3紫外-可见分光光度法.ppt

,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,模块三,紫外,-,可见分光光度法,项目,1,基本原理,项目,2,紫外,-,可见吸收光谱和分子结构的关系,项目,3,紫外,-,可见分光光度计,项目,4,测量条件的选择,项目,5,定性和定量分析方法,知识一,紫外,-,可见吸收光谱的概述,知识二,紫外,-,可见吸收光谱的产生,知识三,光吸收定律,知识四,偏离,Beer,定律的因素,项目,1,基本原理,知识一,紫外,-,可见吸收光谱的概述,利用紫外,-,可见吸收光谱对物质进行定性定量分析的方法称为紫外,-,可见分光光度法（,ultraviolet and visible spectrophotometry,，,UV-vis,),。,紫外,-,可见分光光度法一般准确度约为,0.5,，采用性能较好的仪器其测定准确度可达,0.2,，检测限一般可达,10,-4,-,10,-6,g/mL,；既可以进行单一组分和多组分样品的定量分析，也可以根据吸收光谱的特性，与其他分析方法配合，用以推断有机化合物的分子结构，鉴别结构不同的化合物。由于本法准确灵敏、仪器相对比较简单、适用于大多数有共轭结构的化合物，在化学、药学等领域有着极其广泛的应用。,知识二,紫外,-,可见吸收光谱的产生,紫外,-,可见吸收光谱是基于分子内的电子跃迁产生的吸收光谱，属于带状光谱，这是由于吸收紫外光的分子除了有电子能级的跃迁外，还伴随着分子振动能级和转动能级的跃迁（见图,3-1,）。,紫外,-,可见光区的波长一般用,nm,表示，可分为真空紫外光区（,190nm,）、近紫外光区（,200380nm,）和可见光区（,380780nm,）三个区间，常规分析仅限于使用近紫外光和可见光。,图,3-1,电磁波吸收和分子能级示意图,知识三 光吸收定律,早在,18,世纪,Borguer,和,Lambert,研究了物质对光的吸收和吸收介质厚度的关系。,19,世纪,Beer,确定了光吸收和溶液浓度与液层厚度之间的关系，建立了光吸收的基本定律，习惯上称为,Lambert-Beer,定律。其中,Beer,定律说明吸光度与浓度的关系，,Lambert,定律说明吸光度与厚度的关系。,设一束强度为,I,0,的平行单色光束垂直通过厚度为,L,的均匀介质，则一部分光被介质中的吸光分子吸收，使光的强度由,I,0,降到,I,，若吸光分子浓度为,c,，则,Lambert-Beer,定律的数学表达式可表示为,上,式中，,E,在一定条件下为常数，称为吸光系数,（,absorptivity,）定义,I/I,0,是透光率,(transmitance,，,T,常用百分数表示，以,A,代表,-lgT,，称为吸光度（,absorbance),，,则有,A=-lgT=Ecl,或,T=10,-A,=10,-Ecl,说明单色光通过吸光介质后，透光率,T,与浓度,c,或厚度,L,之间的关系是指数函数的关系。例如，浓度增大一倍时，透光率从,T,降至,T,2,。若以透光率的负对数为吸光度,A,，则吸光度与浓度或厚度之间是简单的正比关系,。,知识四 偏离,Beer,定律的因素,按照,Beer,定律，浓度,c,与吸光度,A,之间的关系应该是一条通过原点的直线。事实上，往往容易发生偏离直线的现象而引人误差。导致偏离的主要原因有化学方面和光学方面的因素。,图,3-2,比尔定律的偏离情况,1.,化学因素,溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合与溶剂间的作用等原因而发生偏离,Beer,。,由化学因素引起的偏离，有时可控制溶液条件设法减免。上例若在强酸性溶液中测定,Cr,2,O,7,2-,，或在强碱性溶液中测定,CrO,4,2-,都可避免偏离现象。,2.,光学因素,分为,非单色,、杂散光、散射光和反射光、非平行光四种情况。,知识一,跃迁类型,知识二,光谱特征及有关术语,知识三,吸收带及其与分子结构的关系,项目,2,紫外,-,可见吸收光谱和分子结构的关系,知识,1,跃迁类型,根据分子轨道理论，分子中的价电子主要有处于,轨道上的,电子，,轨道上的,电子和未参与成键而仍处于原子轨道中的,n,电子（亦称,p,电子）。电子围绕分子或原子运动的概率分布叫做轨道。轨道不同，电子所具有的能量也不同。分子轨道可以认为是当两个原子靠近而结合成分子时，两个原子的原子轨道可以线性组合生成两个分子轨道。