高效液相色谱法分离纯化达托霉素.pdf

化学与生物工程 ,V o l N o w w w h x y s w g c c o m C h e m i s t r y&B i o e n g i n e e r i n g 基金项目:河北省科技研发平台建设专项(H)收稿日期:作者简介:王月(),女,吉林舒兰人,工程师,研究方向:微生物药物分离纯化,E m a i l:q q c o m;共同第一作者,栗婷婷,高级 工 程 师,研 究 方 向:微 生 物 药 物,E m a i l:q q c o m;通 讯 作 者:程 启 东,高 级 工 程 师,E m a i l:c o m.D O I:/j i s s n 王月,栗婷婷,李晓露,等高效液相色谱法分离纯化达托霉素J化学与生物工程,():WANGY,L ITT,L IXL,e t a l S e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fD a p t o m y c i nb yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yJ C h e m i s t r y&B i o e n g i n e e r i n g,():高效液相色谱法分离纯化达托霉素王月,栗婷婷,李晓露,高月麒,安兰兰,程启东(华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢技术创新中心,河北 石家庄 ;华北制药华胜有限公司,河北 石家庄 )摘要:采用高效液相色谱法对达托霉素粗品进行纯化,对反相硅胶种类、洗脱剂浓度、洗脱速度、上样量进行优选,并对关键杂质进行质量控制.结果表明,以反相硅胶U n i S i lC U l t r a装柱、以 乙醇为洗脱剂、洗脱速度为 m Lm i n、上样量为 m gm L,在此条件下,达托霉素精粉的HP L C含量超过 ,收率超过 .该方法分离制备效率高,有机溶剂用量少,纯化精粉中的有关物质均满足质量要求,具有产业化应用前景.关键词:达托霉素;高效液相色谱;分离纯化中图分类号:T Q O S e p a r a t i o na n dP u r i f i c a t i o no fD a p t o m y c i nb yH i g hP e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h yWA N GY u e,L IT i n g t i n g,L IX i a o l u,G A OY u e q i,A NL a n l a n,C H E N GQ i d o n g(NC P CN e wD r u gR e s e a r c h&D e v e l o p m e n tC o,L t d,N a t i o n a lE n g i n e e r i n gR e s e a r c hC e n t e ro fM i c r o b i a lM e d i c i n e,H e b e i I n d u s t r yM i c r o b i a lM e t a b o l i cT e c h n o l o g yI n n o v a t i o nC e n t e r,S h i j i a z h u a n g ,C h i n a;NC P CH u a s h e n gC o,L t d,S h i j i a z h u a n g ,C h i n a)A b s t r a c t:I nt h i sp a p e r,w ep u r i f i e d t h e c r u d eD a p t o m y c i nb yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y,o p t i m i z e dt h e t y p eo f r e v e r s ep h a s es i l i c ag e l,e l u e n tc o n c e n t r a t i o n,e l u t i o nr a t e,a n ds a m p l e l o a d i n g,a n dc o n t r o l l e dt h eq u a l i t yo fk e y i m p u r i t i e s T h e r e s u l t s s h o wt h a t t h eH P L Cc o n t e n to fD a p t o m y c i nf i n ep o w d e r i sm o r e t h a n a n dt h ey i e l d i sm o r e t h a n u n d e r t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s a s f o l l o w s:t h eU n i S i lC U l t r a r e v e r s ep h a s es i l i c ag e l i sa d o p t e da sm e d i u m,t h e e t h a n o l i sa d o p t e da se l u e n t,t h ee l u t i o nr a t ei s m Lm i n,a n dt h es a m p l e l o a d i n g i s m gm L T h i sm e t h o dh a s t h ep r o s p e c t o f i n d u s t r i a l a p p l i c a t i o nw i t hh i g hs e p a r a t i o na n dp r e p a r a t i o ne f f i c i e n c y,l o wa m o u n t o f o r g a n i c s o l v e n t s,a n d t h e r e l a t e ds u b s t a n c e s i n t h ep u r i f i e dp o w d e rm e e t t h eq u a l i t yr e q u i r e m e n t s K e y w o r d s:D a p t o m y c i n;h i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y;s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n达托霉素为玫瑰孢链霉菌发酵产生的一种脂肽类抗生素,早期由美国L i l l y公司开发生产,由 个氨基酸组成的环状氨基酸肽链N 末端的L 色氨酸与个十碳癸酸连接而成(图).