凝胶渗透色谱法GPC资料_17页.docx

1、一般地，传统的单一检测器的GPC，例如：由液相色谱仪改造而来的GPC，只需要进样量20ul（微升）或稍多，而且对浓度没有很精确的要求，一般只有一个浓度范围。这个范围对应于柱子的分离能力和检测器的量程。而浓度的具体大小，则也与分子量有关系！当分子量越大时，浓度应该减小；反之，浓度应该增大。但是浓度太大，则会出现堵柱子，而且也会使检测器出现平头峰；浓度太小则会出现检测器检测不到信号的情况。一般都在几毫克/毫升的浓度比较合适。对于先进的多检测器GPC，则进样量要大很多了，至少也要50ul，甚至100、200ul也不稀奇。这样算下来，样品量就不少了。之所以说可能需要很多样品，是因为与具体方法有关。如果样品本身是没有经典的GPC方法，需要摸索、建立一个新方法的话，那么样品需要量确实会大一些，特别是对一些新合成的样品，你很难确定他用什么溶剂溶解样品更合适，这时候就需要你去尝试，或者去查文献。此时样品消耗是很大的！例如，我在仪器信息网上介绍过的聚乳酸样品的情况就是如此：当样品高度支化甚至成为星形支化时，传统的THF溶剂已经不能用了，需要换溶剂！而做出这一判断也是非常难的！在这一过程中，样品的消耗是非常大的，虽然浓度很低。但是由于进样频繁，所以配制的样品溶液，会较快消耗。此外，样品量过少，也会带来样品典型性差的问题。所以，在工业生产企业的质量检验中，往往需要较大的样品量来配制成较多的样品溶液以避免典型性不足的问题，尽管实际进样量很小。样品量少，往往是由于聚合规模小，实验室的小型合成，或者样品是昂贵、难得的生化类样品，如：蛋白质、多糖等。解决这类问题，可以选择微量GPC，但是价格非常昂贵。一般地，聚合物都不存在这类问题，无非是多聚合些样品出来，样品本身不是很值钱。而对于生化类样品，一般GPC就没办法了，要么多弄些样品，要么买微量GPC。但是一般也是选择前者，因为你还需要作重复性和重现性呢，并不是做一次进样就完了！最起码要进两针啊。如果遇到柱效有问题，那么你还需要重新做标准曲线。2、GPC可以改用不同流动相，包括水，DMF，CHCl3，THF等，但是要配备不同的柱子。楼主说流动相中要加入少量的三乙胺，主要原因是用THF做流动相时，聚合物出峰不是很好，有时候峰比较宽，PDI就上去了，这种情况往往出现在聚合物中含有很多阳离子或阴离子。正常的聚合物测GPC是不需要加三乙胺的。如果楼主做过HPLC就知道了，HPLC中流动相往往都需要加入三氟乙酸或者氨水，这样有利于出峰的峰型好看，好准确测定其保留时间。3、呵呵，难道紫外检测器不是通用型检测器吗？确如你所说，示差折光检测器存在这样那样的不足，但是由于绝大多数聚合物没有紫外吸收，或者紫外吸收很弱，所以示差折光检测器也就应运而生了，而且在GPC中得到广泛应用。目前，示差折光检测器的地位，还是无法替代的，尤其是随着激光散射检测器的广泛应用，RI更是不可或缺的了，这也是紫外检测器所无法比拟的。何况，虽然RI检测器灵敏度稍低些，但是由于激光散射检测器LS灵敏度远高于紫外检测器，而且一步得到绝对分子量，所以RI与LS的结合，不仅具有更强大的功能、更多的数据信息量，而且灵敏度、精度和重现性都更好，于是就把紫外UV远远甩在身后了。紫外之所以落后就是因为在LS中，需要一个数据：dn/dc值，这个数据可以由示差折光检测器得到，而紫外不能！所以，LS需要与RI结合而可以不需要UV了。此外，根据样品分子量大小，改变样品浓度或者进样量，以及配置脱气机，都可以提高GPC系统的灵敏度和分析效果。特别是脱气机，对于本体粘度较小的流动相，不配置脱气机，就会造成气泡影响色谱图基线，从而影响分析效果，那么紫外UV再灵敏也是没用的！4、一般来说，GPC的柱子在第一次经过溶剂之后就不能再进行更换，原因在于凝胶在不同的溶剂里面的溶胀率是不一样的，如果大量其他溶剂进去的话柱子就报销了。GPC的柱子溶剂有很多可以选，THF，DMF，H2O，CHCl3都是可以的。如果是在上海的话，我记得华东理工大学是可以测氯仿的流动相的。作者：501Visco用过DMF 的柱子换用氯仿，也是可以做到的；但是，由于DMF体系常需要加入氯化锂、溴化锂，所以当换用氯仿时，可能这些盐会析出从而堵塞系统，因此首先需要用中间溶剂淋洗，例如：乙醇，然后再用氯仿洗柱子，而且全用小流速，0.1或者0.2ml/min，顺便连仪器系统也洗了。这个过程时间可能挺长的。但是，用中间溶剂淋洗，容易造成柱效下降溶剂对固定相可能会有影响，所以最好还是不换，DMF的柱子就专用吧。在DMF里不溶，可考虑升高温度、加盐再试一试。DMF体系难度很大啊，那个盐需要很高纯度的，最好是进口的、色谱纯或者光谱纯的。但是，如果能用THF或者氯仿溶解，那最好还是用这些溶剂吧，因为DMF太难、太麻烦，柱子损耗太大、色谱图受柱子的柱效下降影响太大，一般用户很难区分是柱效下降了还是样品分离-分析效果不好。