葛根素通过调控miR-214抑制脊髓损伤后神经元炎症反应及凋亡的实验研究.pdf

收稿日期:2020-12-23;修订日期:2021-03-06作者简介:王光健(1985-),男,重庆籍,主治医师研究方向:骨创伤及基础研究通信作者:王德华电子邮箱:实验研究葛根素通过调控 miR-214 抑制脊髓损伤后神经元炎症反应及凋亡的实验研究王光健,王德华,谭响,谢继勇(重庆市荣昌区人民医院骨科,重庆 402460)摘要:目的 探讨葛根素是否通过介导 miR-214 抑制过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的脊髓神经元炎症反应及凋亡。方法 体外培养大鼠脊髓神经元细胞,以 H2O2刺激构建脊髓神经元损伤模型,实验分为:Con 组、H2O2组、H2O2+Pue 组、H2O2+Pue+anti-miR-NC 组和 H2O2+Pue+anti-miR-214 组。实时荧光定量 PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测各组 miR-214 的表达,CCK-8 法检测细胞活性,DCFH-DA 探针法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,试剂盒检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,酶联免疫吸附测定法分析肿瘤坏死因子-(tumor necrosisfactor-,TNF-)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白印迹法(Western blot)检测裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(Cleaved caspase-3)表达水平。结果 与 Con 组相比,H2O2组细胞活性、SOD 活性和 miR-214 的表达显著降低,细胞内 ROS 水平、TNF-、IL-1 和 IL-6 的含量、凋亡率、Cleaved caspase-3 的表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P0.05);与 H2O2组相比,H2O2+Pue 组细胞活性、SOD 活性和 miR-214 的表达明显升高,细胞内 ROS 水平、TNF-、IL-1 和 IL-6 的含量、凋亡率、Cleaved caspase-3 的表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P0.05);抑制 miR-214 能够逆转葛根素对 H2O2诱导的脊髓神经元细胞的损伤保护作用。结论 葛根素能够通过上调miR-214 的表达抑制 H2O2诱导的脊髓神经元细胞凋亡和炎症反应,对脊髓神经元细胞损伤起保护作用。关键词:葛根素;miR-214;脊髓神经元细胞;凋亡;炎症反应中图分类号:R744 文献标识码:A 文章编号:1005-7234(2023)04-0508-05DOI:10.3969/j.issn.1005-7234.2023.04.002The experimental study of puerarin by regulating miR-214 to inhibit neuronal inflammation and apoptosis after spinalcord injuryWANG Guang-jian,WANG De-hua,TAN Xiang,XIE Ji-yong(Department of Orthopedics,Chongqing Rongchang District Peoples Hospital,Chongqing,402460,China)Abstract:Objective To investigate whether puerarin can inhibit the inflammatory response and apoptosis of spinal cord neuronsinduced by hydrogen peroxide(H2O2)by mediating miR-214.MethodsRat spinal cord neuronal cells were cultured in vitro,andH2O2stimulation was used to construct spinal cord neuronal injury models.The experiment was divided into:Con group,H2O2group,H2O2+Pue group,H2O2+Pue+anti-miR-NC group and