和田羊FGF5基因RNA干扰载体构建及筛选.pdf

和田羊FGF5 基因 RNA 干扰载体构建及筛选2023 年 第 9 期和田羊FGF5 基因 RNA 干扰载体构建及筛选曹少奇1，陈岩2，高新梅1，喻恒彬2，王静2*，胡广东2*（1.新疆维吾尔自治区畜牧总站，新疆 乌鲁木齐 830000；2.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832061）摘 要：试验旨在构建并筛选出高效的和田羊成纤维细胞生长因子5（FGF5）基因的RNA干扰载体，根据和田羊FGF5基因序列，设计4条短发夹RNA（shRNA）干扰片段和1条阴性对照片段。扩增后克隆至pGPU6载体，获得 4 个重组质粒 pGPU6-shRNA-FGF1、pGPU6-shRNA-FGF2、pGPU6-shRNA-FGF3、pGPU6-shRNA-FGF4和阴性对照质粒pGPU6-shRNA-FGF5。通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序对质粒进行酶切鉴定和测序鉴定。鉴定后的质粒通过电刺激法转染至和田羊成纤维细胞，通过qRT-PCR和Western Blotting（WB）分析FGF5基因的表达情况。结果显示，与阴性载体相比，4个RNA干扰表达载体均可显著降低FGF5 mRNA和蛋白的表达量（P0.05），其中pGPU6-shRNA-FGF3干扰效率最高，为85.20%。研究表明，FGF5干扰表达载体构建成功并可有效干扰和田羊FGF5基因表达。关键词：和田羊；RNA干扰；FGF5基因；载体构建；成纤维细胞中图分类号：S 813.1 文献标识码：A 文章编号：1672-9692（2023）09-0032-05Construction and screening of RNA interference vector aimed at Hotan sheep FGF5 geneCao Shaoqi1,Chen Yan2,Gao Xinmei1,Yu Hengbin2,Wang Jing2*,Hu Guangdong2*(1.Xinjiang Animal Husbandry Station,Xinjiang Urumqi 830000;2.College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Xinjiang Shihezi 832061)Abstract:The aim of the experiment was to construct and screen out efficient RNA interference vectors of Hotan sheep FGF5 gene.According to the FGF5 gene sequence of Hotan sheep,four shRNA interference fragments and one negative control fragment were designed.Four recombinant plasmids pGPU6-shRNA-FGF1,pGPU6-shRNA-FGF2,pGPU6-shRNA-FGF3,pGPU6-shRNA-FGF4 and negative control plasmid pGPU6-shRNA-FGF5 were obtained.The plasmid was identified by enzyme digestion and DNA sequencing by agarose gel electrophoresis.The identified plasmids were transfected into Hotan sheep fibroblasts by electrical stimulation,and the expression of FGF5 gene was analyzed by qRT-PCR and WB.The results showed that compared with the negative vector,the four RNA interference expression vectors could significantly reduce the expression levels of FGF5 mRNA and