二价铁对厌氧氨氧化的正向调控机理研究.pdf

厌氧氨氧化（anammox）是厌氧条件下厌氧氨氧化菌（AnAOB）以亚氮（NO2-N）为电子受体，将氨氮（NH4+-N）直接氧化为氮气的生物转化过程1.与传统硝化-反硝化工艺相比，anammox 工艺具有节省曝气、二价铁对厌氧氨氧化的正向调控机理研究张佳莉1，王思宇2，李海波1，郭建博1（1.天津城建大学 环境与市政工程学院，天津 300384；2.中国环境科学研究院 流域水环境污染综合治理研究中心，北京 100012）摘要：通过探讨不同浓度 Fe2+的电子穿梭作用对厌氧氨氧化体系氮转化速率的影响规律，解析了该过程厌氧氨氧化代谢产物的分泌特性，并利用电化学特征分析和电子传递活性实验，揭示了 Fe2+电子穿梭效应强化厌氧氨氧化脱氮的作用机制.结果表明：2 mg/L 的 Fe2+使 NH4+-N 和 NO2-N 的转化量分别增加 51.07%和34.13%，并促进胞外聚合物（EPS）的分泌，使蛋白（PN）和多糖（PS）分泌量从 9.76、10.16 mg/gVSS 提升至11.55、13.57 mg/g VSS，而 PN/PS 从 0.96 降至 0.85，表明 Fe2+有助于增强颗粒污泥的疏水性和稳定性.塔菲尔（Tafel）、循环伏安（CV）、脉冲循环伏安（DPV）曲线分析表明，Fe2+可增强反应体系的交换电流密度和电容，促进核黄素、细胞色素 c 结合物等电活性物质的分泌，以加速电子转移.此外，厌氧氨氧化体系电子传递活性（ETSA）提升了 1.25 倍，三磷酸腺苷（ATP）分泌量增加了 2.35 倍，表明 Fe2+对微生物呼吸代谢和细胞活性具有正向调控作用.本研究阐明了 Fe2+对厌氧氨氧化体系 EPS 分泌、电子传递及细胞代谢活性的影响机制，为工程中采用 Fe2+强化厌氧氨氧化过程提供了理论支持.关键词：厌氧氨氧化；二价铁；代谢产物；电子传递；细胞活性中图分类号：X703文献标志码：A文章编号：2095-719X（2023）04-0262-06Study on Positive Regulation Mechanism of Iron Bivalent on AnammoxZHANG Jiali1,WANG Siyu2,LI Haibo1,GUO Jianbo1（1.School of Environmental and Municipal Engineering,TCU,Tianjin 300384,China;2.Research Center forIntegrated Management of Watershed Environmental Pollution，Chinese Research Academy ofEnvironmental Sciences,Beijing 100012,China）Abstract：A study was used to explore the effect of Fe2+on nitrogen conversion rate,metabolite secretion characteristics,electrochemical characteristics and electron transport system activity in anaerobic ammonia oxidation(ANAMMOX).Theresultsshowed that the NH4+-N and NO2-N conversion was increased by 51.07%and 34.13%respectively,and the secretion of ex鄄tracellular polymers was also promoted by 2 mg/L Fe2+.The content of protein(PN)and polysaccharide(PS)were increased from9.76 and 10.16 mg/g VSS to 11.55 and 13.57 mg/gVSS respectively,while the PN/PS was decreased from 0.96 to 0.85,indicat鄄ing the hydrophobicity and stability of granular sludge was enhanced by Fe2+.In addition,the curve analysis of Tafel,CV andDPV suggested that exchange current density and capacitance of the system were