5、对于多检测器GPC而言，有了光散射、粘度检测器不一定就可以做出很好的数据。因为使用者的色谱经验和技能仍然非常重要。有不少用户，特别是高分子专业的人士，对光散射和粘度比较熟悉，但是对GPC不是很熟，所以在使用多检测器GPC时仍然效果不是很好。尤其是对一些复杂样品的分离、样品溶液制备、分析方法、色谱柱选择等等因素，不是很熟悉，可能测试结果不令人满意。因此，液相色谱、GPC的知识和技能仍然非常重要。在此之上，才能谈得到多检测器技术的应用效果。用户自己的学习能力、厂家提供的培训效果，都决定了仪器的使用效果。我感觉，不少单位有多检测器GPC，但是实际使用效果不佳，有些甚至不怎么使用，只当个摆设了。即使是一些检测中心等单位，也是水平参差不齐。有的还行，有的就差些。有些用户，自己就是用过、甚至只是听说过多角外推法的激光散射仪，基本没有GPC色谱经验，所以他也把多检测器GPC当成了一个光散射仪来用，那么使用效果就很难说了。6、如果检测器是示差折光检测器，那么直接出的谱图中横坐标是时间，或者叫保留时间，纵坐标是RI检测器信号强度。分子量数据，先使用一系列已知分子量的标准样品（而且一般是单分布的）在色谱图上拟和出来一条标准曲线，再把待测样品注射入色谱进行分析，其色谱峰落在曲线上的位置就是这个样品的峰值分子量，简称：Mp。对于宽分布样品，最终数据是软件积分得到的。峰面积只与样品绝对进样量有关，进样进样量大、或者样品浓度高，峰面积就大；反之，峰面积就小。有些GPC色谱仪软件具有分峰计算能力，有些则没有。没有分峰计算功能的GPC及其软件，就很难处理这类数据了，即使用其它的软件也很难。7、UV 紫外检测器DAD 二极管阵列检测器FD 荧光检测器ECD 电化学检测器ELSD蒸发光检测器RID 示差折光检测器MSD质谱检测器FLD就是荧光检测器以及MS/MS，NMR等也可以和液相色谱连用作者：lchn18紫外吸收检测器紫外吸收检测器 ultraviolet absorption detector 简称紫外检测器（UV），是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器。因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外吸收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的检测器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。示差检测:是通用型检测器，凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统（当然现在糖类elsd很普遍）。示差检测器示差检测器（RID）是连续检测样品流路与参比流路间液体折光指数差值的检测器，是根据折射原理设计的，属偏转式类型。光源通过聚光镜和夹缝在光栏前成像，并作为检测池的入射光，出射光照在反射镜上，光被反射，又入射到检测池上，出射光在经过透射镜照到双光敏电阻上形成夹缝像。双光敏电阻是测量电桥的两个桥臂，当参比池和测量池流过相同的溶剂时，使照在双光敏电阻的光量相同，此时桥路平衡，输出为零。当测量池中流过被测样品时，引起折射率变化使照在双光电阻上的光束发生偏转，使双光敏电阻阻值发生变化，此时由电桥输出讯号，即反映了样品浓度的变化情况。二极管阵列检测器（diode-array detector, DAD）： 以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。荧光检测器荧光检测器（FD）是高压液相色谱仪常用的一种检测器。用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出。其特点是选择性高，只对荧光物质有响应；灵敏度也高，最低检出限可达10-12g/ml，适合于多环芳烃及各种荧光物质的痕量分析。也可用于检测不发荧光但经化学反应后可发荧光的物质。如在酚类分析中，多数酚类不发荧光，为此先经处理使其变为荧光物质，而后进行分析。电化学检测器电化学检测器（ECD）一般在特殊情况下使用。主要用来测定化学性质不稳定的离子，如容易被氧化或还原的离子。灵敏度极高的电化学(安培)检测器，可用于离子色谱和高效液相色谱。该检测器的特性是选择性非常高，只有容易氧化或还原的电活性物质才可被检测。例如,即便有高含量的氯化物、硫酸盐共存时，其他离子的检测也不受干扰，因为这两种离子不被电化学检测器所检测。蒸发光检测器蒸发光散射检测器(Evaportive light Scattering,ELSD)已经开发生产15年，但是对于许多色谱工作者来说，它仍是一个新产品。