其中一个具有低能量称为成键轨道，另一个具有高能量的称为反键轨道。,如图,3-3,所示，两个氢原子的,s,电子结合并以。键组成氢分子，分子轨道具有,成键轨道和,*,反键轨道。同样两个原子的,p,轨道平行地重叠起来，组成两个分子轨道时，该分子轨道称,成键轨道和,*,反键轨道。,键的电子重叠比,键的电子重叠少，键能弱，跃迁所需的能量低。分子中,n,电子的能级，基本上保持原来原子状态的能级，称非键轨道。比成键轨道所处能级高，比反键轨道能级低。图,3-4,显示，分子中不同轨道的价电子具有不同能量，处于低能级的价电子吸收一定能量后，就会跃迁到较高能级。,图,3-3 H,2,的成键和反键轨道,图,3-4,分子中价电子能级跃迁示意图,在紫外和可见光区范围内，有机化合物的吸收光谱主要是,由,-*,、,-*,、,n-*,、,n-*,过及电荷迁移跃迁产生。,知识,2,光谱特征及有关术语,紫外,-,可见吸收光谱是分子中的价电子有选择地吸收紫外,-,可见光产生的吸收光谱。吸收光谱又称吸收曲线，是以波长,(nm),为横坐标，以吸光度,A,（或透光率,T,）为纵坐标所描绘的曲线，如图,3-5,所示。,吸收光谱的特征一般用下列术语进行描述,：,吸收峰,、,谷,、,肩峰末端吸收,、,生色团,、,助色团,、,红移,、,蓝（紫）移,、,增色效应和减色效应,、,强带和弱带,图,3-5,吸收光谱示意图,知识一 仪器的构成,知识二 紫外,-,可见分光光度计的类型,项目,3,紫外,-,可见,分光光度计,知识,1,仪器的构成,各种型号的紫外,可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由,5,个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统。,光源,单色器,吸收池,检测器,信号指系统,1,光源,对光源的基本要求是在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化尽可能小。紫外,-,可见分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源,2,类：热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和碘钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。,2.,单色器,单色器是能从光源的复合光中分出单色光的光学装置。单色器一般由入射狭缝、准光气（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成（如图,3-7,所示）。其核心部分是色散元件，起分光的作用，主要有棱镜和光栅,2,种。,（,a,）棱镜型,(b),光栅型,3,吸收池,吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料,2,种。石英池用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。为减少光的反射损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。在高精度的分析测定中（紫外光区尤其重要），同一套吸收池的性能要基本一致。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度等对分析结果都有影响。,4,检测器,检器的功能是检测光信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。常用的检器有光电池、光电管和光电倍增管等。它们通过光电效应将照射到检测器上的光信号转变成电信号。对检测器的要求是：在测定的光谱范围内具有高的灵敏度；对辐射能量的响应时间短，线性关系好；对不同波长的辐射响应均相同，且可靠；噪声水平低、稳定性好等。,5.,信号指示系统,它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。,知识,2,紫外,-,可见分光光度计的类型,紫外,-,可见分光光度计的类型很多，但可归纳为,3,种类型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。