腹泻型肠易激综合征与溃疡性结肠炎患者肠道菌群的关联分析.pdf

现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 论 著腹泻型肠易激综合征与溃疡性结肠炎患者肠道菌群的关联分析阳柳思，徐豪明，吴琼，李鹰飞，周永健，黄红丽【摘要】目的通过比较腹泻型肠易激综合征（）与溃疡性结肠炎（）患者的肠道菌群特征，探索两者的关联。方法选择 年 月至 年 月在广州市第一人民医院消化内科住院的 和 患者各 例，以及 名健康志愿者，收集新鲜人类粪便标本，提取 并进行 高通量测序，对患者肠道菌群的多样性、优势菌群等进行统计学比较分析。结果代表菌群丰富度和均匀度的 多样性分析中，组和 组的 指数、指数、指数、指数、指数和 指数分别为 （）、（）、（）、（）、（）、（）。在 检验（，）显示各组菌群组成存在一定差异的前提下，（）和 （）分析显示 和 患者的肠道菌群结构偏离健康对照组但非常相近。组和 组实际检测的 数量分别为 和 ，其中共有数量高达 ；分别于门、科和属水平上对两组平均相对丰度排名前十的优势菌群进行比较，仅 （，）、（，）、（，）、（，）和 （，）的差异具有统计学意义。与健康对照组相比，组和 组 的 和 的 平 均相 对丰 度 均有 上调；、和 的平均相对丰度均有下调；组与 组相比，组的 平均相对丰度更高，组的 平均相对丰度更高。结论 和 患者的肠道菌群丰富度、均匀度和结构高度相似，且“共享”大部分优势菌群。和 丰度的改变可能介导了 和 患者的腹泻症状，和 丰度的差异可能与两种疾病腹泻性质不同相关。【关键词】肠易激综合征；溃疡性结肠炎；高通量测序；肠道菌群中图分类号：；文献标志码：作者单位：华南理工大学医学院附属第二医院消化内科通信作者：黄红丽，：基金项目：国家自然科学基金资助课题（）；广州市科技技术项目（、）；广州市临床高新技术研究项目（）；中央高校基本科研业务费（），【】（）（），（），（），（），（），（），（）（）（），（，）现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 （），（，），（，），（，），（，）（，），【】；肠易激综合征（，）是一种以临床表现腹痛、腹胀、排便习惯和（或）大便性状改变而缺乏胃肠道结构和生化异常为特点的慢性功能性肠道疾病，发病机制尚不明确，可能与肠道菌群、脑 肠轴、免疫激活、胆汁酸代谢紊乱等因素有关 。罗马 标准将 分为 伴腹泻型（，）、伴 便 秘 型（，）、伴有便秘和腹泻混合型（），）以 及 不 确 定 型（，），我国以腹泻型为多见，其特点是慢性腹痛及频繁腹泻。溃疡性结肠炎（，）是炎症性肠病的两种主要形式之一，血性腹泻是 患者最常见的症状。的疾病特点是始于直肠并持续向结肠近端蔓延的粘膜层和粘膜下层浅表连续性炎症，发病机制尚不明确，肠道菌群改变、免疫反应失调、遗传易感性和环境影响是目前公认的四大发病因素 。近年来，高通量测序技术迅速发展 ，越来越多的研究支持肠道菌群紊乱介导了功能性肠道疾病 和器质性肠道疾病 的发生发展，但两种疾病肠道菌群的关联以及是否存在“共享”鲜有研究报道。因此，鉴于两种疾病具备共同的临床表现（慢性腹泻、腹痛）和发病因素（肠道菌群改变），本文拟通过 高通量测序技术，比较分析 和 临床患者粪便样本的肠道菌群特征，探索两者的关联，为疾病的诊疗提供一定的参考和思路。对象与方法 研究对象选择 年 月至 年 月在广州市第一人民医院消化内科进行诊疗的腹泻型肠易激综合征患者（组）和溃疡性结肠炎患者（组）各 例，以及 名健康志愿者（，组），收集新鲜人类粪便样本。样本基础信息详见表 。纳入标准：根据罗马 标准 确诊为 ；根据中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组 炎症性肠病诊断与治疗的共识意见 确诊为 ；患者年龄 至 岁，以腹痛和腹泻为主要症状；健康志愿者样本收集符合当时国际公认的粪便微生物群移植标准供体筛选要求 。