水溶性多糖的提取及结构测定实施方案.docx

水溶性多糖的提取及结构测定方案
1多糖的生产及提取
种子液制备。单菌落入50ml（葡萄糖2%，蛋白胨1%，乙酸0.4%，磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.03%，乙醇1.5%，naoh0.25%，115-120℃维持20min。）120r/m48h。将种子液按5%（v/v）转接入100ml上述种子液中，120r/m，4d。
4000r/m去bc，0.22μm膜过滤去细胞或14000r/m，20min去细胞。50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/5。加入无水乙醇，使其浓度为85%。沉淀再经90%乙醇洗涤3次。50℃真空干燥24h。
[1]杜秀菊，徐伟，穆红梅，彭向前，冯玮.桦褐孔菌多糖的药理活性与化学结构研究进展[j].食用菌学报，2012，01：100-104.
[1]林华娟，田晓春，秦小明，路垚，杨基柱.金花茶多糖单一成分的化学结构特征解析[j].食品科学，2013，03：141-146.
2多糖除杂
（sevag法）多糖加入适量蒸馏水溶解，按多糖溶液：氯仿：正丁醇=25：5：1比例加入氯仿及正丁醇，漩涡振荡20-30min，静置分层（或者3400r/m，15min），提取水层多糖液，反复操作3次，获得多糖水溶液，将其稀释至10倍，在紫外-可见分光光度计扫描，直至260-280nm处没有吸收峰为止。（张倩，张民，王超，等.枸杞多糖的分离纯化及结构研究[j].食品与发酵工业，2014，40（12）：41-47.）
[1]李娟.桦褐孔菌子实体和发酵多糖的促生细胞因子作用及化学结构研究[d].浙江理工大学，2013.
3分子量测定
经除杂的多糖水溶液加入无水乙醇，使其浓度为90%，经50℃真空干燥24h，保存备用。称取一定量的多糖，加入蒸馏水溶解，以葡聚糖为标准物质，上gpc进行分子量测定。（[1]罗建光.鲍氏层孔菌菌丝体多糖分离纯化、结构鉴定及其生物活性的研究[d].南京农业大学，2010.）
4多糖组成测定
（1）称取适量多糖于具塞试管中，加入2mol/l三氟乙酸（tfa）4ml，在120℃下水解2h。（2）减压蒸干（低于40℃）。
（3）然后加入3ml甲醇蒸干，重复以上操作4一5次，以完全除去tfa。
[1]姜军.山药多糖的分离纯化及其化学结构的初步研究[d].扬州大学，2007.[1]毛丰玮.亚麻籽壳多糖的提取、分离纯化与结构研究[d].浙江工商大学，2013.
[1]凡军民.毛头鬼伞菌丝体多糖的分离、纯化和化学结构鉴定及生物活性研究[d].南京农业大学，2006.（4）hplc测定色谱条件为：
色谱柱为shodexks804sugar（300mm×7.8mm）柱温40度流动相为水
-1
流速0.8ml·min
检测用410rⅠ示差检测器，数据处理用810gpc软件进行。
同时用鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸8种单糖进行对照，根据峰值确定样品的单糖组成。
（[1]李军.阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究[d].华中农业大学，2004.）
5红外光谱确定多糖结构
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