H2O2+Pue+anti-miR-214 group.Real-time fluorescent quantitative PCR(RT-qPCR)was used to detect the expression of miR-214 in each group,CCK-8 method to detect cell viability,DCFH-DA probe todetect intracellular reactive oxygen species(ROS)levels,the kit to detect superoxide dismutase(SOD)activity,ELISA to analysetumor necrosis factor-(TNF-),interleukin-1(IL-1)and interleukin-6(IL-6)content,flow cytometry to detect cellapoptosis,and Western blot to detect the expression level of cleaved caspase-3.ResultsCompared with the Con group,the cellactivity,SOD activity and miR-214 expression in the H2O2group were significantly reduced,while the intracellular ROS level,TNF-,IL-1 and IL-6 content,apoptosis rate,cleaved caspase-3 were markedly raised,all with statistically significant difference(P0.05).Compared with the H2O2group,the cell activity,SOD activity and miR-214 expression in the H2O2+Pue group significantly increased,and the intracellular ROS level,TNF-,IL-1 and IL-6 content,apoptosis rate,and cleaved caspase-3 expression levels significantlydecreased,and the difference was statistically significant(P0.05).The inhibition of miR-214 could reverse the protective effect ofpuerarin on H2O2-induced spinal cord neuronal cell damage.Conclusion Puerarin can inhibit H2O2-induced spinal cord neuronalcell apoptosis and inflammation by up-regulating the expression of miR-214,and thereby protecting spinal cord neuronal cell injury.Key words:puerarin;miR-214;spinal cord neuronal cells;apoptosis;inflammatory response805颈腰痛杂志 2023 年第 44 卷第 4 期 The Journal of Cervicodynia and Lumbodynia 2023,Vol.44 No.4 脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种常见的神经系统疾病,具有高发病率和高死亡率1。SCI 特征是神经组织丧失以及随后的感觉和运动功能缺陷,其不仅对患者造成严重的生理和心理损害,而且对社会构成了巨大的经济负担2。与 SCI 相关的主要病理变化包括神经元损伤和凋亡,这些变化不利于受损组织的修复和治疗,并且 SCI 位点受到炎症细胞引起的炎症产生的影响。过度的炎症反应也会加速神经元坏死和轴突脱髓鞘3,4。目前,SCI 的主要治疗方法包括药物治疗、手术治疗和移植治疗,这些治疗旨在减少继发性损伤并促进神经恢复和再生。但是,在临床上,任何 SCI 治疗都无法完全治愈或发挥显著疗效5。因此,寻找新的和有希望的治疗方法是目前急需解决的问题。葛根素是从传统中药葛根中分离的异黄酮类衍生物,对脑缺血的神经具有保护作用。有研究显示,葛根素可促进 SCI 大鼠运动功能恢复和组织修复,其机制可能与其神经保护、抑制胶质细胞活化、抗炎和抗凋亡作用有关6-8。