,知识一 入射光波长的选择,知识二 参比溶液的选择,知识三 吸光度读数范围的选择,项目,4,测量条件的选择,知识,1,入射光波长的选择,入射光波长的选择应根据吸收曲线，通常选择最大吸收波长max作为入射光波长。因为在max处K值最大，测定的灵敏度高，同时在max附近，吸光度变化不大，不会造成对吸收定律的偏离，因而测定的准确度也较高。,知识,2,参比溶液的选择,吸光光度法测定吸光度时，是将待测溶液盛放于比色皿内，放入分光光度计光路中，测量入射光的减弱程度。由于比色皿对入射光的反射、吸收，以及溶剂、试剂等对入射光的吸收也会飞光强度减弱，为了使光强度减弱仅与待测组分的浓度有关，需要选择合适组成的参比溶液，将其放入比色皿内并置于光路中，调节仪器，使T=100%（A=0），然后再测定盛放于另一相同规格比色皿中的试液吸光度，这样就消除了由于比色皿、溶剂及试剂等对入射光的反射和吸收带来的误差。,选择参比溶液的原则是：使试液的吸光度真正反映待测组分的浓度。,知识一 定性分析方法,知识二 定量分析方法,项目,5,定性和定量分析方法,知识,1,定性分析方法,一、定性鉴别,定性鉴别主要是依据有机化合物的光谱特征，如光谱形状、吸收峰数目、吸收长及相应的吸光系数值等对样品进行定性鉴别。,（1）对比吸收光谱特征数据 最常用于鉴别的光谱特征数据是吸收峰和谷所在波长(max和min)；max处的或值也常用于化合物的定性鉴别。,（2）对比吸光度的比值 有两个或更多吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰处(或峰与谷)测得吸光度的比值。,（3）对比吸收光谱的一致性 将试样与已知标准品配制成相同浓度的溶液，在同一条件下分别描绘吸收光谱，核对其一致性，也可利用文献所载的标准谱进行核对。若光谱曲线有差异则试样与标准品并非同一物。,知识,2,定量分析方法,（一）目视比色法,用睛观察、比较待测物质溶液颜色的色度以测定其含量的方法，称为目比色法。常用的目视比色法是标准系列法。这种方法要使用一套由同种玻璃材料制成的形状、大小相同的平底玻璃管（亦称比色管），依次分别在比色管中加入不同量的待测组分标准溶和一定量的显色剂及其他辅助试剂，并用溶剂稀释到相同体积，配成一套颜色逐渐加深的标准色阶。将一定量试液在相同条件下显色、定容，然后从管口上方垂直向下观察颜色深浅，将待试系列色阶比较，颜色深浅相同者，其待测物质含量亦相同。,（二）分光光度法,1,.,单一组分的定量分析,标准曲线法、比较法、示差分光光度法,2,.,多组分的定量分析,当试液中共存组分较多，吸收曲线可能相互重叠而发生干扰时，可通过实验测量和计算下列解析式，求得各组分的含量，不必分离,。,实验部分,任务一 钢中硅含量的测定,一、目的,1,.,熟悉钢铁试样的分解方法和硅标准液的配制方法。,2,.,掌握杂多酸的生成条件极其在分光光度法中的应用。,二、实验原理,钢中的硅能增加钢的耐热性、耐酸性、抗张力性，硅还是有效的脱氧剂、硅在钢中主要以FeSi形态存在。,钢样以稀酸溶解后，硅呈可溶性的正硅酸，然后在一定酸度下与钼酸铵生成硅钼杂多酸，最后在草酸存在下用Fe,2+,使之还原成硅钼蓝进行光度比色测定、有色离子的干扰用空白抵消。,三、实验步骤,1,.,试样的溶解 称取试样0.l g，精确至0.0001 g，置于100 mL烧杯中，加入15 mL 1:3 HNO,3,（若为合金钢，可改用混合酸），低温加热30 min左右，使试样溶解，此时溶液主体呈黄色。滴加高锰酸钾溶液以氧化碳化物及偏磷酸，待MnO,2,生成后，再多加几滴，然后用亚硝酸钠溶液还原过量KMnO,4,及生成的MnO,2,，使溶液呈清亮状态，煮沸驱尽氮氧化物，冷却，定量转移至250 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀。,分别取此溶液10.0 mL于两个50 mL容量瓶中，按下列手续分别处理：,显色液：准确地加人5mL钼酸铵溶液，用少量水冲洗瓶壁，于沸水浴上加热30s以生成硅钼黄，加10mL草酸和10mL硫酸亚铁铵溶液，冷却，稀释至刻度，摇匀。,空白液：加人10mL草酸溶液，5mL钼酸铵溶液，10mL硫酸亚铁铵溶液，稀释至刻度，摇匀。用2cm比色皿，在分光光度计上，于680nm波长处，以空白液为参比，测量显色液吸光度。,2,.,标准曲线绘制 称取纯铁粉（0.002）0.1g，精确至0.0001g，于100mL烧杯中，按照溶解试样方法溶解，制备成底液。