二甲双胍通过抑制内质网应激诱导的细胞凋亡对子痫前期大鼠的保护作用.pdf

论著 收稿日期:作者单位:山西医科大学第一医院产科山西 太原 基金项目:国家临床重点专科建设(晋卫办医函 号)山西医科大学第一医院院基金项目()通信作者 :./.二甲双胍通过抑制内质网应激诱导的细胞凋亡对子痫前期大鼠的保护作用宁蓓蓓马惠静邓丽君贾 冉杨海澜 摘 要 目的研究二甲双胍对子痫前期()大鼠胎盘内质网应激的影响探讨二甲双胍对子痫前期大鼠的保护作用及机制方法 只成功受孕 大鼠随机分为对照组、组和二甲双胍组每组 只 采用 硝基精氨酸甲酯()诱导建立子痫前期大鼠模型于妊娠第 天 组和二甲双胍组皮下注射 /对照组皮下注射等量生理盐水同时二甲双胍组给予/二甲双胍灌胃 组和对照组在相应的妊娠天数采用相等剂量的等渗盐水灌胃 检测大鼠的血压、尿蛋白含量妊娠第 天麻醉剖宫取胎测量胎鼠的顶臀长、体重胎盘直径、重量 检测胎盘组织中内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白 ()和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶()的 水平 分析胎盘组织中 和 蛋白水平的表达结果 染色法分析胎盘组织的凋亡情况结果与对照组比较 组大鼠收缩压水平和 尿蛋白水平升高()与 组相比二甲双胍干预可降低子痫前期大鼠的收缩压水平和 尿蛋白含量()与对照组相比 组中子痫前期大鼠胎盘 和 的 和蛋白水平明显升高()与 组相比二甲双胍组中子痫前期大鼠胎盘 和 的 和蛋白水平降低()结果显示 组中凋亡细胞显著增加二甲双胍组显著减少()结论二甲双胍对子痫前期具有保护作用其机制可能与抑制内质网应激诱导的细胞凋亡有关关键词 子痫前期二甲双胍内质网应激凋亡 ()().()././.().().()().:实用药物与临床 年第 卷第 期 .引言子痫前期()是妊娠期特发疾病临床表现以高血压、蛋白尿为主每年全世界有 万多名产妇和 万名胎儿因其死亡是孕产妇和围产期发病和死亡的主要原因 在过去的 年 的研究取得了重大进展尽管其潜在的发病机制仍不明确 胎盘是妊娠期发育的独特器官充当母体和胎儿系统之间的交换界面正常妊娠时滋养层细胞侵入到母体子宫螺旋动脉在胎儿母体界面形成血管窦为胎儿提供营养滋养层细胞过度凋亡和侵入能力降低螺旋动脉重塑失败胎盘灌注不足导致胎盘缺血缺氧从而引起子痫前期的一系列症状 因此过度的胎盘滋养层细胞凋亡与 的发生有密切关系有研究表明内质网应激()可导致 患者胎盘滋养层细胞凋亡这一发现已成为 胎盘病理学的一个重要特征 内质网()可能是一种诱导凋亡的重要细胞器这种凋亡可能不依赖线粒体或死亡受体途径 内质网()中存在许多伴侣蛋白和折叠酶当 受到缺氧等因素的刺激时 腔中未折叠或错误折叠的蛋白会聚集并破坏细胞的正常生理功能导致 发生 未 折 叠 蛋 白 反 应()是一种调节蛋白质和细胞稳态的适应性机制目的是将细胞恢复到生理状态 然而当 不能纠正蛋白质积累时 延长并可导致细胞死亡途径激活进而对妊娠结局和胎盘形成不利影响 葡萄糖调节蛋白()作为 的伴侣蛋白维持蛋白质在 腔内的正确折叠和转运靶向错误折叠的蛋白质促进蛋白质组装恢复内质网的结构和功能并调节 的激活 半胱天冬氨酸蛋白酶 ()是 的特异性凋亡途径当 严重或持续时某些信号通路被激活导致其表达增加随后诱发凋亡目前治疗 的方法主要是适时终止妊娠因此探索安全有效的预防和治疗药物十分必要二甲双胍是一种双胍类药物除了抗血糖作用还可以抗衰老、抗肿瘤、抗炎、抗凋亡等研究表明二甲双胍在妊娠早期是安全的没有先天畸形的风险 在妊娠期间使用可能会导致 型糖尿病患者体重增加和胰岛素剂量减少对于胎儿二甲双胍可以减少低血糖和巨大儿的发生但可能会增加小于胎龄婴儿的发生率 最近研究者们开始关注二甲双胍与 