然而,葛根素通过抑制 SCI 后炎症反应和神经元凋亡对 SCI 所起到的保护作用及其机制目前尚不清楚。因此,本实验旨在探究葛根素对 SCI 损伤的保护作用及其作用机制,以期为 SCI 的治疗提供新的实验依据。1 材料与方法1.1 材料大鼠脊髓神经元细胞(中科院上海细胞资源中心);葛根素,纯度 98%(武汉远成共创科技有限公司);DMEM 培养基、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Gibco 公司);miR-214 inhibitors 和 inhibitors control(上海吉玛制药技术有限公司);LipofectamineTM2000脂质体转染试剂(美国 Invitrogeng 公司);RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR 检测试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司);引物(上海生工生物工程有限公司);CCK-8 试剂(日本同仁化学研究所);细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)和白细胞介素-6(in-terleukin-6,IL-6)的酶联免疫吸附测定法检测试剂盒(武汉博士德生物有限公司);Annexin-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(日本 TaKaRa 公司);除抗体外,蛋白印迹法(Western blot)检测所需相关试剂(上海碧云天生物技术研究所);裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(Cleaved caspase-3)单克隆抗体和辣根过氧化酶标记的二抗(美国 Abcam 公司)。1.2 细胞培养和分组处理脊髓神经元细胞以含 10%胎牛血清的 DMEM培养液进行培养,细胞放置在 37、体积分数为 5%CO2、饱和湿度的培养箱中,使用胰蛋白酶进行消化传代,对数期的细胞用于后续实验。将对数期的脊髓神经元随机分为 Con 组、H2O2组、H2O2+Pue 组、H2O2+Pue+anti-miR-NC 组和 H2O2+Pue+anti-miR-214 组。其中,Con 组以不含药物的正常培养基进行培养;H2O2组以 100 Mol/L 的 H2O2孵育 30 min(参考文献9);H2O2+Pue 组以10 Mol/L 葛根素预处理 24 h(参考文献10),再以 100 Mol/L 的 H2O2孵育 30 min;H2O2+Pue+anti-miR-NC 组 以10 Mol/L 葛根素预处理24 h,转染 inhibitors control后,再以100 Mol/L 的 H2O2孵育30 min;H2O2+Pue+anti-miR-214 组以 10 Mol/L 葛根素预处理 24 h,转染 miR-214 inhibitors 后,再以 100 Mol/L 的H2O2孵育 30 min。具体转染步骤严格参照 Lipo-fectamineTM2000 转染试剂使用说明书进行操作。1.3 RT-qPCR 技术各组脊髓神经元细胞分组处理后,采用 TRIzol试剂分别提取总 RNA,使用超微量核酸蛋白检测仪测定 RNA 浓度及纯度,根据逆转录试剂盒将 RNA合成 cDNA,并以 cDNA 作为模板,以 U6 作为内参,采用实时荧光定量 PCR 检测试剂盒进行检测。引物:miR-214(上游 5-AGCCGACAGCAGGCACAGACA-3,下游 5-TGGTGTCGTGGAGTCG-3);U6(上游 5-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3,下游 5-ATATGGAACGCTCACGAATTTG-3)。反应条件为:94预变性5 min;随后设40 个循环:94变性30 s、60退火 30 s、72延伸 30 s。待反应结束后,分析扩增曲线和熔链曲线,确定有无非特异性扩增,使用相对定量 2-Ct法分析各组脊髓神经元中 miR-214的相对表达量。1.4 CCK-8 检测脊髓神经元细胞接种到 96 孔板中,分组并给予相应处理后,除去各组细胞上清培养液,分别向每孔细胞中添加 10 L 的 CCK-8 试剂,继续孵育 2 h,取出细胞培养板,使用酶标仪测定 490 nm 波长处细胞光密度(optical density,OD)值,分别计算细胞的活905颈腰痛杂志 2023 年第 44 卷第 4 期 The Journal of Cervicodynia and Lumbodynia 2023,Vol.44 No.4性,即细胞活性(%)=(实验组 OD 值-空白对照组OD 值)/(对 照 组 OD 值-空 白 对 照 组 OD 值)100%。