排除标准：患者近一个月内接受过抗生素治疗或其他研究性药物治疗；存在精神病史者；伴有明显焦虑抑郁状态或近 个月内服用过镇静、抗焦虑或抗抑郁药物者；妊娠及哺乳期妇女；健康志愿者样本排除符合当时国际公认的粪便微生物群移植标准供体筛选要求 。本研究中所有研究对象均自愿参与研究并且签署知情同意书，并通过广州市第一人民医院伦理委员会审核批准（、）。表 样本基础信息 组 组 组样本量 平均年龄（岁）性别（男 女）临床诊断 （腹泻型）活动度轻度 例中度 例重度 例未定 例发病部位 （直肠）例 （左半结肠）例 （全结肠）例未定 例 肠道菌群分析采集 和 患者新鲜粪便样本各 例，以及 名健康志愿者两次不同时间的新鲜粪便样本共 例。提取粪便 ，在粪便 样品浓度、纯度以及总 样品质量检测通过后，使用正向引物（）和反向引物（）对 区段进行 扩增，采用 平台进行 高通量测序，最后根据 数据库进行物种注释（广州基迪奥生物科技有限公司提供技术支持）。统计学方法应用 、进行分析与绘图。呈正态分布的计量资料以珋 表示，组间比较采用 检验；呈偏态分布的计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，组间比较采用 秩和检验。菌群丰度以百分数表示。为差异具有统计学意义。结果 和 患者肠道菌群丰富度、均匀度以及结构相近多样性分析中，、指数主要关心样本的现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 物种丰富程度；和 指数还表示预测的操作分类单元（，）个数；指数反映样本的测序饱和度；、指数综合体现物种的丰富度和均匀度。组、组、组各项指数对比详见表 。表 多样性指数 组 组 组 （值）对 组和 组以上各项指数分别做 检验，值均 ，结果无统计学差异。以 指数为代表做图如下（图 ）。因此，在样本测序饱和度高度一致的情况下，组和 组样本菌群的丰富度、均匀度相近，并且比起健康对照组均有显著降低。在 检验（，）已经确定 、和 各组间肠道菌群的组成存在一定差异的情况下，为了更直观的判断肠道菌群的 多样性，我们进一步在 水平，综合物种进化距离和物种丰度的 层面对三组进行比较，（）（图 ）和 （）分析均显示 组和 组的菌群结构偏离健康对照组但非常相近。和 患者肠道优势菌群差异不显著，存在大部分“共享”健康对照组中实际检测出的 数量为 ，而 组和 组中实际检测出的 数量相近，分别为 和 ，其中共有数量高达 。图 组和 组各项指数的 检验：多样性 指数（为 ；为 ；为 ）；：多样性 分析分别在门、科、属级水平上，取 组和 组平均相对丰度排名前 位的优势物种（图 ）做 检验，结果如下：门级水平上，（厚壁菌门）、（变形菌门）、（放线菌门）、（拟杆菌门）、（疣 微 菌 门）、（梭 杆 菌 门）、（帕 氏 菌 门）、（广 古 菌 门）和 （蓝藻菌门）值均 ，仅 （酸杆菌门）（，）的差异具有统计学意义；科级水平上，（肠杆菌科）、（双歧杆菌科）、（肠球菌科）、（拟杆菌科）、（瘤胃球菌科）、（链球菌科）、（乳杆菌科）、（阿克曼菌科）值均 ，仅 （毛螺菌科）（，）和 （消 化 链 球 菌 科）（，）的差异具有统计学意义；属级水平上，（埃希菌 志贺菌属）、（双歧杆菌属）、（肠球菌属）、（拟杆菌属）、（链 球 菌 属）、（粪 杆 菌 属）、（阿克曼菌属）、（乳杆菌属）值均 ，仅 （布劳特氏菌属）（，）和 （罗姆布茨菌属）（，）的差异具有统计学意义。因此，我们可以认为 和 患者的肠道优势菌群差异不显著，存在大部分“共享”。特定菌属的丰度改变，可能是 和 患者都有腹泻表现的重要原因在属级水平上，根据物种平均相对丰度，分别对 组、组和 组两两进行 检验，筛选出 值 且平均丰度均 的菌属（图 ）。我们可以看到，与健康对照组相比，组和 组的 （双歧杆菌属）、（肠球菌属）平均相对丰度均有上调；组和 组的 （粪杆菌属）、（普雷沃氏菌属）、（丁酸弧菌属）平均相对丰度均有下调。