enhanced,and riboflavin and cytochrome Cbinding were secreted much more by Fe2+stimulated,thus accelerating electron transfer.Moreover,the electron transport sys鄄tem activity(ETSA)of anammox was increased by 1.25 times,and adenosine triphosphate(ATP)was secreted as much as 2.35times,indicating positive regulation of Fe2+on microbial respiratory metabolism and cellular activity.This study clarified theinfluence mechanism of Fe2+on EPS secretion,electron transport and cell metabolic activity of anammox,and also providedtheoretical support for the application of Fe2+for anammox strengthening in the engineering projects.Key words：anammox;ferreous ion;metabolite;electron transfer;cell metabolic activity收稿日期：2021-08-18；修订日期：2021-12-14基金项目：天津市自然科学基金青年基金项目（19JCQNJC07600）；天津市科技计划项目（20YDTPJC00480）作者简介：张佳莉（1997），女，宁夏中卫人，天津城建大学硕士生.通讯作者：王思宇（1985），女，工程师，硕士，从事水污染治理研究.Email：DOI：10.19479/j.2095-719x.2304262天津城建大学学报允燥怎则灶葬造 o枣 栽蚤葬灶躁蚤灶 Chengjian 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠第 29 卷第 4 期圆园23 年 8 月Vol.29No.4Aug.20232023 年 8 月无需外加有机物且污泥产量低等优点2-4.在处理高氨氮或低 C/N 废水时具有明显优势，是一种极具发展前景的生物脱氮工艺.然而，厌氧氨氧化菌生长缓慢，反应速率低，从而限制了该工艺的实际工程应用.铁作为生物系统中最丰富的过渡金属，是微生物所需的重要微量元素之一，微量铁能够提高微生物对氮的转化与利用5.外源投加 Fe2+可加速厌氧氨氧化反应器的快速启动，改善反应器的脱氮性能，Fe2+在 15 mg/L 时均能提高厌氧氨氧化脱氮效果6.同时，Fe2+能促进微生物代谢过程中胞外聚合物（EPS）的分泌，其主要成分蛋白（PN）和多糖（PS）有助于形成稳定性、沉降性良好的颗粒污泥，并以聚合物电解质或导电聚合物（通过共轭双键的 仔 电子）的形式表现出半导电特性7-8，但是 Fe2+对厌氧氨氧化过程中颗粒污泥的稳定性及电子转移速率的影响尚不得而知.此外，有研究表明，0.09 mM 的 Fe2+能够促进厌氧氨氧化菌对铁的积累和血红素 c 的合成，使其含量分别增加 2.00 和2.10 倍，而电子传递体血红素 c 作为联氨脱氢酶，联氨合成酶、羟胺氧化还原酶、以及亚硝酸盐还原酶等酶的重要辅因子，对厌氧氨氧化菌的生长和增殖过程具有重要作用9.因此，推测厌氧氨氧化体系还原态 Fe2+和氧化态 Fe3+之间的转化对电子转移速率及电活性物质的分泌存在一定的影响.此外，铁元素也可影响厌氧氨氧化菌的代谢，有学者发现厌氧氨氧化菌体内含有铁储存颗粒10.Liu 等11证实添加微量 Fe2+可改善细菌生长速率，显著提高厌氧氨氧菌的活性.Fe2+的添加使厌氧氨氧化菌的相对丰度从 7.99%增加至 11.30%12.而厌氧氨氧化菌相对丰度的增加与微生物呼吸代谢和细胞活性的增强密不可分，这可能对电子传递活性（ETSA）及三磷酸腺苷（ATP）的分泌存在一定的调节作用.近年来，Fe2+对厌氧氨氧化的影响研究较为广泛，但其微观影响机制尚未阐明，如 Fe2+对厌氧氨氧化菌胞外分泌物的规律、电子传递特性及细胞代谢活性的影响机制鲜有报道，而 Fe2+对厌氧氨氧化的微观作用机制是 Fe2+强化厌氧氨氧化工艺工程应用的理论基础，该微观机制仍需深层次系统研究.