1.5 DCFH-DA 法检测脊髓神经元细胞分组处理后,用预冷的 PBS 洗涤,加入胰蛋白酶消化,离心去上清、收集各组细胞,加入 DCFH-DA 的 500 L 重悬细胞,37 孵育30 min,离心去除 DCFH-DA,加入 PBS 洗涤细胞 3次,取适量的 PBS 重悬细胞,采用流式细胞仪检测荧光强度,发射波长为 525 nm,激发波长为 488 nm,以荧光强度反映细胞内 ROS 水平。1.6 试剂盒检测脊髓神经元细胞分组处理后,分别收集各组细胞的上清培养液,按照 SOD 活性检测试剂盒使用说明测定 SOD 的活性。1.7 ELISA 法检测脊髓神经元细胞分组处理后,分别收集各组细胞的上清培养液,按照 TNF-、IL-1 和 IL-6 ELISA检测试剂盒说明书,分别测定 TNF-、IL-1 和 IL-6 的含量。1.8 流式细胞术脊髓神经元细胞分组处理后,去除上清液,以胰酶消化,离心收集各组细胞,加入结合缓冲液重悬细胞,依次向细胞中分别加入 Annexin-FITC 和 PI 各5 L,轻轻混匀,室温避光孵育 15 min,立即上流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。1.9 Westernblot 检测脊髓神经元细胞分组处理后,向细胞中加入适量 RIPA 裂解液,冰上裂解提取总蛋白。采用 BCA法对蛋白进行定量测定。取等量蛋白样品行 SDS-PAGE 凝胶电泳,蛋白分离后,湿转至硝酸纤维素膜上,封闭液中封阻 2 h,加入 1:500 稀释的 Cleavedcaspase-3 单抗,于 4摇床过夜孵育,次日取出膜,滴加 1:3000 稀释的 HRP 标记的二抗,室温孵育2 h,采用 ECL 化学发光,采集图像,以 GAPDH 进行标准化,采用 Image J 软件计算条带灰度值,计算各组细胞中 Cleaved caspase-3 的相对表达水平。1.10 统计学分析采用 SPSS 21.0 软件统计分析,计量资料以“xs”表示,多组间差异比较采用单因素方差分析,组间两两差异比较采用 SNK-q 检验,P0.05 代表差异有统计学意义。2 结果2.1各组脊髓神经元细胞中 miR-214 的表达量比较采用 RT-qPCR 技术检测脊髓神经元细胞中miR-214 的表达情况,结果发现(如表 1 所示),与Con 组相比,H2O2组细胞中 miR-214 的表达量明显降低(P0.05);与 H2O2组相比,H2O2+Pue 组中miR-214 的表达量明显升高(P0.05);与 H2O2+Pue 组和 H2O2+Pue+anti-miR-NC 相比,H2O2+Pue+anti-miR-214 组中 miR-214 的表达量明显降低(P0.05)。表 1 各组脊髓神经元细胞中 miR-214 的表达量比较(xs,n=3)组别miR-214Con1.000.10H2O20.260.02H2O2+Pue0.940.09&H2O2+Pue+anti-miR-NC0.930.08H2O2+Pue+anti-miR-2140.350.03#$F82.259P0.000 注:与 Con 组比,P0.05;与 H2O2组比,&P0.05;与 H2O2+Pue 组比,#P0.05;与 H2O2+Pue+anti-miR-NC 组比,$P0.052.2 各组脊髓神经元细胞活性比较采用 CCK-8 实验检测脊髓神经元细胞的活性,结果发现(如表 2 所示),与 Con 组相比,H2O2组细胞活性明显降低(P0.05);与 H2O2组相比,H2O2+Pue 组细胞活性明显升高(P0.05);与 H2O2+Pue组和 H2O2+Pue+anti-miR-NC 相比,H2O2+Pue+anti-miR-214 组细胞活性明显降低(P0.05)。表 2 各组脊髓神经元细胞活性比较(xs,n=3)组别细胞活性(%)Con100.008.69H2O253.145.33H2O2+Pue88.077.91&H2O2+Pue+anti-miR-NC86.958.01H2O2+Pue+anti-miR-21462.466.29#$F21.163P0.000 注:与 Con 组比,P0.05;与 H2O2组比,&P0.05;与 H2O2+Pue 组比,#P0.05;与 H2O2+Pue+anti-miR-NC 组比,$P0.052.3 各组脊髓神经元细胞内 ROS 水平和 SOD 活性比较采用 DCFH-DA 探针法和试剂盒法分别检测脊髓神经元细胞内 ROS 水平和 SOD 活性,结果发现(如表 3 所示),与 Con 组相比,H2O2组细胞内 ROS水平明显升高(P0.05),SOD 活性明显降低(P015颈腰痛杂志 2023 年第 44 卷第 4 期 The Journal of Cervicodynia and Lumbodynia 2023,Vol.44 No.40.05);与 H2O2组相比,H2O2+Pue 组细胞内 ROS 水平明显降低(P 0.05),SOD 活性明显升高(P 0.05);与 H2O2+Pue 组和 H2O2+Pue+anti-miR-NC相比,H2O2+Pue+anti-miR-214 组细胞内 ROS 水平明显升高(P0.05),SOD 活性明显降低(P0.05)。