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构建铁死亡相关长链非编码RNA模型预测卵巢癌患者预后及免疫微环境张 瑜a，王 乐b陕西省人民医院 a 妇科，b 神经内科，陕西 西安 710068收稿日期：2023-03-07基金项目：陕西省人民医院科技发展孵化基金资助项目（2022YJY-45）；陕西省人民医院科技人才支持计划资助项目（2022JY-33）；陕西省自然科学基础研究计划资助项目（2021JQ-913）作者简介：王 乐，男，主治医师，硕士，研究方向为脑血管病的治疗及生物信息学，e-mail:，通信作者摘要：目的目的 构建一种可预测卵巢癌患者预后的铁死亡相关长链非编码RNA（lncRNA）模型，并探讨不同危险人群的免疫特征及免疫检查点相关基因的差异表达。方法方法 构建铁死亡相关lncRNA的卵巢癌患者的预后模型，根据模型计算风险值（Riskscore）的中位值，将卵巢癌患者分为高风险组和低风险组。对患者的生存状态、肿瘤浸润的免疫细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）相关基因表达量进行分析。结果结果 构建出由5个lncRNA构成的预后模型。与低风险组患者相比，高风险组患者的生存时间明显缩短（P 0.001）。单因素Cox回归分析显示：年龄（HR=1.021，95%CI：1.008，1.034，P=0.001）和Riskscore（HR=1.689，95%CI：1.382，2.065，P 0.001）与卵巢癌患者的总生存预后相关；多因素Cox回归分析显示：Riskscore是总生存期的独立预测因素（HR=1.629，95%CI：1.324，2.005，P 0.001）。多项免疫途径在两组之间的差异具有统计学意义。免疫检查点如程序性细胞死亡蛋白-1，程序性死亡配体-1，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4等在两组中的表达也显著不同。结论结论 基于铁死亡相关lncRNA的卵巢癌患者预后模型，可预测卵巢癌患者的预后和免疫状态，将有助于卵巢癌患者的个体化治疗。关键词：卵巢癌；铁死亡；长链非编码RNA；免疫状态；预后中图分类号：R737.31，R711.75文献标识码：Adoi：10.13885/j.issn.1000-2812.2023.06.007Construction of a ferroptosis-related lncRNA model topredict prognosis and immune microenvironment ofovarian cancer patientsZhang Yua,Wang Leba Department of Gynecology,b Department of Neurology,Shaanxi Provincial Peoples Hospital,Xian 710068,ChinaAbstract：Objective This study aimed at constructing a ferroptosis-related(long non coding RNA,lncRNA)model which can predict the prognosis of patients with ovarian cancer,and to explore the immune characteris-tics and differential expression of genes related to immune checkpoints in different risk groups.Methods Fer-roptosis-related lncRNA were identified.Differentially expressed genes were obtained and analyzed by Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway analyses.Differentially expressed ln-cRNA were analyzed to construct a ferroptosis-related lncRNA prognostic model.According to the median value of Riskscore,patients with ovarian cancer were divided into high-risk and low-risk groups.The survival status,tumor infiltrating immune cells and immune checkpoint inhibition related markers in different groups were analyzed.Results A prognostic model composed of 5 lncRNA was constructed.Compared with the low-risk group,the survival time of the high-risk group was significantly shorter(P 0.001).Univariate Cox regression analysis showed that age(HR=1.021,95%CI:1.008,1.034,P=0.001)and Riskscore(HR=1.689,文章编号：1000-2812(2023)06-0039-06第49卷 第6期2023年6月兰州大学学报（医 学 版）Journal of Lanzhou University（Medical Sciences）Vol.49 No.6June.2023第49卷兰州大学学报（医 学 版）卵巢癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，具有高发性和预后差的特点，威胁着女性的健康和生命1。