高原低氧环境下小鼠肺组织细胞自噬及凋亡情况观察.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 23 期高原低氧环境下小鼠肺组织细胞自噬及凋亡情况观察王昱欢1，马晓峰2，陈颖2，永胜1，杨惠11 青海大学医学院，西宁810016；2 青海省心脑血管病专科医院心血管病一科摘要：目的探讨高海拔低氧诱导对C57BL/6小鼠肺组织细胞自噬及凋亡的影响。方法选取8周龄C57BL/6小鼠30只，分别饲养于西安市雁塔区（对照组）及青海省果洛藏族自治州（高原低氧组），连续饲养21 d后处死并采集肺脏组织。透射电镜下观察肺组织显微结构，记录自噬体数量；免疫组化法检测肺组织自噬相关因子Beclin-1、LC3B、p62以及凋亡相关因子Bax、Bcl-2阳性信号表达情况，Western blotting法及实时荧光定量PCR法检测Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白及mRNA表达。结果高原低氧组与对照组自噬体数量分别为（4.80 0.84）、（1.80 0.45）个，两组比较P0.05。与对照组比较，高原低氧组肺组织Beclin-1、Bcl-2蛋白阳性信号表达增强，p62、Bax蛋白阳性信号表达减弱（P均0.05）。与对照组比较，高原低氧组肺组织Beclin-1蛋白相对表达量及LC3B/、Bcl-2/Bax均升高，p62蛋白相对表达量降低（P均0.05）。与对照组比较，高原低氧组肺组织Beclin-1、LC3B mRNA相对表达量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA均升高，p62 mRNA相对表达量降低（P均0.05）。结论高原低氧环境下的小鼠肺组织自噬及抗凋亡能力均存在一定程度的增强。关键词：高原环境；低氧环境；细胞自噬；细胞凋亡；肺损伤doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.23.009 中图分类号：R392.12 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）23-0039-04Autophagy and apoptosis of lung tissues in mice under high altitude hypoxia environmentWANG Yuhuan1，MA Xiaofeng，CHEN Ying，YONG Sheng，YANG Hui1 Medical College of Qinghai University，Xining 810016，ChinaAbstract：Objective To investigate the effects of high altitude hypoxia on autophagy and apoptosis in lung tissues of C57BL/6 mice.Methods Thirty 8-week-old C57BL/6 mice were selected and housed in Yanta District，Xian City（control group）and Goluo Tibetan Autonomous Prefecture，Qinghai Province（plateau hypoxia group），respectively，and they were executed and their lung tissues were collected after 21 d of continuous feeding.The microstructure of lung tissue was observed under transmission electron microscopy and the number of autophagosomes was recorded；the expression levels of autophagy and apoptosis factors Beclin-1，LC3B，p62，Bax and Bcl-2 positive signals in the lung tissues were detected by immunohistochemistry，and Beclin-1，LC3B，p62，Bax and Bcl-2 protein and mRNA expression levels were detected by Western blotting and real-time fluorescence quantitative PCR.Results The number of autophagosomes in the plateau hypoxia group and the control group were 4.800.84 and 1.800.45，respectively，with statistically significant difference between the two groups（P0.05）.Compared with the control group，the expression of Beclin-1 and Bcl-2 protein positive