因此，本研究采用批次实验，考察 Fe2+对厌氧氨氧化体系的影响及促进机制，具体如下：淤不同浓度 Fe2+对厌氧氨氧化过程中氮转化及代谢产物的影响规律；于通过电化学分析，探究 Fe2+的氧化还原特性对厌氧氨氧化体系电子转移及电活性物质分泌的潜在调控机理；盂厌氧氨氧化体系细胞代谢活性对 Fe2+的响应机制.本实验通过研究Fe2+对厌氧氨氧化过程的促进机制，以期为 Fe2+强化厌氧氨氧化工艺提供理论支持.1材料与方法1.1实验装置及接种污泥批次实验采用 4 个 250 mL 血清瓶作为实验装置，编号为 CK、B0、B1、B2，其中 CK 为化学对照组，B0为生物对照组，B1、B2 为实验组.实验组进水添加 Fe2+浓度分别为 2、8 mg/L，以氯化铁形式提供.单个血清瓶填装厌氧氨氧化活性污泥 20 mL 和不同 Fe2+浓度的液体培养基 150 mL.厌氧氨氧化活性污泥取自本实验室培养 3 年的成熟厌氧氨氧化颗粒污泥（颗粒粒径在 0.55.0 mm，混合液挥发性悬浮固体（VSS）为 12.5 g VSS/L），用液体培养基冲洗 3 遍以保证进水基质浓度基本一致.1.2实验配水液体培养基成分含量为（g/L）：0.434 NH4Cl，0.736NaNO2，0.285 NaHCO3，0.03 KH2PO4，0.10 CaCl2，0.10MgSO4和 0.5 mL/L 微量元素.其中，微量元素的组成成分（g/L）为：1.98MnCl2 4H2O，0.86ZnSO4 7H2O，0.50CuSO45H2O，0.48 CoCl2 6H2O，0.38 NiCl2 6H2O 和 0.028 H3BO3.以上所用药品均为分析纯.1.3实验条件模拟废水 pH 值调至 7.5 依 0.2，曝高纯（99.5%）氮气 30 min 以除去溶解氧，用锡纸包裹血清瓶以避光，最后将血清瓶放入恒温摇床，温度设置为 35益，转速为 140 r/min.初始 NH4+-N、NO2-N 浓度分别为113、150 mg/L，隔 2 h 取样，测定 NH4+-N、NO2-N 浓度.1.4分析项目与检测方法采集的水样经 0.45 滋m 玻璃纤维膜过滤后进行分析.亚硝酸盐（NO2-N）采用 N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法测定，氨氮（NH4+-N）采用纳氏试剂光度法进行测定.EPS 采用 80 益加热法提取13，分别用 Bradford法和蒽酮-硫酸法测定 EPS 中 PN 和 PS 含量.混合液挥发性悬浮固体浓度（MLVSS）采用马弗炉灼烧质量法测定.循环伏安曲线（CV）、塔菲尔曲线（Tafel）和脉冲循环伏安曲线（DPV）测试均采用电化学工作站（CHI660D），采用三电极室，分别以玻碳电极、铂丝电极和Ag/AgCl 电极作为工作电极、对电极和参比电极.本研究所有电势均相对参比电极而言.ETSA 一般可用来表征微生物呼吸代谢强度，采用紫外分光光度法进行测定14.ATP 水平可表征颗粒污泥和生物膜系统中微生物的活性，其含量测定采用高效液相分光光度法（HPLC，LC-1260，Agilent，USA）15.张佳莉等：二价铁对厌氧氨氧化的正向调控机理研究263天津城建大学学报第 29 卷第 4 期2结果与讨论2.1Fe2+对厌氧氨氧化体系中氮转化速率的影响Fe2+浓度分别为 0，2，8 mg/L 时厌氧氨氧化过程中NO2-N、NH4+-N 的去除效果如图 1 所示.与生物对照组相比，2，8 mg/L 的 Fe2+均增强了厌氧氨氧化的脱氮性能，2 mg/L 的 Fe2+对脱氮效果的促进作用优于 8 mg/L的 Fe2+.其中，添加 2 mg/L Fe2+时，NO2-N 和 NH4+-N 的去除速率分别为 5.41 和 4.42 mg/（L h）.因此，后续实验均采用 2 mg/L 的 Fe2+作为实验组，不添加 Fe2+的生物组作为对照组，研究 Fe2+对厌氧氨氧化代谢产物、电子传递以及细胞代谢活性的调控机制.2.2Fe2+对厌氧氨氧化代谢产物的调控作用EPS 中 PN 和 PS 占有机物总量的 70%80%左右，PN 和 PS 主要影响颗粒污泥的疏水性，决定颗粒污泥的聚集活性，且 PN/PS 能反映微生物的沉降特性16-18.因此，通过检测 EPS 中 PN 和 PS 的变化，阐释厌氧氨氧化 EPS 对 Fe2+的响应规律.与对照组相比，实验组中PN、PS 的含量分别从 9.76，10.16 mg/g VSS 增至11.55，13.57 mg/g VSS，而 PN/PS 从 0.96 降低至 0.85，如图 2所示.结果证明，Fe2+促进了 PN 和 PS 的分泌，增强了厌氧氨氧化颗粒污泥的疏水性，从而强化了微生物的聚集性和颗粒污泥的稳定性.