第一台ELSD是由澳大利亚的Union Carbide研究实验室的科学家研制开发的，并在八十年代初转化为商品，八十年代以激光为光源的第二代ELSD面世。此后，通过不断设计提高了ELSD的操作性能。现在ELSD越来越多的作为通用型检测器用于高效液相色谱，超临界色谱（SFC）和逆流色谱中。ELSD最大的优越性在于能检测不含发色团的化合物，如：碳水化合物、脂类、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性剂、药物，并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物 。 ELSD的通用检测方法消除了常见于传统HPLC检测方法中的难点，不同于紫外和荧光检测器，ELSD的响应不依赖与样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。示差检测器（RI）也可以说是一种通用型检测器，但它灵敏度低，并与梯度脱洗不相容。质谱是另一种通用型检测器，但它的昂贵操作费用和复杂性限制了它的应用。 ELSD的独特检测方法，对于它的多种用途和高性能至为关键。ELSD检测只要分为三个步骤：（1）用惰性气体雾化脱洗液（2）流动相在加热管（漂移管）中蒸发（3）样品颗粒散射光后得到检测。 蒸发光散射检测器是一种通用型的检测器，可检测挥发性低于流动相的任何样品，而不需要样品含有发色基团。蒸发光散射检测器灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合与梯度洗脱液相色谱联用。质谱检测器（相当于在液相后边接了质谱）质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。作者：lchn18示差折光检测器这一系统灵敏度低（检测下限为10-7gml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。UV检测的主要缺点在于紫外不吸收的化合物灵敏度很低。1.紫外是选择性检测器，示差是通用性检测器；2.紫外检测器灵敏度高，示差检测器灵敏度低；3.紫外检测器可进行梯度洗脱，示差检测器不能进行梯度洗脱；4.紫外检测器对压力和温度不敏感，示差检测器很敏感。 示差检测在原理上虽然是通用型检测器，但是它的灵敏度低，和梯度脱洗不相容，因此它对于HPLC来说不是理想的检测器。而紫外检测器既可用于等度洗脱，也可用于梯度洗脱.9、动态光散射基本原理及其在纳米科技中的应用粒径测量 动态光散射Dynamic Light Scattering (DLS)，也称光子相关光谱Photon Correlation Spectroscopy (PCS) ，准弹性光散射quasi-elastic scattering，测量光强的波动随时间的变化。DLS技术测量粒子粒径，具有准确、快速、可重复性好等优点，已经成为纳米科技中比较常规的一种表征方法。随着仪器的更新和数据处理技术的发展，现在的动态光散射仪器不仅具备测量粒径的功能，还具有测量Zeta电位、大分子的分子量等的能力。（一）动态光散射的基本原理1. 粒子的布朗运动Brownian motion导致光强的波动 微小粒子悬浮在液体中会无规则地运动 布朗运动的速度依赖于粒子的大小和媒体粘度，粒子越小，媒体粘度越小，布朗运动越快。2. 光信号与粒径的关系 光通过胶体时，粒子会将光散射，在一定角度下可以检测到光信号，所检测到的信号是多个散射光子叠加后的结果，具有统计意义（见附件一）。瞬间光强不是固定值，在某一平均值下波动，但波动振幅与粒子粒径有关（见附件二）。某一时间的光强与另一时间的光强相比，在极短时间内，可以认识是相同的，我们可以认为相关度为1,在稍长时间后，光强相似度下降，时间无穷长时，光强完全与之前的不同，认为相关度为0（此原理见附件三）。根据光学理论可得出光强相关议程（见附件四）。之前提到，正在做布朗运动的粒子速度，与粒径（粒子大小）相关（Stokes - Einstein方程）。 大颗粒运动缓慢，小粒子运动快速。如果测量大颗粒，那么由于它们运动缓慢，散射光斑的强度也将缓慢波动。类似地，如果测量小粒子，那么由于它们运动快速，散射光斑的密度也将快速波动。附件五显示了大颗粒和小粒子的相关关系函数。 可以看到，相关关系函数衰减的速度与粒径相关，小粒子的衰减速度大大快于大颗粒的。最后通过光强波动变化和光强相关函数计算出粒径及其分布（见附件六）。3. 分布系数(particle dispersion index,PDI) 分布系数体现了粒子粒径均一程度，是粒径表征的一个重要指标。 0.05 单分散体系，如一些乳液的标样。 0.7 尺寸分布非常宽的体系，很可能不适合光散射的方法分析。