之间的关系 有报道二甲双胍可以通过减少 相关凋亡对疾病起到保护作用 的研究不仅有助于进一步了解 诱导胎盘滋养层细胞凋亡的分子机制而且为 的临床防治提供了新的解释 材料与方法 材料 实验动物 级 ()雌性大鼠 只 周龄体重 由山西医科大学实验动物中心提供动物许可证号:(晋)仪器和试剂 大鼠无创血压测量系统购自南京卡尔文生物科技有限公司 酶标仪购自美国 公司盐酸二甲双胍肠溶片购自贵州天安药业股份有限公司(货号:)硝基精氨酸甲酯()购自美国 公司(货号:)蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所(货号:)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(货号:)反转录试剂盒购自北京全式金生物公司(货号:)方法 子痫前期大鼠模型建立及分组雌性未育 大鼠发情期与成年雄性大鼠过夜交配(雌性 雄性 )交配后次日晨用棉签从大鼠阴道获得分泌物将其涂抹在载玻片上在光学显微镜下观察 阴道涂片中精子的存在表明妊娠第 天 只成功受孕 大鼠随机分为对照组、组和二甲双胍组 组和二甲双胍组均从妊娠第 天开始皮下注射/持续 对照组从妊娠第 天开始皮下注射等量生理盐水持续 二甲双胍组从妊娠第 天开始灌胃给予二甲双胍 /持续 组和对照组在相应的妊娠天数采用相等剂量的等渗盐水灌胃 收缩压测量用大鼠无创血压系统测量孕鼠妊娠第 天、妊娠第 天、妊娠第 天、妊娠第 天的收缩压测量 次取平均值 尿蛋白测定于妊娠第 天、妊娠第 天将大鼠转移到代谢笼中收集 尿液记录尿量使用考马斯亮蓝法测定 尿蛋白 标本采集 妊娠第 天剖宫取胎记录胎鼠顶臀长、体重及胎盘直径、重量并将每组胎盘组织随机分为两部分一部分放于多聚甲醛溶液实用药物与临床 年第 卷第 期 .中另一部分存放于 冰箱中进行下一步分析 法 取出 冰箱中胎盘组织用 试剂提取总 测定总 浓度及纯度 将 用逆转录试剂盒逆转录为 使用荧光定量试剂盒、仪进行测定检测胎盘组织中、的表达使用 作为参考基因用 分析方法计算样本目的 相对表达量 引物序列:上游引物:下 游引物:上游引物:下游引物:上游引物:下 游 引 物:法用蛋白裂解液从胎盘组织中分离总蛋白 法测定蛋白浓度取 蛋白加蛋白上样缓冲液煮沸 通过 电泳分离随后转移到 膜上 脱脂奶粉封闭 加入()、()、()抗体 摇床过夜孵育次日 洗膜共 次每次 加入荧光标记的山羊抗兔二抗室温孵育 再次洗膜化学发光试剂盒进行条带观察 采用 图像分析软件进行蛋白灰度值分析获得相对于 的蛋白表达水平 染色将多聚甲醛中胎盘组织取出进行脱水包埋制成切片将切片脱蜡 按照 试剂盒说明书进行染色显微镜下观察结果细胞核中有黄色或棕黄色颗粒的细胞即为发生凋亡的细胞 统计学处理采用 统计学软件进行分析正态分布的计量资料以均数 标准差()表示两组间比较采用 检验多组间比较采用单因素方差分析 为差异有统计学意义 结果 收缩压和 尿蛋白情况 三组在妊娠第天和妊娠第 天血压水平差异无统计学意义与对照组相比 组在妊娠第 天与第 天收缩压升高差异有统计学意义(.)应用二甲双胍可降低子痫前期大鼠收缩压水平差异有统计学意义(.)见表 此外三组 尿蛋白在妊娠第 天差异无统计学意义妊娠第 天 尿蛋白 组明显高于对照组差异有统计学意义(.)但应用二甲双胍后降低了 尿蛋白的升高差异有统计学意义(.)见表 表 三组大鼠收缩压水平比较()组别只数妊娠第 天妊娠第 天妊娠第 天妊娠第 天对照组.组.二甲双胍组.注:与对照组比较 与 组比较 表 三组大鼠 尿蛋白水平比较(/)组别只数妊娠第 天妊娠第 天对照组.组.二甲双胍组.注:与对照组比较 与 组比较 妊娠结局 与对照组相比 组的胎鼠体重下降(.)顶臀长较短(.)