同时，PN/PS 比值越低，颗粒污泥的强度越高，沉降性能越好19-20，由此得出Fe2+可正向调控厌氧氨氧化颗粒污泥的强度和沉降性能.这与本实验结果 Fe2+可促进厌氧氨氧化 EPS 的分泌，以加速氮的转化是一致的.EPS 中的一些物质具有电化学活性，可充当电子穿梭体调控电子的传递，其中 PN 和 PS 就属于电化学活性物质，可加速氧化还原过程中的电子传递21.因此，本研究仍需进一步探讨厌氧氨氧化体系电子传递对Fe2+的响应机制.2.3Fe2+介导下 EPS 电化学特性分析通过测试厌氧氨氧化 EPS 的 CV、Tafel、DPV 曲线，探究 PN 和 PS 分泌量的增加对厌氧氨氧化体系中电子转移速率和电活性物质分泌的影响规律.厌氧氨氧化 EPS 的 CV 曲线如图 3a 如所示，当电压范围为-1.51.5 V 时，对照组和实验组的电容分别为 422.23和464.23 滋F，实验组电容比对照组增加了 42.00 滋F.由于电容越大，电荷越多，电子传递速率越快，说明 Fe2+可激发厌氧氨氧化体系中电子的产生，还原态 Fe2+和氧化态 Fe3+之间的转化可直接参与厌氧氨氧化生化代谢过程中的电子转移，并增强脱氮性能.通过测试厌氧氨氧化体系中 EPS 的 Tafel 曲线，进一步探究 Fe2+对厌氧氨氧化电子转移速率的影响，并利用 Tafel 曲线外推法计算交换电流密度，以反映电极氧还原反应速率和动力学活性，如图 3b 所示.对照组和实验组的开路电压分别为 0.278 V 和 0.324 V，交换电流密度分别为 3.59 和 6.09（伊10-7A/cm2），实验组交换电流密度明显大于对照组.交换电流密度强度越大，反应过程的反应阻力越小，电子传递速率越快，反应所需活化能越小22.结果说明 Fe2+可减轻厌氧氨氧化体系的反应阻力，加快电子转移速率，降低反应所需活化能.DPV 源于细胞内的电化学活性物质，较 CV、Tafel测试曲线在研究电子传递方面有更高的灵敏度.本文通过测试厌氧氨氧化 EPS 的 DPV 曲线，探究微生物图 1Fe2+对氨氧化过程中氮污染物降解的影响（b）NH4+-N 浓度变化160140120100806040200240时间/h81216204（a）NO2-N 浓度变化16014012010080604020024081216204时间/hCKBK2 mg/L8 mg/LCKBK2 mg/L8 mg/L图 2厌氧氨氧化分泌 EPS 中 PN、PS 及 PN/PS 的变化403020100FeBK1.20.80.40.0PSPNPN/PS2642023 年 8 月体内氧化还原活性物质的变化.如图 3c 所示：实验组在氧化峰-544 mV 和-216 mV 处电流增大；还原峰在-588 mV 处电流增大，电流越大，生物体系中对应物质分泌量越多.氧化峰为-544 mV 和还原峰为-588 mV的物质均是核黄素23.核黄素既是微生物分泌的内源性电子穿梭体，也是微生物合成电子传递体如黄素单核苷酸（FMN）和腺嘌呤黄素（FAD）等的前驱体，核黄素、FMN 和 FAD 均能调控污染物生物转化过程中的电子传递24-25.实验结果表明，Fe2+可促进厌氧氨氧化体系中核黄素的分泌，以加速 FMN 和 FAD 的合成，提高该反应的电子转移速率.氧化峰为-216 mV 处的物质可能是外膜核黄素与细胞色素 c 的结合物，它能够调节胞外电子传递和胞内代谢活性之间的电子交换.该处电流的增大进一步表明 Fe2+可促进厌氧氨氧化体系中胞外与胞内的电子交换，加快电子转移.DPV 曲线分析表明，Fe2+能够正向调控厌氧氨氧化 EPS 中电活性物质的分泌，提高电子转移速率.综上，电化学测试结果表明，Fe2+可降低电子传递阻力，促进电化学活性物质的分泌等方式，以加速厌氧氨氧化过程中的电子转移，实现高效脱氮.而电子传递速率与微生物的代谢活性呈正相关，故推测 Fe2+能够增强微生物的代谢活性，因此，2.4 小节进一步探论 Fe2+对厌氧氨氧化菌细胞代谢活性的调控机理.2.4Fe2+对厌氧氨氧化过程中细胞代谢活性的影响通过测定 ETSA 和 ATP 含量，探究厌氧氨氧化细胞代谢活性对 Fe2+的响应变化，如图 4 所示.从图4a 可知，对照组和实验组的 ETSA 值分别为 6.30，7.85 滋g（mg h）-1，较高的 ETSA 代表呼吸代谢的增强，说明 Fe2+对厌氧氨氧化菌的呼吸代谢具有促进作用.此外，细胞呼吸过程会产生 ATP，ATP 作为细胞合成和基质运输的重要能量载体，其含量可表征颗粒污泥和生物膜系统中微生物的活性，ATP 含量越高，微生物的生理活性越强26.从图 4b 可知，对照组和实验组的 ATP 含量分别为 1.12，2.63 mg/g VSS，实验组的ATP 含量是对照组的 2.35 倍，表明 Fe2+对厌氧氨氧化菌生理活性的增强具有积极作用.