针对卵巢癌的治疗方式包括手术、化疗和靶向药物，近年来规范化的综合治疗使得患者的预后得以改善2-3。但是，存在相当大比例的患者对治疗药物产生耐药性或继发性抵抗力，导致卵巢癌的预后不容乐观。因此，寻找新的生物标志物是当前重要的科研方向，希望能够为卵巢癌患者预后的改善提供更多的可能性。铁死亡是由铁依赖性调节性细胞死亡（regu-lated cell death，RCD）引起的一种新型细胞死亡形式，最早于 2012 年被发现4。与其他类型的RCD不同，铁死亡的代谢机制独具特色，主要通过积累大量的活性氧降低谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，Gpx4）的活性，进而导致脂质过氧化4。铁死亡有多种生物学意义，涉及多个领域，如癌症、神经退行性疾病和缺血再灌注损伤等5-6。调节恶性肿瘤中的铁死亡被认为是一种非常前沿的治疗方式，可以应用于传统疗法中耐药的恶性肿瘤5,7。因此，进一步研究铁死亡的机制和特性对于实现个体化的治疗方法和改善患者预后具有重要意义。长链非编码 RNA（long noncoding RNA，ln-cRNA）是一种广泛参与多种生理和病理过程的RNA，包括细胞生长、迁移、侵袭和抗凋亡等关键生命过程8-9。同时，lncRNA也在调节铁死亡机制中发挥重要作用。研究10表明，LINC00618可增加脂质活性氧（reactive oxygen species，ROS）和铁的水平，降低溶质载体家族7成员11（solute car-rier family 7 member 11，SLC7A11）的表达，从而加速铁死亡。目前卵巢癌中铁死亡相关 lncRNA 的研究仍处于初始阶段，需要开展更深入的研究以探索其治疗潜力及机制。本研究拟通过构建铁死亡相关lncRNA模型来预测卵巢癌的预后，同时分析其与免疫细胞浸润的相关性，从而指导卵巢癌的预后判断及治疗。1材料与方法材料与方法1.1 收集数据卵巢癌患者的 RNA 表达数据及临床数据从The Cancer Genome Atlas（TCGA）（https:/portal.gdc.cancer.gov/repository）数据集获得，其获得379例卵巢癌患者，生存分析中排除了生存时间小于30 d的患者数据，临床数据包括患者的年龄、组织分化程度、分期。正常的卵巢组织RNA表达数据从GTEX数据集获得，共88例。1.2 鉴定铁死亡相关lncRNA及功能富集分析铁死亡基因从 FerrDb（http:/www.zhounan.org/ferrdb）网站获得。通过Pearson相关性分析，筛选出铁死亡相关lncRNA。然后，对铁死亡相关基因及相关 lncRNA 进行差异性分析（|log2FC|1，FDR0.05）。对差异的铁死亡相关基因进行 基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。1.3 构建铁死亡相关lncRNA预后模型对差异的铁死亡相关 lncRNA 进行总生存期（overall survival，OS）单因素Cox回归预后分析，筛选出7个与预后相关的lncRNA。然后，通过多因素Cox回归分析构建卵巢癌预后模型，筛选出5 个与预后相关的 lncRNA并计算风险值（Risks-core）值，公式为：95%CI:1.382,2.065,P 0.001)were related to the overall survival of patients with ovarian cancer,and multivariate Cox regression analysis showed that Riskscore was still an independent predictor of overall sur-vival(HR=1.629,95%CI:1.324,2.005,P 0.001).There were significant differences in multiple immune pathways between the two groups.The expression of immune checkpoints such as programmed cell death pro-tein 1,programmed death-ligand 1,cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4,etc.was also significantly different between the two risk groups.Conclusion The prognostic model based on ferroptosis-related lncRNA can predict the prognosis and immune status of patients with ovarian cancer,and this predictive model will help determine the prognosis and individualized treatment of patients with ovarian cancer.Keywords:ovarian cancer;ferroptosis;long noncoding RNA;immune status;prognosis40第6期张 瑜，等：构建铁死亡相关长链非编码RNA模型预测卵巢癌患者预后及免疫微环境Riskscore=i=15i lncRNAii为第i个lncRNA的回归系数，lncRNAi为第i个基因相对表达值。