signals in the lung tissues of the plateau hypoxia group was enhanced，and the expression of p62 and Bax positive signals was diminished（both P0.05）.Compared with the control group，the relative expression of Beclin-1 protein，LC3B/and Bcl-2/Bax increased and the relative expression of p62 protein decreased in the plateau hypoxia group（all P0.05）.Compared with the control group，the relative expression of Beclin-1，LC3B and Bcl-2/Bax mRNA in the lung tissue of the plateau hypoxia group increased，and the relative expression of p62 mRNA decreased（both P0.05）.Conclusions Autophagy and anti-apoptotic capacity of mouse lung tissues were enhanced to a certain extent in the high altitude hypoxic environment.Key words：high altitude；hypoxia；autophagy；apoptosis；lung injury 基础研究 基金项目：国家自然科学基金资助项目（82060295）；青海大学医学院中青年科研基金项目（2020-kyy-7）。通信作者：杨惠（E-mail：yanghui_）开放科学（资源服务）标识码（OSID）39山东医药2023 年第 63 卷第 23 期青藏高原是世界上面积最大的高原，平均海拔高度约 4 900 m，长期居住人口为 6 000 万8 000万1。随着时代发展，由工作、旅游等原因前往高原短期居住的人口逐年增多，可能表现出高原不适应症2。短期旅居者在海拔2 5003 000 m即可发生身体不适，如持续运动或继续登高，则进一步引发肺组织及脑组织损伤3。高海拔低氧环境可诱发肺部损伤，与通气/血流比例失调、化学感受器变化、水通道及蛋白变化、遗传基因易感性等直接相关4。从组织细胞的角度考虑，上述因素直接影响了肺组织的平衡稳态，严重者甚至会引起肺组织细胞死亡5。当细胞受到缺氧刺激时，肺组织细胞的保护性程序被启动，主要包括细胞自噬及细胞凋亡，通过细胞自噬可加快细胞代谢循环、协助细胞适应环境以促进细胞存活，而通过细胞凋亡能及时主动清除机体衰老及异常的细胞，从而维持内环境的相对稳态5-6。尽管细胞自噬与凋亡在代谢途径和形态学方面有着显著区别，但二者之间存在着多层次、多元化的联系，如自噬相关蛋白Beclin-1可与抗凋亡蛋白Bcl-2结合，直接调控细胞凋亡7。此外，自噬相关基因Atg-5、Atg-11 诱导细胞凋亡的作用可被凋亡因子Bax所抑制7。2021年 11月2023年 1月，本研究以渭河平原和青藏高原饲养的 C57BL/6小鼠为研究对象，探讨高原低氧环境下小鼠肺组织细胞的自噬及凋亡情况，为后续高原低氧暴露诱发肺脏疾病分子机制的相关研究提供理论基础。1 材料与方法 1.1材料实验动物：C57BL/6小鼠30只，8周龄，体质量2224 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。主要试剂：鼠SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，苏木素、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，全蛋白提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，BCA试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；自噬相关因子Beclin-1、LC3B、p62以及凋亡相关因子Bax、Bcl-2 兔抗鼠多克隆抗体均购自美国 Cell Signaling Technology 公司，一抗稀释液、二抗稀释液、ECL发光显色试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司。1.2动物分组及饲养环境干预方法将 30 只C57BL/6小鼠随机分为高原低氧组、对照组，每组15只。高原低氧组饲养于青海省果洛藏族自治州玛多县人民医院（平均海拔约4 226 m），对照组饲养于西安市雁塔区西安交通大学实验动物中心（平均海拔约419 m）。小鼠饲料均为普通标准维持型饲料，饲养温度2628，相对湿度40%60%；给予充足的水和鼠粮供小鼠自由采食、饮水，连续饲养21 d。淘汰咬伤、采食不正常小鼠，每组各取10只采用脊椎脱臼法处死，并迅速采集肺脏组织。