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964 Shanghai J Acu-mox,Sep 2023,Vol 42,No 9 文章编号:1005-0957(2023)09-0964-07 动物实验 电针对胰岛素抵抗大鼠肝脏组织自噬相关蛋白表达的影响 易璇,陈丽,王静芝,王雅媛,郑紫桐,梁凤霞(湖北中医药大学,武汉 430065)【摘要】目的 观察电针对胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)大鼠肝脏组织自噬相关蛋白表达的影响,探讨电针治疗 IR 的潜在机制。方法 将 Wistar 雄性大鼠随机分为正常组、模型组和电针组,每组 8 只。电针干预选取中脘、关元、足三里及丰隆穴,每周干预 3 次,共 8 周。检测各组大鼠的餐后血糖(postprandial blood glucose,PBG)、腹腔糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)血糖、葡萄糖输注率(glucose infusion rate,GIR)。采用高压尾静脉注射 GFP-LC3 质粒,观察肝细胞 GFP-LC3 荧光斑,Western Blot 法检测大鼠肝脏组织中微管相关蛋白 1 轻链 3B-(microtubule-associated protein 1 light chain 3B-,LC3B-)、p62(sequestosome 1,p62)、蛋白激酶 B(protein kinase B,AKT)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-AKT,p-AKT)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、磷酸化胰岛素受体底物-1(phosphorylated-IRS-1,p-IRS-1)蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组 PBG 显著上升(P 0.01),GIR 显著降低(P0.01),IPGTT 血糖水平明显上升(P0.05),肝脏组织 p62 蛋白表达显著上升(P 0.01),LC3B-蛋白表达显著降低(P0.01),IRS-1、p-AKT、p-IRS-1 蛋白表达显著降低(P0.01),GFP-LC3 绿色荧光蛋白荧光密度显著降低(P0.01);与模型组相比,电针组 PBG 显著降低(P0.05),GIR 显著上升(P 0.01),IPGTT 血糖水平明显降低(P0.05),肝脏组织 p62 蛋白表达显著降低(P0.01),LC3B-蛋白表达显著上升(P0.01),p-IRS-1 蛋白表达显著上升(P0.05),GFP-LC3 绿色荧光蛋白荧光密度显著上升(P0.01)。结论 电针可以通过激活肝脏自噬提高全身与肝脏胰岛素敏感性,改善 IR。【关键词】电针;胰岛素抵抗;自噬;微管相关蛋白 1 轻链 3B;p62 蛋白;大鼠【中图分类号】R2-03 【文献标志码】A DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2023.13.3003 Effect of electroacupuncture on autophagy-related protein expression in liver tissues of insulin-resistant rat models YI Xuan,CHEN Li,WANG Jingzhi,WANG Yayuan,ZHENG Zitong,LIANG Fengxia.Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China Abstract Objective To observe the effect of electroacupuncture on autophagy-related protein expression in liver tissues of insulin-resistant rat models and explore the potential mechanism of electroacupuncture in treating insulin resistance(IR).Method Male Wistar rats were randomized into a normal group,a model group,and an electroacupuncture group,with 8 rats in each group.Points Zhongwan(CV12),Guanyuan(CV4),Zusanli(ST36),and Fenglong(ST40)were selected for electroacupuncture treatment,3 times a week for 8 weeks.The postprandial blood glucose(PBG),intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT)blood glucose,and glucose infusion rate(GIR)in each group were determined.The fluorescent spot of GFP-LC3 in hepatocytes was observed using high-pressure tail vein injection of GFP-LC3 plasmid;Western Blot was used to detect the protein expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3B-(LC3B-),sequestosome 1(p62),protein kinase B(AKT),phosphorylated