达托霉素对革兰氏阴性菌无效,但由于其独特的C a浓度依赖的作用机制对具有多重耐药性的革兰氏阳性菌具有良好的抑制作用,极大程度上解决了耐药菌的感染问题.这也使达托霉素作为复杂的皮肤感染和金黄色葡萄球菌感染的王月,等:高效液相色谱法分离纯化达托霉素/年第期 菌血症和心内膜炎的治疗药物在临床上得到了青睐.NHHNHO C2HOONH2CO H2OOOOOOOOOOHNHNNHHO C2OOOOOHO C2HNHNHNHNHNHNHNNHHNNH2CO H2(CH)CH2 83图达托霉素的化学结构式F i g C h e m i c a l s t r u c t u r eo fD a p t o m y c i n目前,达托霉素的生产方法主要是微生物发酵法,产物体系中次级代谢产物复杂,从来源上决定了达托霉素分离纯化难度大;而且因为达托霉素稳定性较差,在纯化过程中易受p H值、温度的影响产生脱水达托霉素和异构达托霉素等多种杂质,导致达托霉素的分离纯化难度进一步加大.虽然目前关于达托霉素分离纯化国内外已有大量研究,主要方法有溶媒萃取、离子交换、色谱分离、膜分离、大孔树脂分离和结晶等 ,但是,随着国际高端市场对产品杂质限度要求越来越严格,应用上述方法进行达托霉素分离纯化往往难以达到要求.为了开发出一种收率高、产品质量优良的高效液相色谱纯化工艺,作者采用高效液相色谱法对达托霉素粗品进行纯化,对反相硅胶种类、洗脱剂浓度、洗脱速度、上样量进行优选,并对关键杂质进行质量控制,以期得到满足高端客户要求的达托霉素产品.实验 材料、试剂与仪器达托霉素发酵液(发酵单位 gm L),自制;反 相 硅 胶U n i S i lC 、U n i S i lC U l t r a、U n i S i lC,苏州纳微科技股份有限公司.乙醇、乙腈为制备级,其它试剂均为分析纯.e 型 分 析 液 相 色 谱 系 统,W a t e r s公 司;N P 型制备液相色谱系统,汉邦科技有限责任公司;L o b o r a t a 型 旋 转 蒸 发 器,H e i d o l p h公 司;X S R D u a l R a n g e型分析天平,M e t t l e rT o l e d o公司;S C I E NT Z F/A型冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司.达托霉素粗品的制备将达托霉素发酵液调p H值至 ,经陶瓷膜过滤得到澄清滤液;滤液过D 大孔吸附树脂柱,用一定浓度的乙醇洗脱,收集达托霉素浓度大于 gm L的解吸液;将解吸液减压浓缩,调节浓缩液p H值至,上样于NMQ阴离子交换树脂层析柱,用含盐水溶液进行梯度洗脱,根据色谱峰收集洗脱液;洗脱液经纳滤、浓缩、结晶、干燥,得到达托霉素粗品.达托霉素粗品的纯化将一定质量的达托霉素粗品,用适量水溶解后加入氯化钠,上样于反相硅胶色谱柱,收集洗脱液;将洗脱液用 的醋酸调p H值至 ,经浓缩、冻干,得到达托霉素精粉.对达托霉素粗品纯化过程中的反相硅胶种类、洗脱剂浓度、洗脱速度、上样量进行优选.色谱条件分析液相色谱系统:P h e n o m e n e xI B S i lC 色谱柱(mm mm,m),流动相为 磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节p H值至 )乙腈(,体积比),流速 m Lm i n,检测波长 n m,柱温,进样量 L.结果与讨论 反相硅胶种类的选择分别取预处理好的反相硅胶U n i S i lC 、U n i S i lC U l t r a、U n i S i lC 各 m L,按重力沉降法装柱,用的乙醇平衡系统.准确称取达托霉素粗品 g,用适量水溶解后加入氯化钠,分别上样于种反相硅胶色谱柱;然后用 的乙醇梯度洗脱,制备液相色谱检测器在线监测,根据色谱图 收集洗脱 液;合 并 达 托 霉 素H P L C含量大于 的洗脱液,计算洗脱收率,结果见表.表反相硅胶种类对达托霉素洗脱收率的影响(n)T a b E f f e c t o f t y p eo f r e v e r s ep h a s e s i l i c ag e l o ne l u t i o ny i e l do fD a p t o m y c i n(n)反相硅胶骨架堆积密度gc m粒径m孔径p H使用范围洗脱收率U n i S i lC 十八烷基 U n i S i lC U l t r a十八烷基 U n i S i lC 辛烷基 由表可知,U n i S i lC U l t r a反相硅胶色谱柱的p H使用范围最广,达托霉素的洗脱收率最高.故,选择U n i S i lC U l t r a反相硅胶色谱柱纯化达托霉素.王月,等:高效液相色谱法分离纯化达托霉素/年第期 洗脱剂浓度的选择实验发现,洗脱剂乙醇浓度在 时,主产物被集中洗脱.为进一步确定乙醇浓度,选择反相硅胶U n i S i lC U l t r a装柱,按 方法分别采用、的乙醇进行等度洗脱,分管收集洗脱液,合并达托霉素H P L C含量大于 的洗脱液,计算洗脱收率,结果见表.表洗脱剂浓度对达托霉素洗脱收率的影响(n)T a b E f f e c t o f e l u e n t c o n c e n t r a t i o no ne l u t i o ny i e l do fD a p t o m y c i n(n)洗脱剂浓度洗脱液体积m L达托霉素浓度gm LH P L C含量洗脱收率 注:上样量为 m gm L.