差异有统计学意义但应用二甲双胍后胎鼠体重与顶臀长接近正常水平 此外各组间胎盘重量与直径无统计学差异 见图 图 三组胎鼠顶臀长、重量及胎盘生长情况实用药物与临床 年第 卷第 期 .大鼠胎盘组织中 和 表达水平 结果显示与对照组比较 组大鼠胎盘中 和 的 含量均升高()二甲双胍组、的 表达与 组比较显著降低差异有统计学意义()见图图 三组大鼠胎盘组织中 和 表达情况 大鼠胎盘组织中 和 蛋白表达水平 的结果显示与对照组大鼠相比 组大鼠胎盘组织中 和 蛋白水平均过表达()与 组大鼠相比二甲双胍处理后大鼠胎盘组织中 和 蛋白表达水平明显降低()见图图 三组大鼠胎盘组织中 和 蛋白表达情况 大鼠胎盘组织凋亡情况 结果显示 组胎盘组织中可见大量凋亡细胞而对照组与二甲双胍组中仅有少量凋亡细胞 见图 图 各组大鼠胎盘组织凋亡情况()讨论 作为妊娠期高血压疾病的一种典型类型是多种病因共同作用的综合征 与胎盘滋养细胞关系密切滋养细胞过度凋亡可导致螺旋动脉重塑过程失败导致胎盘功能失调从而发生高血实用药物与临床 年第 卷第 期 .压、蛋白尿等临床症状 用于构建 大鼠模型经 处理的大鼠与 女性的高血压和高蛋白尿症状相同 研究表明二甲双胍可能在治疗或预防 中发挥作用 二甲双胍具有促进血管生成、抗炎、抑制氧化应激等作用在治疗和抑制 相关并发症中发挥重要作用 本研究结果表明 诱导的大鼠血压和尿蛋白均升高而二甲双胍干预可以有效降低 诱导的 大鼠的高血压和高尿蛋白改善 大鼠不良妊娠结局改善 诱导的细胞凋亡保护胎盘组织 作为 的标志性分子参与细胞的 反应维持蛋白质在 中的正确折叠和转运其表达水平与 的发生有一定的关系当 持续时间过长未折叠蛋白大量积累调节能力失衡导致胎盘滋养层细胞凋亡 然而滋养层 并不直接引起滋养层细胞凋亡而是通过下游 的激活其中 途径是 凋亡途径中比较特异的途径 正常生理情况下 与其他的 一样以无活性的酶原形式存在当缺氧等条件触发 时 平衡紊乱激活 进而激活其下游的分子导致胎盘滋养层细胞发生凋亡 本研究采用 和 法对胎盘 标志物 及 在基因及蛋白水平的表达进行 了 检 测 结 果 发 现 组 大 鼠 胎 盘 中、在基因及蛋白水平的表达较正常组大鼠显著增加 这些结果提示在 诱导的 大鼠胎盘中的确存在 反应先前的研究已经注意到二甲双胍在抑制子痫前期相关凋亡中的作用且验证了二甲双胍药理学浓度对滋养层细胞的安全性对滋养层细胞活力无不良影响 等研究表明二甲双胍一部分通过抑制 炎症小体诱导细胞凋亡一部分通过抑制/信号通路和阻断转录因子 与启动子 的结合来纠正糖代谢重编程和氧化应激从而起到对滋养层细胞的保护作用 等研究发现二甲双胍可以通过调节/信号通路抑制滋养层细胞的迁移从而预防 本研究中我们推测二甲双胍可能通过调节内质网应激诱导的细胞凋亡对 大鼠具有保护作用 结果显示与 组相比经二甲双胍处理后 相关标志物 和 的基因和蛋白表达水平下降 结果也显示二甲双胍改善了 大鼠的胎盘组织细胞凋亡情况 出现过度的 时二甲双胍可以降低过度的 从而抑制胎盘滋养层细胞发生凋亡总之本研究显示了二甲双胍在 大鼠中的保护作用在减轻 诱导的细胞凋亡方面有明显的益处 鉴于这些发现预防 诱导的相关凋亡可能是减轻 症状的新靶点 然而我们没有对胎儿的短期和长期风险和益处进行进一步研究并且应用二甲双胍的时间和剂量也没有准确的定义这些问题可能为二甲双胍应用于 开辟新的研究方向为二甲双胍使用提供证据参考文献:.():.:.():.:.():.():.().():./().:.().():.:.:.:.:.:.:.:.实用药物与临床 年第 卷第 期 .():.:.():./.:.():.:.():.:.():.:.:.()():.:.():./.:.():.():.().():.():.():.:./:.:./.():.(本文编辑:高宽)实用药物与临床 年第 卷第 期 .