1.3肺组织自噬体数量观察使用生理盐水冲洗两组小鼠肺组织，在预冷操作台上，用手术刀片切成长、宽、高约为1 mm的组织块；2.5%戊二醛液固定24 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，1%锇酸固定12 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次；梯度浓度乙醇、丙酮脱水，618环氧树脂浸透包埋，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅染色。采用透射电子显微镜观察肺组织，每个样本随机选取5个视野，计算每个视野的自噬体数量，取平均值。1.4肺组织Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白检测采用免疫组化法：取两组小鼠肺组织，10%甲醛溶液固定 48 h，自来水过夜冲洗；脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化，微波抗原修复并冷却至室温，3%过氧化氢室温避光孵育15 min，山羊血清室温孵育 15 min；以兔抗鼠 Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2多克隆抗体为一抗，4 孵育过夜，以健康C57BL/6 小鼠血清为一抗空白对照，37 复温45 min；加入生物素标记的山羊抗兔二抗，室温孵育15 min，加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，室温孵育15 min；DAB显色，苏木素复染，脱水，中性树胶封片，烤片，光学显微镜镜检。每个样品选取5张切片，每张免疫组化切片中随机选取 5 个视野（200），以细胞膜、细胞质及细胞核染成棕黄色定义为阳性。使用Image-Pro Plus6.0软件分析积分光密度值（IOD）并计算面积（Area），以IOD/Area表示阳性信号表达情况。采用Westen blotting法：取两组小鼠肺组织，按照全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白中加入上样缓冲液变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白。将蛋白质转移到PVDF滤膜上封闭，PVDF滤膜浸泡在10%TBST溶液中，置于摇床上洗膜10 min5次。分别加入兔抗鼠 Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2 及内参-actin 一抗（1 2 000），4 孵育过夜；10%TBST冲洗10 min5 次，加入 HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗（1 4 000），室温孵育 90 min。10%TBST冲洗10 min5次，加入ECL显色液。凝胶成像分析系统拍照，Image-Pro Plus6.0软件分析条带灰度值，计算 Beclin-1、p62 蛋白相对表达量及 LC3B/、Bcl-2/Bax。1.5肺组织 Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2 mRNA40山东医药2023 年第 63 卷第 23 期检测采用实时荧光定量PCR法。取两组小鼠肺组织，参照 TRIzol试剂盒说明书提取总 RNA，采用核酸蛋白分析仪测定 RNA纯度，利用逆转录试剂盒合成 cDNA。参照 SYBR Green 试剂盒说明书进行PCR检测。以 2Ct 法计算目的基因相对表达量，计算Bax mRNA/Bcl-2 mRNA。1.6统计学方法采用SPSS18.0统计软件。计量资料采用S-W正态性检验，符合正态分布以-x s表示，组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1两组肺组织自噬体数量比较高原低氧组与对照组自噬体数量分别为（4.80 0.84）、（1.80 0.45）个，两组比较P0.05。见OSID码图1。2.2两组肺组织Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白阳性信号表达情况比较与对照组比较，高原低氧组肺组织Beclin-1、Bcl-2蛋白阳性信号表达增强，p62、Bax阳性信号表达减弱（P均0.05）。见表1及OSID码图2。2.3两组肺组织 Beclin-1、p62蛋白相对表达量及LC3B/、Bcl-2/Bax比较见表2及OSID码图3。2.4两组肺组织Beclin-1、LC3B、p62 mRNA相对表达量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比较见表3。3 讨论 高海拔低氧暴露会导致外界氧气运输到细胞线粒体的氧分压下降，体内血氧饱和度降低，从而引起机体一系列应激反应，甚至可能形成不可逆的脏器损伤，因此缺氧是目前高海拔地区最关注的医疗问题之一3。其中，低氧引发的肺损伤是高原疾病中最为普遍的类型之一4。因此，进一步研究高原肺损伤的分子机制有助于进行针对性的预防和治疗。截至目前，探讨高原低氧环境下肺组织细胞自噬及凋亡的研究有很多，主要以体外培养细胞和高压氧舱培养动物模型的方式进行研究，针对实验动物进行真实环境的高海拔低氧环境培养的相关文献较少。