由表可知,用、的乙醇洗脱时,洗脱液中主要是极性大的杂质;用 乙醇洗脱时,杂质去除率高,达托霉素的分离纯化效果最好,达托霉素H P L C含量和洗脱收率均达到最高;用 乙醇洗脱时,极性小 的 杂 质 与 达 托 霉 素 一 同 洗 脱 下 来,达 托 霉 素H P L C含量和洗脱收率有所降低.因此,选择 乙醇作为洗脱剂.洗脱速度的选择选择反相硅胶U n i S i lC U l t r a装柱、乙醇作为洗脱剂,按 方法分别以洗脱速度 m Lm i n、m Lm i n、m Lm i n、m Lm i n 进行等度洗脱,分管收集洗脱液,合并达托霉素H P L C含量大于 的洗脱液,计算洗脱收率,结果见表.表洗脱速度对达托霉素洗脱收率的影响(n)T a b E f f e c t o f e l u t i o nr a t eo ne l u t i o ny i e l do fD a p t o m y c i n(n)洗脱速度m Lm i n洗脱液体积m L达托霉素浓度gm LH P L C含量洗脱收率 注:上样量为 m gm L.洗脱速度慢则分离纯化耗时较长.由表可知,随着洗脱速度的加快,达托霉素洗脱收率先升高后降低;当洗脱速度为 m Lm i n时,洗脱收率达到最高;当洗脱速度为 m Lm i n时,洗脱收率略微下降.综合考虑,选择洗脱速度为 m Lm i n.上样量的选择选择反相硅胶U n i S i lC U l t r a装柱、乙醇作为洗脱剂、洗脱速度 m Lm i n,上样量分别为m gm L、m gm L、m gm L、m gm L,按 方法进行洗脱,分管收集洗脱液,合并达托霉素H P L C含量大于 的洗脱液,计算洗脱收率,结果见表.表上样量对达托霉素洗脱收率的影响(n)T a b E f f e c t o f s a m p l e l o a d i n go ne l u t i o ny i e l do fD a p t o m y c i n(n)上样量m gm L洗脱液体积m L达托霉素浓度gm LH P L C含量洗脱收率 由表可知,当上样量小于 m gm L时,样品分散程度好,但填料利用率低,成本高;当上样量大于 m gm L时,色谱峰变宽,目标物与杂质交叉严重,H P L C含量和洗脱收率均降低.因此,在保证分离度的前提下,选择上样量为 m gm L.精粉制备与含量测定取达托霉素粗品 g,在上述优选纯化条件(反相硅胶U n i S i lC U l t r a装柱,洗脱剂为 乙醇,洗脱速度为 m Lm i n,上样量为 m gm L)下,使用D A C (L)色谱柱制备液相色谱进行放大实验.采用H P L C法检测达托霉素含量,合并合格洗脱液,用 的醋酸将洗脱液p H值调至 ,浓缩、冻干,得到达托霉素精粉 g,H P L C含量 ,H P L C图谱见图.0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00t/min0.800.700.600.500.400.300.200.100.00AURS-5/6-31.801DT-35.115TSDT-47.948图达托霉素精粉的H P L C图谱F i g H P L Cs p e c t r u mo fD a p t o m y c i nf i n ep o w d e r 工艺验证在优选纯化条件下进行次验证实验,按色谱条王月,等:高效液相色谱法分离纯化达托霉素/年第期 件测定达托霉素H P L C含量,计算收率;并测定达托霉素精粉中有关物质含量,结果见表.表达托霉素纯化工艺验证(n)T a b V e r i f i c a t i o no fp u r i f i c a t i o np r o c e s so fD a p t o m y c i n(n)批次层析柱体积L粗粉质量gH P L C含量精粉质量gH P L C含量内酯水解物异构R S /脱水达托霉素其它杂质总杂收率 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 注:达托霉素企业内控标准:内酯水解物,异构,R S /,总杂.由表可知,在优选纯化条件下,达托霉素精粉中有关物质含量均低于企业内控标准,H P L C含量超过 ,收率超过 .表明优选纯化条件分离效果好,可实现连续制备,并能够精准把控关键杂质.结论采用高效液相色谱法分离纯化达托霉素.以反相硅胶U n i S i lC U l t r a装柱、以 乙醇为洗脱剂、洗脱速度为 m Lm i n、上样量为 m gm L,在此条件下,达托霉素精粉的H P L C含量超过 ,收率超过 .该方法分离制备效率高,有机溶剂用量少,纯化精粉中的有关物质均满足质量要求,为高质量达托霉素的规模化生产提供了重要参考,具有产业化应用前景.参考文献:王一芩,阎永贞,胡兵,等达托霉素高产菌株选育及发酵条件优化J中国抗生素杂志,():WAN GYQ,YANYZ,HUB,e t a l B r e e d i n go f h i g hD a p t o m y c i np r o d u c i n gs t r a i n sa n do p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sJC h i n e s eJ o u r n a l o fA n t i b i o t i c s,():周旭燕达托霉素产品杂质组分的鉴定与分离控制D杭州:浙江工业大学,Z HOUXY S t u d yo nt h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o nt e c h n o l o g yo fD a p t o m y c i n i m p u r i t yc o m p o n e n t sD H a n g z h o u:Z h e j i a n gU n i v e r s i t yo fT e c h n o l o g y,杨一恭达托霉素的菌种选育及发酵条件的优化研究D杭州:浙江工业大学,YAN GYG S t u d yo ns c