表 3 各组脊髓神经元细胞内 ROS 水平和 SOD 活性比较(xs,n=3)组别ROS(%)SOD(U/mL)Con100.009.2274.926.64H2O2228.4923.0226.263.01H2O2+Pue146.2614.26&62.626.01&H2O2+Pue+anti-miR-NC150.4515.0661.796.08H2O2+Pue+anti-miR-214202.9220.55#$33.272.99#$F26.20748.567P0.0000.000 注:与 Con 组比,P0.05;与 H2O2组比,&P0.05;与 H2O2+Pue 组比,#P0.05;与 H2O2+Pue+anti-miR-NC 组比,$P0.052.4 各组脊髓神经元细胞上清液中 TNF-、IL-1和 IL-6 含量比较采用 ELISA 检测脊髓神经元细胞培养上清液中TNF-、IL-1 和 IL-6 的含量,结果发现(如表 4 所示),与 Con 组相比,H2O2组中 TNF-、IL-1 和 IL-6 的含量明显增多(P0.05);与 H2O2组相比,H2O2+Pue 组中 TNF-、IL-1 和 IL-6 的含量明显减少(P0.05);与 H2O2+Pue 组和 H2O2+Pue+anti-miR-NC 相比,H2O2+Pue+anti-miR-214 组中 TNF-、IL-1 和 IL-6 的含量明显增多(P0.05)。2.5 各组脊髓神经元细胞凋亡情况比较采用流式细胞术和 Western blot 分别检测脊髓神经元细胞凋亡率和 Cleaved caspase-3 表达水平,结果发现(如图1 和表5 所示),与 Con 组相比,H2O2组细胞凋亡率和 Cleaved caspase-3 表达水平显著升高(P0.05);与 H2O2组相比,H2O2+Pue 组细胞凋亡率和 Cleaved caspase-3 表达水平显著降低(P0.05);与 H2O2+Pue 组和 H2O2+Pue+anti-miR-NC 相比,H2O2+Pue+anti-miR-214 组细胞凋亡率和Cleaved caspase-3 表达水平显著升高(P0.05)。表 4 各组脊髓神经元细胞培养上清中 TNF-、IL-1和 IL-6 含量的比较(xs,n=3)组别TNF-(pg/mL)IL-1(pg/mL)IL-6(pg/mL)Con36.593.5824.772.8379.338.29H2O2453.2644.09604.2560.11545.1652.19H2O2+Pue158.9616.68&119.3610.84&204.9218.19&H2O2+Pue+anti-miR-NC160.6417.21112.9211.46198.7720.52H2O2+Pue+anti-miR-214404.6240.98#$524.7459.26#$488.9550.74#$F112.915144.203100.341P0.0000.0000.000 注:与 Con 组比,P0.05;与 H2O2组比,&P0.05;与 H2O2+Pue 组比,#P0.05;与 H2O2+Pue+anti-miR-NC 组比,$P0.05图 1 各组脊髓神经元细胞凋亡率和 Cleaved caspase-3 表达水平A:流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡率;B:Western blot 检测脊髓神经元细胞中 Cleaved caspase-3 的表达水平表 5 各组脊髓神经元细胞凋亡率和 Cleaved caspase-3表达水平比较(xs,n=3)组别凋亡率(%)Cleaved caspase-3Con2.120.220.060.01H2O211.691.340.250.02H2O2+Pue5.680.79&0.120.01&H2O2+Pue+anti-miR-NC5.570.660.130.01H2O2+Pue+anti-miR-21410.031.12#$0.210.02#$F53.00878.136P0.0000.000 注:与 Con 组比,P0.05;与 H2O2组比,&P0.05;与 H2O2+Pue 组比,#P0.05;与 H2O2+Pue+anti-miR-NC 组比,$P0.053 讨论SCI 是一种严重的中枢神经系统疾病,能够永久性损害损伤部位下方的运动、感觉和自主神经的功能。