本研究以渭河平原以及青藏高原饲养的C57BL/6小鼠为研究对象，通过透射电镜观察肺组织自噬体数量，免疫组化法、Western blotting 法及PCR法检测自噬及凋亡相关因子表达；结果显示，高原缺氧环境下的 C57BL/6小鼠肺组织细胞自噬及抗凋亡能力均存在一定程度的增强。凋亡与自噬存在着错综复杂的关系，细胞凋亡过程中通常伴随着细胞自噬，甚至自噬可通过负调控凋亡对细胞起到保护作用7-8。自噬可通过降解蛋白质、受损细胞器来保护细胞免受凋亡，然而过度自噬则会引起凋亡或自噬性死亡7，9。在缺氧条件的诱导下，细胞自噬被激活，将细胞质中的蛋白质、RNA、糖原、破损细胞器等大量降解，实现物质循环利用，维持细胞稳态，以保证细胞本身的代谢需要和细胞器的更新需求8。同时，受缺氧程度及个体缺氧耐受能力的影响，为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡产生应答，即细胞凋亡或坏死9。Beclin-1 磷酸化后作为 PI3K 复合物的整体支架，可促进自噬蛋白定位到自噬泡，其增多表示自噬增强。LC3B参与自噬体膜的形成，是自噬标记物。p62 是自噬体与底物之间的适配蛋白，可调节细胞自噬过程。在自噬过程中，LC3B升高的同时p62降低，这表明自噬流通畅、自噬增强。Bcl-2与 Bax表1两组肺组织Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白阳性信号表达情况比较（-x s）组别高原低氧组对照组n1010Beclin-10.71 0.01*0.42 0.02LC3B0.37 0.020.37 0.09p620.21 0.03*0.57 0.03Bax0.34 0.04*0.76 0.08Bcl-20.57 0.06*0.19 0.01注：与对照组比较，*P0.05。表2两组肺组织Beclin-1、p62蛋白相对表达量及LC3B/、Bcl-2/Bax比较（-x s）组别高原低氧组对照组n1010Beclin-10.72 0.04*0.40 0.02p620.41 0.05*0.66 0.04LC3B/0.57 0.05*0.37 0.05Bcl-2/Bax1.18 0.14*0.44 0.07注：与对照组比较，*P0.05。表3两组肺组织Beclin-1、LC3B、p62 mRNA相对表达量及Bax-2 mRNA/Bax mRNA比较（-x s）组别高原低氧组对照组n1010Beclin-1 mRNA0.72 0.09*0.29 0.05LC3B mRNA0.86 0.12*0.32 0.08p62 mRNA0.27 0.08*0.87 0.05Bcl-2 mRNA/Bax mRNA0.59 0.04*0.21 0.05注：与对照组比较，*P0.05。41山东医药2023 年第 63 卷第 23 期共属一个家族，通过控制线粒体膜的通透性来调节凋亡激活物。Bax 二聚体增加膜通透性，Bcl-2 与Bax形成的异聚体降低膜通透性。Bcl-2升高和Bax降低表明细胞对凋亡的抵抗性增强，Bcl-2/Bax越大表明抗凋亡能力及细胞自噬越强。本研究透射电镜观察结果显示，高原低氧组肺组织平均每视野下自噬体数量较对照组明显增多，肺组织自噬因子LC3B/、Beclin-1表达增加，并且抗凋亡调控相关蛋白Bcl-2/Bax升高。由此结果推测，受高原缺氧刺激的影响，小鼠肺组织细胞为维持内环境稳定，细胞自噬被激活，细胞质中的蛋白质、RNA、糖原、破损细胞器等大量降解，以保证细胞本身的代谢需要和细胞器更新需求。此外，为了维持正常的生长发育及内外环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的抗凋亡程序产生应答。研究表明，自噬与凋亡之间有着许多共同的信号转导途径，其中一种途径为低氧激活缺氧诱导因子1触发BNIP3，BNIP3破坏Bcl-2/Beclin-1复合体，从而释放游离的Beclin-1，形成VPS34/Beclin-1复合体，最终激活自噬和抗凋亡过程9-10。另外一种途径为缺氧应激激活的蛋白激酶C（PKC）激活JNK1，破坏Bcl-2/Beclin-1复合体，最终促进自噬和抗凋亡过程11。此外，缺氧造成的能源消耗促使LKB1、CaMKK、TAK1引起AMP依赖性蛋白激酶（AMPK）磷酸化，进 一 步 引 起 下 游 TSCI/TSC2 磷 酸 化，导 致mTORC1失活，诱导自噬过程12。总之，缺氧状态下的自噬及凋亡调控是一个十分复杂的过程，其调控机制亟待进一步研究探讨。综上所述，高原低氧环境下的小鼠肺组织自噬及抗凋亡能力均存在一定程度的增强。青藏高原特殊的环境因素可能会刺激小鼠产生应激、缺氧等病理生理过程，进而提高其肺组织的自我修复和抗损伤能力。本研究揭示了高原低氧环境对小鼠肺组织自噬及凋亡能力的影响，为高原缺氧环境下的适应性机制研究提供了重要参考依据。本研究的不足之处在于仅采用了小鼠模型进行研究，因此结果未必完全适用于人，且本研究未进一步探究高原低氧环境对生物体其他组织器官的影响。未来可进一步研究高原低氧环境对不同生物的不同组织器官的影响，为开发高原低氧环境下肺损伤的预防和治疗策略提供更多的实验数据与理论支持。参考文献：1SIMANCAS-RACINES D，AREVALO-RODRIGUEZ I，OSORIO D，et al.Interventions for treating 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