组与 组相比，组的 （布劳特氏菌属）和 （丁酸弧菌属）平均相对丰度更高，组的 （罗姆布茨菌属）、（多尔氏菌属）平均相对丰度更高。其中 、和 非平均相对丰度排名前十的优势菌属，不纳入统计分析。因此，我们初步推断，的丰度上调和 的丰度下调导致了 与 患者肠道菌群紊乱，从而引起腹泻表现，而 和 丰度的差异可能与两种疾病腹泻性质 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 不同相关。图 物种分布堆叠图（门、科、属）图 各组平均相对丰度变化（属）讨论肠易激综合征（）和溃疡性结肠炎（）都是我国常见的消化系统疾病，近年来发病率和就诊人数呈快速上升趋势 ，但治疗仍无特异性药物或方法。尽管具体机制尚不明确，两种疾病的发病因素都包含有肠道菌群的变化，且存在共同临床表现慢性腹泻，严重影响患者的心理状况和生存质量 。因此，通过比较肠道菌群的特征，探索两种疾病的关联，明确疾病的发病机制，对 和 的预测、诊疗、随访具有重要意义 ，。根据前文对 高通量测序结果的分析，我们发现 和 患者肠道菌群的丰富度、均匀度以及结构高度相似，两者优势菌群差异不显著且存在大部分“共享”。组间比较存在特定菌属的改变，具体表现为 、和 的丰度变化和差异。众所周知，是目前研究得最多的益生菌，大量证据表明它们可以刺激有益细菌的生长和活性，有效调节肠道菌群失衡，改善肠道粘膜屏障和免疫系统功能，进而对腹泻、肝性脑病、和坏死性小肠结肠炎等有益 ，然而本研究却发现 和 的 丰度高于健康对照组，可能是样本量、样本年龄的差异以及测序技术导致的统计偏移。（普拉梭菌）作为 中重要的产丁酸菌，可影响肠上皮细胞能量供应、宿主代谢以及肠道免疫等 ，作为新型益生菌和生物标志物在 和 中已有广泛应用 。则通常与大部分的院内感染有关，多为致病菌 ，也有极小部分 ，例如 （粪肠球菌）可作为有益菌，下调环氧化酶 、诱导型氧化氮合酶 、干扰素 等表达调节肠道免疫。和 都属于产短链脂肪酸菌，在抗炎免疫、调节代谢等方面能够发挥一定的作用，两种菌属的丰度常常与多种宿主生理功能障碍（如糖现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 尿病、肥胖症、结直肠癌）呈显著负相关。然而有研究者发现与健康对照组相比，和 患者的粪便中却有着较高丰度的 ，此外，等 的一项研究发现 的丰度与小鼠 模型的特异性相关，这些发现均提示了 和 在 和 中的特殊性，但两者是否与 和 的腹泻特异性相关仍有待探索。综上所述，本文通过使用 高通量测序技术对以慢性腹泻、腹痛为主要症状的 和 患者的粪便样本进行比较分析，发现两者的肠道菌群在丰富度、均匀度以及结构上具有高度相似性；两者优势菌群差异不显著，存在大部 分“共 享”；共 有 优 势 菌 属 包 括 、和 ，其中 和 的相对丰度变化可能介导了两种疾病的慢性腹泻症状，和 的差异可能与两种疾病的腹泻性质不同相关。以上研究发现为腹泻型 和 的临床表型相关特征菌群探索、临床预测和诊疗以及菌群生物标志物随访等提供了一定的依据和参考。然而，本研究仍存在以下不足：研究为小样本分析，存在一定的统计偏倚；高通量测序技术在分析深度上存在一定的局限性，故并未细化到菌种水平进行讨论；有关腹泻的结论仅为描述性。因此，在后续的研究中，我们将进一步扩大样本收集，细化变量，对部分样本做宏基因组测序分析，再结合具体实验数据支撑进行深入探讨。参考文献 ，（）：，：，（）：（），（）：，（）：，：？，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（年北京）中国实用内科杂志，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：李孝镇，唐志鹏，谢建群溃疡性结肠炎患者的生存质量分析 例 世界华人消化杂志，：，：，：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，；：（收稿日期：）（本文编辑：赵芯梅）