4. 光强分布、体积分布和数量分布的关系 说明光强、体积和数量分布之间差异的简单方式，是考虑只含两种粒径（5nm和10nm）、但每种粒子数量相等的样品。附件七显示了数量分布结果。 可以预期有两个同样粒径（1:1）的峰，因为有相等数量的粒子。第二个图显示体积分布的结果。 50nm粒子的峰区比5nm（1:1000比值）的峰区大1000倍。 这是因为，50nm粒子的体积比5nm粒子的体积（球体的体积等于4/3（r）3）大1000倍。第三个图显示光强度分布的结果。 50nm粒子的峰区比5nm（1:1000比值）的峰区大1,000,000倍（比值1:1000000）。 这是因为大颗粒比小粒子散射更多的光（粒子散射光强与其直径的6次方成正比 （得自瑞利近似）。（二）动态光散射样品要求基本要求 样品应该较好的分散在液体媒体中 理想条件下，分散剂应具备以下条件: 透明 和溶质粒子有不同的折光指数 应和溶质粒子相匹配 （也就是：不会导致溶胀, 解析或者缔合） 掌握准确的折光指数和粘度，误差小于0.5% 干净且可以被过滤粒径下限依赖于： 粒子相对于溶剂产生的剩余光散射强度 溶质和溶剂折光指数差 样品浓度 仪器敏感度 激光强度和波长 检测器敏感度-雪崩式光电二极管 仪器的光学构造粒径上限 动态光散射测量粒子无规则的热运动/ 布朗运动 若粒子不进行无规则运动，动态光散射无法提供准确粒径信息 粒子尺寸的上限定义于沉淀行为的开始 因此上限取决于样品 应考虑粒子和分散剂的密度样品浓度上限 对于高浓度样品，由动态光散射测得的表观尺寸可能会受到不同因素的影响 多重光散射 检测到的散射光经过多个粒子散射 扩散受限 其他粒子的存在使得自由扩散受到限制 聚集效应 依赖于浓度的聚集效应 应电力作用 带电粒子的双电层相互重叠，因而粒子间有不可忽视的相互作用。这种相互作用将影响平移扩散10、以前做过GPC，GPC一般都是洗脱液等度洗脱，理论上你的基线从头到尾应该是平的，但是会出峰，可能原因在于：1、你的溶剂中存在杂质、或者2、你的GPC凝胶柱在上一次运行完后没有冲洗干净，建议你用流动相多运行几次再看看，在我们做农残中，一般用GPC净化样品的，所有样品运行结束后一般再冲洗半个小时左右，避免杂质残存看你用THF，好像是合成分离方向的？还是别的，大家探讨一下吧11、一条是分布线（开口向下的抛物线的那条）：不同粘度/分子量组分的量一条是积分线：纵坐标值表示横坐标值对应的粘度/分子量以下组分的百分含量Mn:数均分子量这个图是已经处理后得到的分子量分布图。这两条线应该对应着看，类似抛物线的是积分线，另一条线是不同分子量所占的百分含量，例如，从图上可看出，分子量logMw5.2的大分子的含量是55%左右，分子量50，那么就可能漏液或者进气体的地方，则需要检测一下泵的密封垫，如损坏则需更换；如果只出一个THF负峰，可能是进样器的针头就没有吸进样品。你可以试一下连续进一个只装有THF的样品瓶连续进样，3-4次，每次50微升，看看样品瓶中的样品有没有减少，若没有减少，则是进样器没有吸进样品。17、（1）.就是时间*流速，如果流速是1ml/min的话，时间和淋洗体积是等同的。2.基线不稳有很多原因，流动相有气泡或者系统没有达到平衡或者样品浓度偏低，或者里面有强极性的东西存在。曾经做过几个氟橡胶，随后我的机器很长时间基线都下偏。先从处理流动相开始吧3.两个峰要看实际情况，有的样品就会是两个峰，因为分子量在两个范围分布。也不是就说明你的样品不纯，关键要看你的样品理论上会不会出现双峰。4.倒峰基本上是溶剂峰，但是要看峰的位置来确定。有时有有时无可能与你的流动相与溶剂有差异有关。使用体系内的流动相来做溶剂会减小溶剂峰。基线不稳，也可能是仪器故障，例如：RI检测器有问题等，也会造成基线不稳；基线不平，其实对传统GPC还是有影响的，因为会影响积分起止点的位置，从而影响数据准确性；对多检测器GPC也有些影响，相对小一些；不过还是基线越平、噪音越低越好；基线不平、不稳的原因还是比较多的；没错，连峰有可能是样品本身分布复杂造成的，很正常；只是计算有些复杂：有些软件无法计算连峰的色谱图，而且无法分峰计算每个峰的分子量分布，那就没辙了；例如：有些多角激光散射检测器，好像就没有分峰计算能力，弄一个可信度来应付，不知如何计算出来的；样品峰后面的反峰就更正常了，一般是溶剂峰，有时候还有样品中的杂质、其它溶剂体系的溶剂残留等等，甚至还有其它溶剂体系内添加的盐、酸等物质，在目前体系下残留下来造成的。18、HPLC的常用术语1、色谱图（chromatogram）：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。2、（色谱）峰（chromatographic peak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。