r e e n i n go fD a p t o m y c i np r o d u c i n ga n d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fo p t i m i z a t i o nD H a n g z h o u:Z h e j i a n gU n i v e r s i t yo fT e c h n o l o g y,杨志钧,蒯翠,吴锴,等达托霉素在大孔吸附树脂上的吸附性能研究J化学工程,():YAN GZJ,KUA IC,WU K,e ta l A d s o r p t i o np r o p e r t yo fD a t o m y c i no nm a c r o p o r o u sr e s i n sJ C h e m i c a lE n g i n e e r i n g,():黄志强,黄娟,赵正国,等一种达托霉素提取方法:C N AP 常亮,魏增辉,李敏娜,等从发酵液中提取达托霉素的工艺优化J化学与生物工程,():CHAN GL,WE IZH,L IM N,e ta l O p t i m i z a t i o no f t h ee x t r a c t i o np r o c e s so fD a p t o m y c i nf r o mf e r m e n t a t i o nb r o t hJ C h e m i s t r y&B i o e n g i n e e r i n g,():谢厅,许婷婷,周陈锋,等达托霉素中间体结晶工艺研究J化工技术与开发,():X I ET,XUTT,Z HOUCF,e t a l C r y s t a l l i z a t i o nd e v e l o p m e n to fD a p t o m y c i ni n t e r m e d i a t eJ T e c h n o l o g y&D e v e l o p m e n t o fC h e m i c a l I n d u s t r y,():(上接第 页)Z O UJX,S O N GYP,L I UX H,e ta l B i s a b o l a n e,c a d i n a n e,a n dc y c l o n e r a n es e s q u i t e r p e n e s f r o ma na l g i c o l o u ss t r a i no fT r i c h o d e r m aa s p e r e l l o i d e sJ B i o o r g a n i cC h e m i s t r y,:L I UX H,S ON GYP,WAN GBG,e ta l S e s q u i t e r p e n e sa n dl i p i d s f r o mt h ea l g i c o l o u s f u n g u sT r i c h o d e r m a a t r o v i r i d eR R d l J P h y t o c h e m i s t r yL e t t e r s,:R E NJW,YANG Y,L I U D,e ta l S e q u e n t i a ld e t e r m i n a t i o no fn e w p e p t a i b o l sa s p e r e l i n e s G Z p r o d u c e d b y m a r i n e d e r i v e df u n g u sT r i c h o d e r m aa s p e r e l l u mu s i n gu l t r a h i g hp r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o m b i n e d w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o nt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r yJ J o u r n a lo fC h r o m a t o g r a p h yA,():R E NJW,XU EC M,T I ANL,e ta l A s p e r e l i n e sAF,p e p t a i b o l sf r o m t h e m a r i n e d e r i v e df u n g u sT r i c h o d e r m aa s p e r e l l u mJ J o u r n a l o fN a t u r a lP r o d u c t s,():C HE NL,Z HON GP,P ANJR,e ta l A s p e r e l i n e sGa n dH,t w on e wp e p t a i b o l s f r o mt h em a r i n e d e r i v e df u n g u sT r i c h o d e r m aa s p e r e l l u mJ H e t e r o c y c l e s,():J IN Y,WAN GBG M y c o c h e m i s t r yo fm a r i n ea l g i c o l o u sf u n g iJ F u n g a lD i v e r s i t y,:S HAN GZ,L IX M,L ICS,e ta l D i v e r s es e c o n d a r ym e t a b o l i t e sp r o d u c e db ym a r i n e d e r i v e df u n g u sN i g r o s p o r as p MA o nv a r i o u sc u l t u r em e d i aJ C h e m i s t r ya n dB i o d i v e r s i t y,():