AKT(p-AKT),基金项目:国家自然科学基金项目(81804170,81904276)作者简介:易璇(1993),女,2020 级硕士生,Email: 通信作者:陈丽(1988),女,副教授,Email: 上海针灸杂志 2023 年 9 月第 42 卷第 9 期 965 insulin receptor substrate-1(IRS-1),and phosphorylated IRS-1(p-IRS-1)in rat liver tissues.Result Compared with the normal group,the PBG increased significantly(P0.01),the GIR dropped notably(P0.01),the IPGTT blood glucose level rose significantly(P0.05),the liver tissue p62 protein expression increased significantly(P0.01),the LC3B-protein expression decreased significantly(P0.01),the protein expression of IRS-1,p-AKT,and p-IR2-1 dropped notably(P0.01),and the green fluorescent protein density of GFP-LC3 decreased significantly(P0.01)in the model group.Compared with the model group,the PBG dropped significantly(P0.05),the GIR increased markedly(P0.01),the IPGTT blood glucose level dropped notably(P0.05),the liver tissue p62 protein expression dropped notably(P0.01),the LC3B-protein expression increased significantly(P0.01),the p-IRS-1 protein expression increased significantly(P0.05),and the green fluorescent protein density of GFP-LC3 increased significantly(P0.01)in the electroacupuncture group.Conclusion Electroacupuncture can activate autophagy in the liver to elevate systemic and hepatic insulin sensitivity and ultimately improve IR.Key words Electroacupuncture;Insulin resistance;Autophagy;Microtubule-associated protein 1 light chain 3B;Sequestosome 1 protein;Rats 胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是指由多种因素引起的机体对胰岛素敏感性降低的一种病理状态1。国内外研究表明,电针能够有效改善 IR,其机制包括减轻炎症、调控脂质代谢、调节胰岛素信号通路等环节2-4。肝脏是胰岛素的重要靶器官之一,肝脏的脂肪浸润程度越高,胰岛素敏感性越差,降低肝脏脂肪含量能够提高机体胰岛素敏感性,改善 IR5。且自噬是脂肪降解和储存的重要环节6,自噬可以维持肝脏脂质代谢稳态,并提高肝脏胰岛素敏感性;而抑制肝细胞自噬,则会降低肝脏胰岛素敏感性7-9。因此,自噬可能是调控胰岛素敏感性的突破口。有研究表明,电针具有调控自噬相关蛋白的作用10-11,但在不同的疾病与组织中,电针对自噬的调控效应并不相同。为进一步明确电针对 IR 状态下肝脏自噬的调控作用,本研究建立 IR 大鼠模型,通过电针中脘、关元、足三里和丰隆观察胰岛素敏感性与肝脏自噬水平的变化,进一步研究电针治疗 IR 的潜在机制。1 材料与方法 1.1 实验动物 40 只 7 周龄 Wistar 雄性大鼠,体质量(22020)g。购于湖北省实验动物研究中心,许可证号为SCXK(鄂)2020-0018。所有大鼠以普通饲料适应性饲养 1 周。饲养于湖北中医药大学 SPF 级动物房,大鼠自由饮食与饮水,12 h 明暗交替。实验严格遵守关于善待实验动物的指导性意见中的各项规定。1.2 主要试剂与仪器 RIPA 裂解液(AS1004,ASPEN)、BCA 蛋白质浓度测定试剂盒(AS1086,ASPEN)、ECL 化学发光检测试剂盒(AS1059,ASPEN)、磷酸化蛋白酶抑制剂(AS1008,ASPEN),-Actin抗 体(TDY051,天 德 悦),p62(sequestosome 1,p62)一抗(ab109012,abcam),微管相关蛋白 1 轻链 3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B)一抗(43566,CST)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)一 抗(2382,CST)、磷 酸 化 胰 岛 素 受 体 底物-1(phosphorylated-IRS-1,p-IRS-1)一抗(2385,CST)、蛋白激酶 B(protein kinase B,AKT)一抗(9272,CST)、磷酸化蛋白激酶 B(phosphorylated-AKT,p-AKT)一抗(4060,CST),HRP-Goat anti Rabbit二抗(AS1107,ASPEN)。电针治疗仪(HANS LH202H,北京华运安特科技有限责任公司),冷冻离心机(TGL-16,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),电泳仪(DYY-6C,北京市六一仪器厂),扫描仪(LiDE110,Canon),生物显微镜(BX53,奥林巴斯)。