protein(P0.05),and pGPU6-shRNA-FGF3 had the highest interference efficiency(85.20%).The study indicates that the FGF5 interference vector is successfully constructed and can effectively interfere with FGF5 gene expression in Hotan sheep.Key words:Hotan sheep;RNA interference;FGF5 gene;Vector construction;Fibroblast和田羊是历史悠久的地方半粗毛羊品种，但由于育种工作落后，导致生产性能发生退化。因此，对控制和田羊羊毛的性状相关基因进行深入研究，进一步改善和田羊的羊毛品质，对和田羊种质资源的开发与保护具有重要意义1。毛囊是支持哺乳动物毛发形成和生长的重要器官，其周期受血管内皮细胞生长因子2、骨形态发生蛋白43、胰岛素样生长因子 14、FGF55等多种信号分子的调控，FGF5是控制毛囊从生长期向退行期转换的关键因子6。FGF5由3个外显子和两个内含子构成，具有调控毛囊周期收稿日期：2022-12-08作者简介：曹少奇，硕士，畜牧师，研究方向为动物遗传育种与繁殖、畜牧业技术推广。通讯作者：王静，博士，副教授，研究方向为动物生理学；胡广东，博士，副教授，研究方向为动物胚胎工程、动物生物技术。基金项目：新疆维吾尔自治区多浪羊品种选育推广技术体系专项（2021DLY-23）；兵团重点领域科研攻关计划项目肉羊健康养殖模式关键技术集成创新与示范（2021AB014）32现代畜牧兽医2023 年 第 9 期的功能，是调节毛发生长的重要因子之一。在对小鼠、驴、犬、猫、人的试验中均发现FGF5基因的表达量与毛发生长有关，也有研究发现FGF5基因的表达与绒山羊的羊绒生长有关7。综上，沉默或敲除FGF5因子研究其对动物产毛性状的影响，对提高产毛动物的毛产量具有重要意义。对绒山羊中使用RNAi技术进行FGF5敲除试验，结果表明，RNAi技术可有效降低FGF5的表达8-9，且FGF5敲除后对绒山羊的血液生理生化指标10、发情能力11无显著影响。本研究中设计并合成了4个shRNA，将其与pGPU6/GFP/Neo质粒连接构建干扰表达载体，将干扰载体转染至和田羊成纤维细胞，检测其对和田羊FGF5基因的mRNA和蛋白表达水平的干扰效率，筛选出干扰效率最强的shRNA，为进一步探讨和田羊中FGF5基因的作用机制、改善和田羊毛质量奠定基础。1材料与方法1.1试验材料试验用和田羊由石河子大学兽医站饲养，剪取和田羊耳部组织分离培养获得成纤维细胞。大肠杆菌DH5购自天根公司；质粒pGPU6/GFP/Neo购自上海吉玛技术有限公司。胎牛血清（FBS）、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶购自Gibco；20PBS、质粒提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；青霉素-链霉素（HyClone）；Trizol（Invitrogen 公司）；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（TaKaRa公司）；抗GADPH鼠单克隆抗体、抗FGF5鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（Abcam公司）。CO2培养箱（Thermo公司）、超净工作台（日本日立公司）、LightCycler 96实时荧光定量PCR仪（罗氏公司）；垂直电泳仪、凝胶成像系统、半干转膜仪（美国BIO-RAD公司）；水平板电泳仪（上海天能科技有限公司）。1.2和田羊FGF5基因靶向寡核苷酸的设计与制备依据和田羊FGF5基因CDS区与shRNA的设计原则，使 用 Life Technologies 公 司 网 站（http:/www.lifetech- shRNA target design工具，设计得到4条长度为54 bp的shRNA干扰片段 PR-FGF1、PR-FGF2、PR-FGF3、PR-FGF4 和 1 条长度为 51 bp 的阴性对照片段 PR-FGF5，片段序列信息见表1。shRNA干扰片段上下游分别引入BamH 酶切位点和Bbs 酶切位点，由上海生工生物工程有限公司合成相应的shDNA单链。