吸取底液5.0mL，分别置于5个 50mL容量瓶中，依次加人硅标准溶液0.00、0.50、1.50、2.50和3.50mL，补加水到总体积为10mL，按上述显色步骤进行显色，测量吸光度，绘制标准曲线。,任务二 工业废水中微量挥发酚的测定,一、目的,1,.,了解工业废水中酚的分离方法。,2,.,掌握用分光光度测定微量挥发酚的原理和方法。,二、原理,在炼油、炼焦、煤气洗涤和某些化工厂的废水中一般都含有酚类化合物，酚的水溶液易被人体皮肤吸收，酚蒸气由呼吸道吸入会引起中毒，严重危害人体健康水体中含酚在110 mg/L时，会使鱼类中毒甚至死亡，含酚量大于100 mg/L的废水用于灌溉农田，会导致农作物减产或枯死，故水中酚的测定具有重大意义，采用预蒸馏将酚蒸出，测定的是挥发酚含酚量在0.1,-,1.0 mg/L的废水样，可采用4-氨基安替比林为显色剂，在pH值为10.0的酸度条件下，以铁氰化钾为氧化剂，酚与显色剂作用生成橙红色吲哚酚安替比林染料，可用分光光度法测定。生成的物质在冰中能稳定30 min。如用氯仿萃取，可使此染料稳定4h，并能提高测定灵敏度。当水样中存在氧化剂、还原剂、油类及某些金属离子时，均应设法消除并进行蒸馏。如对游离氯可加人硫酸亚铁还原；对硫化物可用硫酸铜使之沉淀或酸化使其变成硫化氢逸出；对油类可采取溶剂萃取清除。进一步蒸馏，既可分离出挥发酚，又能避免颜色、浑浊和金属离子等干扰。,三、步骤,1,.,标准曲线的绘制 于50mL容量瓶中分别加人0.00、0.50、1.00、3.00、5.00、10.00mL标准酚溶液（含酚0.010 mg/mL左右），加入2.5mL NH,3,-NH,4,Cl缓冲然液，1.0 mL4-氨基安替比林溶液，混匀，加人1.0mL铁氰化钾溶液，混匀，加水稀释至刻度、放置10min，以试剂溶液为参比液，于510nm，用1cm比色皿测定吸光度A值。,2,.,废水试样的测定 量取250mL废水样于玻璃蒸馏-冷凝器内，加入5mLCuSO,4,溶液，用H,3,PO,4,溶液调节溶液pH4.0，放入数粒玻璃珠，蒸馏，以250mL量筒收集馏出液，待馏出液为220230mL时停止加热。待蒸馏瓶内液面静止后，向其中加25mL蒸馏水，再蒸馏至馏出液的液面达量筒250mL的标线为止。,移取适量的馏出液，按制作标准曲线方法显色，然后测定A值。计算挥发酚的质量浓度，用苯酚的形式来表征，单位为mg/L。,任务三 邻二氮菲分光光度法测定水中微量铁,一、实验目的,1,.,初步掌握常见型号可见分光光度计的使用方法。,2,.,掌握吸收光谱曲线的测绘方法和测定波长的选择。,3,.,掌握邻二氮菲分光光度法测定水中微量铁的基本原理、操作方法和数据处理,二、实验原理,邻二氮菲（简写为phen)又称1,10-邻二氮菲，或邻菲啰啉。它与Fe,2+,在pH为29的溶液中均可形成稳定的橘红色配合物Fe(phen),3,2+,，其lgK稳=21.3（20）。最大吸收波长max=510nm，摩尔吸光系数510=1.1104L/(molcm)因此测定的灵敏度高，可以利用这一方法测定水中的微量铁。这种方法也是国家标准规定的测定化工产品中杂质铁的通用方法。,测定时，可用醋酸盐缓冲溶液控制溶液酸度在pH=5左右，酸度过高，反应进行较慢；酸度过低，则Fe,2+,水解，影响显色和准确度。水中的Fe,3+,可以先用盐酸羟胺或抗坏血酸还原成二价后再进行测定。,三、实验步骤,1准备工作,（1）清洗容量瓶，移液管及需用的的玻璃器皿。,（2）配制铁标准溶液和其他辅助试剂。,（3）按仪器使用说明书检查仪器，预热20min，并调试至工作。,（4）检查比色皿的配套性。,取4只洁净的2cm玻璃比色皿，装入蒸馏水至2/3处，置于比色皿架内，在60nm处，以第一个比色皿为参比，调节为100，测量其他各比色皿的透射比，透射比的偏差小于0.5%的比色皿可配成一套使用。记录参考格式如下：比色皿配套性检查：（1）=100%，（2）=%，可以配套使用。,2测绘吸收曲线，选择测定波长,取2只洁净的50mL容量瓶，移取10.00g/mL铁标准液5.00mL于其中一个容量瓶中，然后在两容量瓶中各加入1mL100g/L盐酸羟胺溶液，平摇摇匀后再分别加人2mL1.5g/L二氮菲溶液、5mLNaAc溶液，用蒸馏水稀释至标线，摇匀。,用2cm比色皿，以未加铁标准溶液的试剂空白为参比，在440540nm间，每隔10nm测量一次吸光度值（注意每改变一次波长，都要重新调节仪器零点和参比溶液的=100）。