一系列复杂的损伤机制最终导致残留神经纤维的脱髓鞘,以及大量神经元和神经胶质细胞的变性和死亡11。先前的研究已经确定,细胞凋亡与 SCI的神经元丢失有关,据报道这是缓解 SCI 进程的有115颈腰痛杂志 2023 年第 44 卷第 4 期 The Journal of Cervicodynia and Lumbodynia 2023,Vol.44 No.4效干预目标12。近年来,多项研究采用 H2O2诱导脊髓神经元模拟 SCI 体外细胞模型13,14。因此,本实验采用 H2O2诱导大鼠脊髓神经元细胞模拟 SCI损伤,结果发现,H2O2诱导的神经元细胞凋亡增加,并且与凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-3 的表达水平明显升高,提示 H2O2能够诱导脊髓神经元发生凋亡。此外,SCI 过量产生了 ROS,在 SCI 的继发性损伤中起着重要作用15。本实验结果发现,H2O2诱导的脊髓神经元中 ROS 水平显著升高,且抗氧化酶SOD 活性明显降低,表明 H2O2可诱导脊髓神经元细胞发生氧化损伤。在 SCI 的所有机制中,炎症反应是最关键的过程之一。一些学者通过动物实验证实了免疫炎症反应在脊髓损伤中的作用及其修复过程16。另外,一些研究提出,可通过干预炎症反应以促进 SCI 后的干预效果17。本实验通过 ELISA检测发现,在 H2O2诱导的脊髓神经元细胞上清液中,炎症因子 TNF-、IL-1 和 IL-6 的含量明显增加,表明 H2O2能够激发炎症反应。此外,本实验发现 H2O2诱导的脊髓神经元细胞活性降低,以上实验结果证实,H2O2能够诱导大鼠脊髓神经元损伤。葛根素是从葛根的根中分离出的一种主要的异黄酮化合物,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降低胆固醇、保护肝脏和保护神经的特性。研究显示,葛根素广泛应用于帕金森病和 SCI 的治疗,发挥神经保护作用18,19。例如,葛根素通过蛛网膜下腔出血小鼠中的 Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3 和 Sirt3/SOD2 凋亡途径,可减轻神经功能损伤20。另一项研究显示,葛根素通过孕酮受体减轻了 MPTP 和 MPP+诱导的原代大鼠中脑神经元中的神经毒性,并增强了神经突生长21。本实验结果发现,葛根素干预的 H2O2诱导的脊髓神经元细胞活力升高,细胞内 ROS 水平降低、SOD 活性升高,且细胞凋亡减少,这些结果表明,葛根素能够有效逆转 H2O2诱导的脊髓神经元损伤。大量研究显示,微小 RNA(microRNA,miRNA)在调节脊髓发育和脊髓可塑性以促进功能性再生疗法的策略的开发中,发挥了非常重要的作用22,23。据报道,在 SCI 中有大量的 miRNA 表达失调,这表明,miRNA 的异常表达可能与 SCI 的发病有关24。miR-214 是与 SCI 有关的 miRNA 之一,抑制 miR-214 可减轻大鼠脊髓损伤后的炎症反应和神经再生阻滞25。本研究结果显示,H2O2诱导的损伤后,脊髓神经元中的 miR-214 被下调。有研究显示,葛根素通过上调 miR-214 来减轻缺氧导致的神经干细胞损伤26。因此,笔者推测,葛根素对 H2O2诱导的脊髓神经元细胞损伤可能通过调控 miR-214 的表达来实现。本实验结果发现,葛根素干预的 H2O2诱导的脊髓神经元细胞中 miR-214 的表达上调。为进一步探究葛根素是否通过调控 miR-214 参与对 H2O2诱导的脊髓神经元细胞损伤发挥保护作用,本实验通过转染抑制 miR-214 的表达,结果发现,抑制 miR-214 能够有效逆转葛根素对 H2O2诱导的脊髓神经元细胞损伤的保护作用。综上,葛根素能够通过上调 miR-214 的表达,减少 H2O2诱导的脊髓神经元细胞凋亡、氧化损伤和炎症反应,从而对脊髓损伤发挥保护作用。本研究初步阐明了葛根素对 H2O2诱导的脊髓神经元损伤的影响及可能的机制,为 SCI 的治疗提供新的见解。参考文献:1 Kumar R,Lim J,Mekary RA,et al.Traumatic spinal injury:Global epidemiology and worldwide volumeJ.World Neurosurg,2018,113:e345-e363.2 Yusuf AS,Mahmud MR,Alfin DJ,et al.Clinical characteristicsand challenges of management of traumatic spinal cord 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