1.3RNA干扰载体的构建将所得的单链 shDNA 使用 20 L 体系（Sense 1 L、10SSC 1 L、Anti-Sence 1 L、ddH2O补齐）进行退火连接；反应条件为95 变性10 min，室温冷却1 h；获得双链shDNA。4 条干扰片段分别命名为 shRNA-FGF1、shRNA-FGF2、shRNA-FGF3、shRNA-FGF4，阴性对照片段命名为shRNA-FGF5。使用限制性内切酶BamH 和Bbs 对质粒pGPU6/GFP/Neo进行双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行回收，得到线性化的质粒 pGPU6/GFP/Neo。将合成的5条双链shDNA，分别与线性化的pGPU6/GFP/Neo质粒4 过夜连接，连接产物转化入感受态细胞中，过夜挑取单菌落至培养管，摇菌扩大培养，进行质粒提取后获得重组质粒。重组质粒利用BamH 进行单酶切鉴定后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，送至上海生工生物工程有限公司测序。1.4重组质粒酶切鉴定重组质粒酶切体系为：10buffer H 1 L，BamH 酶0.5 L，BSA（10 g/L）0.25 L，质粒4 L，灭菌超纯水补至10 L。离心混匀后，置37 水浴2 h；65 经10 min灭活内切酶，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.5细胞培养和细胞转染采取和田羊耳部组织块，使用PBS溶液（含有50万单位青霉素-链霉素）清洗，之后用75%酒精浸泡2 min，再次使用PBS溶液仔细清洗。在超净工作台中将组织块表皮表1FGF5 RNA干扰片段序列信息Tab.1FGF5 RNA interference fragment sequence information编号PR-FGF1PR-FGF2PR-FGF3PR-FGF4PR-FGF5序列信息GCTCCCACGAAGCCAATATGTTTCAAGAGAACATATTGGCTTCGTGGGAGCTTGCACGTCTCTACCCACTTTCTTTCAAGAGAAGAAAGTGGGTAGAGACGTGCTTGGAACTTTCTTTCACAGTTACTTCAAGAGAGTAACTGTGAAAGAAAGTTCCTTGCATCGGTTTCCATCTGCAGATTCAAGAGATCTGCAGATGGAAACCGATGCTTGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATT片段长度/bp5454545451332023 年 第 9 期Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine去除，在PBS溶液中将组织块剪碎至糊状，使用PBS溶液离心清洗35遍，胰酶消化后再次使用PBS溶液离心清洗35遍，将清洗后的组织块种至60 mm培养皿中，在细胞培养箱（37、5%CO2）中放置5 min，待组织块贴壁后取出，在培养皿中添加含有10%FBS的DMEM/DF12完全培养基（含有20万单位青霉素-链霉素），放入细胞培养箱中培养，2 d后更换培养基，4 d后可见耳部组织块周围迁移出成纤维细胞，2 d更换一次培养基继续培养至细胞数量可用。利用电刺激转染的方式将5种RNA干扰载体转染至成纤维细胞，24 h后观察绿色荧光蛋白GFP6表达情况。1.6RT-PCR检测FGF5 mRNA表达水平电转染24 h后，使用TRIzol试剂盒提取各组细胞的总RNA，反转录为 cDNA 通过 RT-PCR 检测细胞样品中FGF5基因表达量，重复3次。定量引物序列为：AAGAC-TGGGCGGGAGTGGTA；GGCTTGACGGGATTAGGTG。采用2-Ct法计算FGF5基因的相对表达量。1.7WB检测FGF5蛋白表达水平电转染36 h后，弃掉培养液，使用RIPA裂解液裂解各组细胞提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度并计算出SDS-PAGE电泳上样量，电泳至溴酚蓝刚跑出，半干转法转膜，之后用5%脱脂奶粉室温摇床孵育，封闭1 h。剪取一次性塑料手套指头部分，将膜放入其中，将稀释好的一抗滴到膜上，使用封口机封口，4 过夜孵育。