1.4 评价模型的预后价值根据预后模型Riskscore的中位值，将卵巢癌患者划分为高风险组和低风险组。对两组进行Kaplan-Meier分析，比较两组的生存状态并绘制生存曲线。结合卵巢癌患者的其他临床病理特征对模型进行单因素及多因素Cox分析。1.5 高低风险组的免疫浸润分析及免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）的差异分析为了分析风险模型与免疫细胞特性之间的关系，使用目前公认的方法，包括XTimer（tumor immune estimation resource），CiberSort（cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts），CiberSort-ABS（cibersort with absolute immune subset），XCell（expression-based cell-type identification by probabilistic inference），MCP Coun-ter（multi-cancer parallel analysis of transcriptomic and epigenetic reads），EPIC（estimating the propor-tions of immune and cancer cells）和 QUANTISEQ（quantitative RNA sequencing）计算卵巢癌标本中的免疫浸润状态，并进行差异分析11-17。此外，使用 ssGSEA对两组之间的肿瘤浸润性免疫细胞亚群进行量化，并评估它们的免疫功能。最后，分析ICI差异表达。1.6 相关基因的统计学方法对 OS的独立预后因素进行单因素和多因素Cox回归分析。采用Kaplan-Meier生存分析方法，进一步用Wilcox检验比较高风险组和低风险组卵巢癌患者肿瘤浸润性免疫细胞、ICI表达水平的差异。上述统计分析基于 R软件（4.0.3版）。以P 0.05为差异有统计学意义。2结果结果2.1 铁死亡相关基因及lncRNA的差异分析从FerrDb网站获得248个铁死亡基因，鉴定出 818 个铁死亡相关的 lncRNA，对其进行差异分析，共得到93个差异基因，119个差异lncRNA。对差异的铁死亡相关基因进行 GO 和 KEGG 分析：生物过程主要参与细胞对化学胁迫的反应、细胞对氧化应激的反应、内源性凋亡信号通路、活性氧代谢过程、对营养水平的反应、对饥饿的反应、细胞对细胞外刺激的反应、线粒体自噬、线粒体解体等；细胞成分主要在自噬小体、线粒体外膜、细胞器外膜、基质膜、噬菌体集合点上调；分子功能主要调节泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、铁离子结合、吡哆醛磷酸盐结合、蛋白激酶抑制剂活性、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、亚铁离子结合。KEGG分析表明，过表达基因主要涉及铁死亡、自噬、肿瘤蛋白53（tumor protein 53，p53）信号通路、活性氧代谢、肿瘤中microRNA的合成、叉头框蛋白O（forkhead box O，FoxO）信号通路、铂耐药、膀胱癌、肝癌、细胞凋亡、谷胱甘肽代谢。2.2 铁死亡相关lncRNA预后模型构建对119个差异lncRNA进行单因素Cox预后分析，共得到7个预后相关lncRNA，包括DNM3OS、AC073046.1、AC004816.1、AC109322.1、ATP2A1-AS1、HAGLROS、HCP5。在多因素 Cox 回归分析中，构建了由5个铁死亡相关的lncRNA组成的预后模型（图1）。DNM3OS：DNM1对向连RNA；ATP2A1-AS1：ATP2A1反义 RNA1；HAGLROS：HAGLR 反 向 连 RNA；HCP5：ln-cRNA人类组织相容性白细胞抗原复合物P5。图1 铁死亡相关lncRNA预后模型热图 Riskscore的中位值为1.039，据此将卵巢癌患者分成高风险组和低风险组，每组182例。2.3 铁死亡相关lncRNA预后模型的验证Kaplan-Meier分析结果显示高风险组患者的41A 高、低风险组卵巢癌患者的Kaplan-Meier曲线B 高、低风险组卵巢癌患者的生存状态分布C 高、低风险组卵巢癌患者的风险得分分布图2 2组卵巢癌患者预后模型的验证分布预后差于低风险组，低风险组患者中位生存时间为 4.326 年，95%CI：3.521，5.131，高风险组患者中位生存时间为3.449年，95%CI：3.055，3.844，差异具有统计学意义（图2A）。Riskscore的分布图显示低风险组预后较好（图2B、C）。单因素Cox回归分析显示：年龄（HR=1.021，95%CI：1.008，1.034，P=0.001）和Riskscore（HR=1.689，95%CI：1.382，2.065，P 0.001）与卵巢癌患者的OS预后相关（图3A）。多因素Cox回归分析显示，Risks-core 是 OS 的独立预测因素（HR=1.629，95%CI：1.324，2.005，P 0.001，图3B）。2.4 免疫浸润分析与基因表达比较两组的免疫途径，显示抗原提呈细胞共抑制、检查点、细胞溶解活性、人类白细胞抗原、促炎、主要组织相容性复合体、T细胞共抑制、型干扰素应答在两组之间的差异有统计学意义。由于ICI的免疫治疗的重要性，进一步研究该模型与ICI之间的关系，发现其中程序性细胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein 1，PDCD1/PD1），程序性死亡配体-1（programmed death-ligand 1，CD274/PD-L1），细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4，CTLA4）的差异有统计学意义。