此主题相关图片如上： 3、峰底（peak base）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图1 中的CD）。4、峰高（h ，peak height）：色谱峰最大值点到峰底的距离（图1 中的BE）。5、峰宽（W ，peak width）：在峰两侧拐点（图1 中的F ，G）处所作切线与峰底相交两点的距离（图1 中的KL）。6、半高峰宽（W h/2 ，peak withd at half height）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离（图1 中的HJ）。7、峰面积（A ，peak area）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。8、拖尾峰（tailing peak）：后沿较前沿平缓的不对称的峰。9、前伸峰（leading peak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）10、假峰（ghost peak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）11、畸峰（distrorted peak）：形状不对称的色谱峰， 前伸峰、拖尾峰都属于这类。 12、反峰（negative peak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。14、原点（origin）：纸或薄层板上滴加试样部位的中心点（图）。15、斑点（spot）：平面色谱法中，组分在展开和显谱后呈现近似圆形或椭圆形的色区（图2）。16、区带（zone）：在色谱柱、纸或薄层板上被分离组分所占的区域。17、复斑（multiple spot）：一种组分展开后形成两个或多个清晰斑点。18、区带拖尾（zone tailing）：由于物理、化学等作用的影响，一种组分在展开后形成的彗星形状斑点。19、基线（base line）：在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的响应信号曲线。 20、基线漂移（baseline drift）：基线随时间定向的缓慢变化。21、基线噪声（N，baseline noise）：由于各种原因而引起的基线波动。22、统计矩（moment）：色谱流出曲线是组分在检测器中浓度或质量依时间的统计分布曲线，响应值对应于分布密度。组分在柱内迁移时间r次幂的数学期望称为流出曲线的r阶原点矩。而组分在柱内迁移时间与平均迁移时间差的r次幂的数学期望称为流出曲线的r阶中点矩。23、一阶原点矩（first origin moment）：组分在柱内迁移时间的数学期望。当流出曲线为对称峰时，即为组分的保留时间。24、二阶中心矩（ 2 ，second central moment）：二阶中心矩为流出曲线的方差。定义为： 2=E(t-Et)2 式中，代表平均。25、三阶中心矩（ ，third central moment）：定义为：3=E(t-Et)3 可以表示流出曲线的不对称程度。峰形对称时3=，前伸峰3。第二部分分离模式、液相色谱法（liquid chromatography ，LC）：用液体作流动相的色谱法。 2、液液色谱法（liquid liquid chromatography，LLC ）：将固定液涂渍在载体上作为固定相的液相色谱法。、液固色谱法（liquid solid chromatography，LSC ）：用固体（一般指吸附剂）作为流动相的液相色谱法。、正相液相色谱法（normal phase liquid chromatography ，NPLC）：固定相的极性较流动相的极性强的液相色谱法。、反相液相色谱法（reversed phase liquid chromatography，RPLC ）：固定相的极性较流动相的极性弱的液相色谱法。 6、柱液相色谱法（liquid column chromatography ）：在柱管内进行组分分离的液相色谱法。7、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC ）：具有高分离效能的柱液相色谱法。、尺寸排除色谱法（size exclusion chromatography，SEC ）：用化学惰性的多孔性物质作为固定相，试样组分按分子体积（严格来讲是流体力学体积）进行分离的液相色谱法。9、凝胶过滤色谱法：（gel filtration chromatography ）：水或水溶液作为流动相的体积排除色谱法。