TBST洗膜2次，向50 mL离心管中加入稀释过的二抗，将膜放入其中，室温摇床孵育 1 h，TBST 洗膜 2 次。使用HRP-ECL发光法进行鉴定，确定FGF5蛋白表达量。1.8数据统计与分析使用SPSS 19.0统计学软件对转染后的成纤维细胞中FGF5基因表达量进行单因素方差分析。P0.05表示显著差异，P0.01表示极显著差异。2结果与分析2.1和田羊FGF5 基因 shRNA 干扰载体的构建与鉴定结果将合成的5条寡聚核苷酸片段与pGPU6/GFP/Neo载体连接，转化、挑菌、摇菌、质粒提取，获得重组质粒。重组质粒利用BamH 进行单酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，重组质粒 pGPU6-shRNA BamH 单酶切鉴定结果见图1。由图1可知，BamH 单酶切后5个重组质粒均只出现1条条带，且大小符合预期。将提取的质粒送公司测序，测序结果与设计序列相符，表明4个干扰表达载体均构建成功，pGPU6-shRNA载体图谱见图2。将 5 个 pGPU6-shRNA 的载体分别命名为 pGPU6-shRNA-FGF1（即 PR-FGF1）、pGPU6-shRNA-FGF2（即PR-FGF2）、pGPU6-shRNA-FGF3（即 PR-FGF3）、pGPU6-shRNA-FGF4（即 PR-FGF4）、pGPU6-shRNA-FGF5（即PR-FGF5）。2.2绵羊耳部成纤维原代细胞及质粒转染细胞（见图3）由图3（a）可知，培养2 d后组织块周围迁移出绵羊耳部成纤维细胞；由图3（b）可知，组织块培养培养4 d后成纤维细胞的细胞密度约为80%。注：M表示DNA Marker Trans 5K；15表示PR-FGF1、PR-FGF2、PR-FGF3、PR-FGF4、PR-FGF5。图1重组质粒pGPU6-shRNA BamH I单酶切鉴定Fig.1 Gel electrophoresis of recombinant interference vector with single enzyme digestion图2pGPU6-shRNA载体图谱Fig.2 PGPU6-shRNA vector map图3绵羊耳部成纤维原代细胞及质粒转染细胞Fig.3 Sheep ear fibroblasts primary cells and plasmid transfected cells34现代畜牧兽医2023 年 第 9 期利用电激转染的方式将5种RNA干扰载体转染至成纤维细胞，24 h后通过荧光显微镜观察荧光情况。由图3（c）、3（d）可知，转染后细胞可见绿色荧光，表明成纤维细胞中开始表达外源绿色荧光蛋白，干扰载体转染成功。2.3干扰载体对FGF5基因沉默效率检测结果以转染阴性质粒PR-FGF5的成纤维细胞为对照，采用qRT-PCR检测成纤维细胞转染4个干扰载体和阴性质粒后FGF5基因mRNA表达量，结果见图4。由图4可知，4个shRNA干扰表达载体均能够不同程度干扰成纤维细胞中FGF5 mRNA的表达。PR-FGF1组、PR-FGF2 组、PR-FGF3 组、PR-FGF4 组干扰效率分别为23.91%、58.85%、85.20%、43.59%，均显著低于PR-FGF5组（P0.05），其中重组质粒PR-FGF3对FGF5基因的干扰效率最高。以转染阴性质粒PR-FGF5的成纤维细胞为对照，以GAPDH为内参蛋白，采用WB检测成纤维细胞转染4个干扰载体和阴性质粒后FGF5蛋白表达量，结果见图5。由图 5 可知，与 PR-FGF5 组相比，PR-FGF1 组、PR-FGF2组、PR-FGF3组、PR-FGF4组中FGF5蛋白表达量均明显降低。其中，PR-FGF3组中FGF5蛋白表达量降低最显著，WB结果与qRT-PCR结果趋势相同。结果表明，PR-FGF3 RNA干扰片段抑制FGF5基因表达效果最佳。3讨论成纤维细胞生长因子（FGFs）属于多肽类生长因子，通过与酪氨酸激酶型 FGF 受体（FGFRs）结合发挥作用12。目前在单细胞动物中并未发现FGFs基因，已发现的FGFs与FGFR基因全部存在于多细胞动物中。线虫中存在两种FGFs，人和小鼠中存在23种FGFs，因此，FGFs基因种类可能随着生物的进化不断增多，并构成越来越复杂的调控网络，参与更多的生物学功能。据此，深入研究FGFs及其受体FGFRs基因的调控网络将为研究动物生长、生理调控过程和演化中生物功能的变化奠定基础。FGF5是FGFs家族的一员，广泛存在于多种哺乳动物中。