图3 铁死亡相关lncRNA预后模型分析年龄分化程度肿瘤分期风险值0.0010.4670.1010.001P值1.0211.1621.2821.689风险比1.008，1.0340.775，1.7410.953，1.7261.382，2.06595%CI0.00.51.01.52.0风险比年龄分化程度肿瘤分期风险值0.0040.8080.1160.001P值1.0191.0521.2771.629风险比1.006，1.0320.700，1.5810.942，1.7311.324，2.00595%CI0.00.51.01.52.0风险比A 单因素分析B 多因素分析3讨论讨论作为一种新型的 RCD 模式，铁死亡与多种疾病密切相关，并被认为是恶性肿瘤治疗中的新靶点。本研究筛选出了与铁死亡相关的多个lncRNA，并构建了包含 5 个 lncRNA（DNM3OS、AC004816.1、ATP2A1-AS1、HAGLROS、HCP5）的预后风险模型。该模型可将卵巢癌患者分为高风险和低风险两组，不同组别患者的OS存在显著差异，且该模型是OS的独立预测指标。此外，在不同组别中，免疫细胞浸润状态和ICI相关mRNA的表达也有所不同。因此，该预后风险模型可以帮助医生更好地制定治疗方案，并可能为卵巢癌治疗提供新的思路和靶点。第49卷兰州大学学报（医 学 版）42铁死亡受许多基因和酶的调控，如 p53、长链酯酰辅酶A合成酶4、Gpx4等18。越来越多的lncRNA被证明可以调节肿瘤细胞中的铁死亡。例如，通过直接与细胞质中信号蛋白的功能域相互作用，lncRNA p53调控RNA调节p53调节器，导致细胞周期停滞、铁死亡和凋亡，从而抑制肿瘤进展19。研究20表明，lncRNA Opa相互作用蛋白5-反义转录物1，通过miR-128-3p/SLC7A11信号通路促进前列腺癌的进展和对铁死亡的抵抗，lncRNA可能参与了铁死亡的分子调控机制。本研究预后模型的构建涉及的5个lncRNA，它们在卵巢癌铁死亡过程中的角色仍然不清楚。此外，卵巢癌中铁死亡与免疫细胞浸润之间的关系也需要进一步探讨。本研究通过7种常用的方法评估了两组患者的免疫细胞组成情况，发现低风险组通常含有较高比例的免疫细胞，如CD8+T细胞、NK细胞、巨噬细胞M1细胞21-22。此外，低风险组卵巢癌患者免疫检查点分子的表达水平更高。最近的一项研究23表明，免疫检查点阻断可以通过激活 CD8+T 细胞来诱导肿瘤铁死亡。因此，可以推断在卵巢癌中，铁死亡与肿瘤浸润免疫细胞的比例密切相关，低危组患者倾向于免疫激活状态，高危组患者倾向于免疫抑制状态。低风险组的患者更有可能从免疫疗法中受益，而高风险组的患者则更难。提示该铁死亡相关的 ln-cRNA预后模型可以预测卵巢癌患者免疫治疗的疗效。卵巢癌预后主要通过分期、组织类型、淋巴转移情况来判断，但是相同分期的患者预后差异很大，说明还有其他的因素影响着患者的预后。本研究中构建的预后模型可以将患者明确分成高、低风险组，具有较高的敏感性及特异性，是独立预测因素，且不同风险组的免疫状态不同，这就为临床免疫治疗及随访提供了一定的参考价值。与其他研究相比，本研究的优点在于将研究范围精确缩小，重点研究了铁死亡相关 lncRNA对卵巢癌预后的判断，为之后铁死亡在卵巢癌中的研究提供一定生物信息学基础。本研究开发了一种基于铁死亡相关的lncRNA的预后模型，旨在预测卵巢癌患者的预后和免疫状态。这一模型为卵巢癌患者的个性化危险分层和免疫治疗反应评估提供了新思路。但本研究也存在局限性：预后模型需要通过多中心大规模前瞻性研究进一步验证，验证工作和 lncRNA与卵巢癌铁死亡的具体机制研究将是本研究团队之后的研究方向。参 考 文 献1 Drouin L,Guani B,Balaya V,et al.Results of a 2021 French National Survey on management of patients with advanced stage epithelial ovarian cancerJ.Journal of Clinical Medicine,2021,10(21):4829.2 Monk BJ,Randall LM,Grisham RN.The evolving land-scape of chemotherapy in newly diagnosed advanced epithelial ovarian cancerJ.American Society of Clinical Oncology Educational Book,2019,39:e141-e151.3 Armstrong DK,Alvarez RD,Bakkum-Gamez JN,et al.Ovarian cancer,version 2.2020,NCCN clinical practice guidelines in oncologyJ.Journal of the National Com-prehensive Cancer Network,2021,19(2):191-226.4 Yang WS,Stockwell BR.Ferroptosis:Death by lipid peroxidationJ.Trends in Cell Biology,2016,26(3):165-176.5 Liang Chen,Zhang Xinglin,Yang Mengsu,et al.Recent progress in ferroptosis inducers for cancer 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