综上，ETSA 和 ATP 的测定结果表明，Fe2+能够正向调控厌氧氨氧化菌的呼吸代谢强度和活性，进而为电子传递提供能量，实现氮的快速转化.2.5Fe2+介导厌氧氨氧化过程潜在机理分析基于上述实验结果，推测 Fe2+对厌氧氨氧化的促（c）DPV 曲线403020100-10-20-30-401.2-1.2-0.40.00.8-0.8电压/V0.4BKFe（b）Tafel 曲线-2-4-6-8-101.2-0.80.00.4-0.4电压/V0.8BKFe（a）CV 曲线12080400-40-80-120-1.51.50.50.0-1.01.0电压/V-0.5BKFe图 3厌氧氨氧化 EPS 对 Fe2+的电化学响应变化（a）Fe2+对 ETSA 的影响1086420FeBK（b）Fe2+对 ATP 的影响3210FeBK图 4厌氧氨氧化细胞代谢活性对 Fe2+的响应变化张佳莉等：二价铁对厌氧氨氧化的正向调控机理研究265天津城建大学学报第 29 卷第 4 期进机制主要源于电子转移速率和能量水平的提高.Fe2+介导厌氧氨氧化过程潜在机理如图 5 所示，从NADH 产生的电子需经过核黄素、FMN、FAD 及细胞色素 c 等电活性物质转移到终端电子受体.在 Fe2+的刺激下，FMN、FAD 及细胞色素 c 结合物含量增加，以加速电子的转移.此外，Fe2+可促进厌氧氨氧化体系中微生物的呼吸代谢，为其它化合物的合成提供原料，并为微生物的生命活动提供能量.此外，ATP 作为呼吸过程中产生的能量载体，其分泌量的增加进一步证实了呼吸代谢以及厌氧氨氧化菌活性的增强，以促进 EPS 的合成和分泌.而 EPS 分泌量的增加导致PN 和 PS 含量的上调及 PN/PS 的减少，促使污泥聚集并形成疏水性和稳定性良好的颗粒污泥，以加速氮的转化.图 5Fe2+对厌氧氨氧化的促进机制NH4+NO2-膜外复合体玉复合体域膜内ADPATPNADH+H+NAD+NO2-琥珀酸延胡索酸FMNFADFe-SFe-SCoQNO3-NARNONiRCythNH4+N2N2H4HZSHZO0.5O2+H+H2O复合体芋CytcEPS 分泌增多Fe（域）stimulatedN2EPS厌氧氨氧化体膜3结论（1）厌氧氨氧化体系中外源 Fe2+的投加对 EPS中PN、PS 的分泌具有促进作用，有助于形成疏水性和稳定性良好的颗粒污泥，实现高效脱氮.（2）通过对 Tafel、CV 和 DPV 曲线的分析，表明Fe2+介导的氧化还原特性对厌氧氨氧化体系电子的产生、传递以及电活性物质的分泌具有积极作用，以实现氮的快速转化.（3）ETSA 和 ATP 含量的测定结果表明，外源 Fe2+的投加有助于厌氧氨氧化体系电子传递活性的增强，且正向调控厌氧氨氧化菌的细胞代谢活性.参考文献：1ZHANG L，OKABE S.Ecological niche differentiation amonganammox bacteriaJ.Water Research，2020，171（115468）：1-14.2OSHIKI M，SATOH H，OKABE S.Ecology and physiology ofanaerobic ammonium oxidizing bacteria J.Environmental Mi-crobiology，2016，18（9）：2784-2796.3SUN Y，GUAN Y，ZENG D，et al.Metagenomics-based in-terpretation of AHLs-mediated quorum sensing in Anammoxbiofilm reactors for low-strength wastewater treatmentJ.Che-mical Engineering Journal，2018，344：42-52.4ZHANG C，LI L，WANG Y，et al.Enhancement of theANAMMOX bacteria activity and granule stability throughpulsed electric field at a lower temperature（16依1毅C）J.Biore-source Technology，2019，292（121960）：1-8.5JEFFERSON B，BURGESS J E，PICHON A，et al.Nutrientaddition to enhance biological 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