但有研究发现，不同动物中FGF5蛋白存在明显的区别，目前，FGF5在人和小鼠体内的主要作用是调控毛囊生长，是已知最有效的诱导毛囊从生长期转换到休止期的因子。FGF5在毛囊生长期末期高表达，可促进毛囊从生长期至退行期的转换，从而抑制毛发生长13。采用RNAi技术或FGF5抑制剂对FGF5基因进行抑制后，FGF5蛋白表达量降低，毛囊生长期被延长。与野生型小鼠相比，通过基因打靶技术敲除FGF5基因的小鼠毛发生长速度明显升高14，FGF5基因敲除的绵羊羊毛长度和产量均有所提高15。研究表明，FGF5抑制因子对人类脱发具有治疗效果16，也可以促进小鼠毛发生长17。FGF5能够改变真皮乳头细胞的活性，抑制真皮乳头细胞介导的外跟梢细胞的增殖，进而调控毛囊周期，抑制毛发生长，诱导毛发再生18。研究发现，将绵羊的FGF5敲除后，FGFR1、雄激素、Wnt/-catenin、Shh/Gli2、c-MYC等因子产生了变化并存在一些相互作用19。有研究表明，FGF5可影响绵羊毛囊发育与毛发生长20。综上所述，在生物、细胞、分子水平上继续深入研究FGF5对毛发发育的影响具有重要的意义和较高的可行性。本研究通过RNAi技术构建并筛选出了干扰效率达到85.2%的和田羊成纤维细胞FGF5基因干扰载体，可作为后续和田羊FGF5的RNAi序列，为研究FGF5对和田羊羊毛生长的调控、改善和田羊羊毛质量提供技术支持。在此基础上，可进一步在其他毛囊相关细胞中进行FGF5敲除试验，以探究FGF5在毛囊周期调控网络中的作用；同时可将FGF5基因干扰与FGF5抑制剂进行对比，探究FGF5抑制剂应用于和田羊毛生产的可能性。4结论本研究构建并筛选出了和田羊FGF5基因的干扰表达载体，经细胞验证可高效干扰和田羊FGF5基因的表达，可应用于和田羊FGF5基因功能的研究中。注：*表示差异显著（P0.05）。图4重组质粒转染后FGF5 mRNA表达量Fig.4 Expression of FGF5 mRNA after transfection with recombinant plasmid图5重组质粒转染后FGF5蛋白表达量Fig.5 Expression level of FGF5 protein after transfection with recombinant plasmid352023 年 第 9 期Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine参考文献1 万煜,李树伟,史瑞军,等.和田羊皮肤附属器观察及雄激素相关蛋白的表达定位J.黑龙江畜牧兽医,2022(21):7-10.2 呼啸.VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长机制的研究D.呼和浩特:内蒙古大学,2021.3 张琛,李佳丽,靳荣帅,等.兔BMP4基因对毛囊发育相关基因表达的影响J.西南农业学报,2022,35(6):1448-1454.4 夏颖,丁娟,张建青,等.胰岛素样生长因子1促进毛囊间充质干细胞增殖的机制研究J.全科医学临床与教育,2021,19(10):874-878.5 林豪杰,祁均梅,许诺,等.成纤维细胞生长因子-5对毛囊周期的调控作用研究进展J.中国美容医学,2019,28(11):163-166.6 曾晓晨.FGF5基因敲除辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞系的构建D.长春:吉林农业大学,2017.7 Li Y F,Song S,Zhang Z K,et al.A deletion variant within the FGF5 gene in goats is associated with gene expression levels and cashmere growthJ.Animal Genetics,2022,53(5):657-664.8 王丙萍.靶除FGF5基因体细胞克隆绒山羊的研究D.呼和浩特:内蒙古农业大学,2014.9 康健.绒山羊FGF5基因的特异性表达及RNA干扰研究D.杨凌:西北农林科技大学,2014.10 朱蓉慧,白玉恒,王荣斌,等.敲除FGF5基因对陕北白绒山羊血液生理生化指标的影响J.中国畜牧杂志,2018,54(6):52-56.11 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