5-HT 重摄取的方式,导致5-HTR1、5-HTR2A、5-HTR1B和SERT基因转录水平下调,与前人研究一致36-39。与转录水平不同的是,氟西汀暴露引起章鱼脑中 5-HT 能系统功能蛋白表达水平出现升高,但这种升高呈现剂量依赖性下降,具体表现为5-HTRA、5-HTR1B、5-HTR2B蛋白表达水平上调,且随着氟西汀剂量增加?上调程度出现下降趋势。其中,50 ngL-1氟西汀暴露组 5-HT 能系统功能基因转录水平下调程度要高于 100 ng L-1组。产生这种现象的原因可能是在高剂量(100 ng L-1)下,机体存在代偿机制,以抵消转录水平下调,在较低浓度(50 ng L-1)下,没有超过生物体耐受阈值而引起机体的代偿效应40。出现基因转录水平与蛋白质表达水平矛盾且蛋白质表达水平随氟西汀剂量依赖性下降的原因为机体对药物产生的不良影响反应较早,在药物暴露前期已有大量功能蛋白分子表达并发挥调控作用,因此出现转录水平下调伴有蛋白表达水平上调41。3.2 帕罗西汀暴露对于章鱼中枢神经系统 5-HT影响 虽然帕罗西汀的半衰期很短,但由于污水处理厂无法彻底清除生活废水中的帕罗西汀,致使药物以相对低浓度、持续地进入环境水体,对生态环境造406 生态毒理学报第 18 卷成的危害同样不可忽视。毒理学实验证实,环境浓度 SSRIs 通过影响围产期乌贼 5-HT 能系统导致其出现伪装效率损伤、挖砂行为增加等异常表现,严重影响了乌贼的个体生存42。研究发现,水体中帕罗西汀同样能够导致 5-HT 能系统功能分子发生变化,具体表现为5-HTR1、5-HTR2A、5-HTR1B和?SERT转录水平均出现下调,伴随出现5-HTR1、SERT、5-HTR1A、5-HTR2B、5-HTR1B蛋白表达水平?升高,较氟西汀相比效果更加显著。研究证实,帕罗西汀的疗效优于氟西汀43-44。同时