在峰值附近每隔2nm测量一次。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制吸收曲线，确定max作为测定波长。要求总测量点不少于13个点。,任务四 紫外分光光度法测定苯甲酸含量,一、实验目的,1,.,初步掌握T,6,新世纪型（或其他型号）紫外,-,可见分光光度计的使用方法,2,.,熟练掌握吸收光谱曲线的测绘方法和测定波长的选择；,3,.,掌握苯甲酸的紫外吸收光谱分析基本原理、操作方法和数据处理。,二、实验原理,利用紫外吸收光谱进行定性的方法是：将未知试样和标准样在相同的溶剂中，配制成大致相同的浓度，在相同条件下，分别绘制它们的紫外吸收光谱曲线，两者进行比较，如果两光谱图形状相似，max和max相同，则可初步判断是同一物质。,苯甲酸会产生,-,*跃迁和n-*跃迁，在227nm处有较强的吸收。可用此波长作为测量波长，用工作曲线法定量。,三、实验步骤,1,.,准备工作,（1）清洗容量瓶、移液管及需用的玻璃器皿。,（2）配制苯甲酸标准溶液。,（3）按仪器使用说明书检查仪器，预热20min，并调试至工作状态。,（4）检查比色皿的配套性。,取3只洁净的,1,cm石英比色皿，装人蒸馏水至2/3处，置于比色皿架内，在220nm处以第一个比色皿为参比，调节为100，测量其他各比色皿的透射比，透射比的偏差小于0.5的比色皿可配成一套使用。记录参考格式如下：比色皿配套性检查：（1）,=100，（2）,=,%可以配套使用,2,.,配制标准系列溶液和未知试液,准确移取0.1mg/mL苯甲酸标准溶液 0.00mL、1.00mL、2.00mL、4.00ml、6.00mL、8.00mL、10.00mL于7个洁净的100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，摇匀。得测定用第一至第七份标准系列溶液。,准移取苯甲酸未知液10,.,00mL于洁净的100mL容量瓶中，用水稀释定容，摇匀。得测定用苯甲酸未知试液。,3,.,测绘吸收曲线，选择测定波长,在3只1cm石英比色皿中，分别装蒸馏水、测定用第五份标准系列溶液和测定用苯甲酸未知试液。以蒸馏水为参比，在200,-,350nm间，每隔10nm分别测量一次吸光度值（注意每改变一次波长，都要重新调节仪器零点和参比溶液的=100%）。在峰值附近每隔2nm测量一次。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制吸收曲线，比较吸收曲线的形状，确定测定波长。,任务五 紫外-可见分光光度法测定未知物（技能大赛项目）,一、仪器,1紫外可见分光光度计(UV-1800PC-DS2)；配1cm石英比色皿2个（比色皿可以自带）；,2容量瓶：100mL 15个；,3吸量管：10mL 5支；,4烧杯：100mL 5个；,二、试剂,1标准溶液：任选四种标准试剂溶液（水杨酸、1,10-菲啰啉、磺基水杨酸、苯甲酸、维生素C、山梨酸、硝酸盐氮、糖精钠）,2未知液：四种标准溶液中的任何一种。,三、实验操作,1,.,吸收池配套性检查,石英吸收池在,220nm,装蒸馏水，以一个吸收池为参比，调节为,100%,，测定其余吸收池的透射比，其偏差应小于,0.5%,，可配成一套使用，记录其余比色皿的吸光度值作为校正值。,2,.,未知物的定性分析,将四种标准试剂溶液和未知液配制成约为一定浓度的溶液。以蒸馏水为参比，于波长,200350nm,范围内测定溶液吸光度，并作吸收曲线。根据吸收曲线的形状确定未知物，并从曲线上确定最大吸收波长作为定量测定时的测量波长。,190210nm,处的波长不能选择为最大吸收波长。,3,.,标准工作曲线绘制,分别准确移取一定体积的标准溶液于所选用的100 mL容量瓶中，以蒸馏水稀释至刻线，摇匀。（绘制标准曲线必须是七个点，七个点分布要合理）。根据未知液吸收曲线上最大吸收波长，以蒸馏水为参比，测定吸光度。然后以浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标绘制标准工作曲线。,4,.,未知物的定量分析,确定未知液的稀释倍数，并配制待测溶液于所选用的100 mL容量瓶中，以蒸馏水稀释至刻线，摇匀。根据未知液吸收曲线上最大吸收波长，以蒸馏水为参比，测定吸光度。根据待测溶液的吸光度，确定未知样品的浓度。未知样平行测定3次。,