1.3 模型制备及评价 适应性饲养 1 周后,随机选取 10 只以普通饲料喂养,8 周后随机选取其中 8 只作为正常组,剩余 30 只以高脂饲料12喂养 8 周,制备 IR 大鼠模型。将高于正常组体质量平均值 20%的 28 只大鼠随机取 3 只检测其葡萄糖输注率(glucose infusion rate,GIR),若所测大鼠的 GIR 小于正常组 20%则认定为造模成功。将造模成功的28只大鼠随机进行编号,并挑选16只随机分入966 Shanghai J Acu-mox,Sep 2023,Vol 42,No 9 模型组与电针组,每组 8 只。高胰岛素-正葡萄糖钳夹术(hyperinsulinemic-euglycemic-clamp,HEC)检测 GIR,钳夹术前大鼠禁食8 h,在大鼠尾根部注射局麻,行尾动静脉插管。将胰岛素注射液和 30%葡萄糖注射液分别连接在尾静脉的小三通管上,两者均以双数字式微量注射泵泵入。取尾动脉 血 0.5 m L 测 基 础 血 糖。接 着 以 恒 定 速 度 0.25/(kgh)输入胰岛素,每 5 min 测 1 次血糖并调整 GIR。血糖须保持在基础血糖0.5 mmol/L 范围内。共采血 24 次,计算 60120 min 的 GIR 的平均值。1.4 干预方法 选取中脘、关元、足三里及丰隆穴进行电针干预,取穴参考 实验针灸学13。针具选择 0.30 mm13 mm不锈钢毫针。足三里和丰隆均直刺入 35 mm,关元和中脘斜刺 35 mm。频率 2 Hz,强度 1 mA,连续波。同侧足三里和丰隆连接同一输出的两个电极,关元和中脘连接另一输出的两个电极。隔日干预,每周干预 3次,每次 10 min,共干预 8 周。1.5 标本采集 干 预 结 束 后,采 用2%戊 巴 比 妥 钠 溶 液(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉。取肝脏组织并迅速放入液氮中。之后转入80 冰箱,冻存备检。1.6 指标检测 1.6.1 餐后血糖(postprandial blood glucose,PBG)及 腹 腔 糖 耐 量 实 验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)血糖 干预前及干预 8 周后,对各组大鼠进行尾尖取血,用快速血糖仪测定大鼠 PBG。干预 6 周后,行 IPGTT 检测,操作前尾尖取血测空腹血糖(0 min),根据大鼠体质量行 50%葡萄糖腹腔注射,注射后 30 min、60 min、90 min、120 min 尾尖取血,检测血糖值。1.6.2 GIR 检测 干预 8 周后,每组大鼠各取 3 只行 HEC 检测 GIR,测定全身胰岛素敏感性。1.6.3 大鼠肝脏组织中 LC3B-、p62、IRS-1、p-IRS-1、AKT、p-AKT 蛋白表达检测 取出冻存的待检组织 50 mg,提取总蛋白,测定其浓度,进行 SDS-PAGE 电泳,之后进行转膜、封闭。孵育一抗-actin(1:10 000),LC3B(1:1 000),p62(1:2 000),IRS-1(1:500),p-IRS-1(1:500),AKT(1:2 000),p-AKT(1:1 000)过夜,孵育二抗 1 h,暗室中曝光。以-actin 为内参蛋白,分析目的蛋白相对表达水平。1.6.4 GFP-LC3 荧光检测 大鼠于处死前给予高压尾静脉注射 GFP-LC3 腺病毒 0.166 mL,给药后饲养 5 d,进行取材。取部分组织进行 OCT 包埋、冰冻切片、荧光显微镜观察并拍照,利用 Image-Pro Plus 分析平均光密度值。1.7 统计学方法 使用 SPSS22.0 统计软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数标准差表示,方差齐则采用单因素方差分析进行组间比较,并采用 LSD法进行两两比较。以P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果 2.1 模型评价 与正常组比较,造模后高脂组大鼠 GIR 显著下降(P0.05),说明 IR 大鼠模型制备成功。详见图 1。注:与正常组比较1)P0.05。图 1 造模后正常组与高脂组大鼠 GIR 的比较(xs,n3)2.2 3 组大鼠 PBG、IPGTT、GIR 比较 与正常组比较,模型组 PBG 显著上升(P0.01),GIR显著下降(P0.01);与模型组比较,电针组PBG显著下降(P0.05),GIR 显著上升(P0.01)。在 IPGTT实验中,各组大鼠腹腔注射葡萄糖30 min后,血糖水平迅速升高达到峰值,然后逐渐降低。模型组大鼠 IPGTT血糖水平明显高于正常组(P0.01,P0.05);电针组IPGTT 血糖水平明显低于模型组(P0.05)。详见图 2-图 4。2.3 3 组大鼠肝脏组织 IRS-1、p-IRS-1、AKT、p-AKT蛋白表达比较 与正常组比较,模型组肝脏组织 IRS-1、p-IRS-1、上海针灸杂志 2023 年 9 月第 42 卷第 9 期 967 p-AKT 蛋白表达显著降低(P0.01);与模型组比较,电 针 组 肝 脏 组 织 p-IRS-1 蛋 白 表 达 显 著 上 升(P0.05)。IRS-1、AKT、p-AKT 蛋白表达有上升趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。详见图 5。2.4 3 组大鼠肝脏组织 p62、LC3B-蛋白表达比较 与正常组比较,模型组肝脏组织 p62 蛋白表达显著上升(P0.01),LC3B-蛋白表达显著降低(P 0.01);与模型组比较,电针组肝脏组织 p62 蛋白表达显著降低(P0.01),LC3B-蛋白表达显著上升(P 0.01)。详见图 6。2.5 3 组大鼠 GFP-LC3 荧光比较 与正常组比较,模型组 GFP-LC3 绿色荧光蛋白荧光密度显著降低(P0.01);与模型组比较,电针组GFP-LC3 绿色荧光蛋白荧光密度显著上升(P0.01)。详见图 7。注:与正常组比较1)P0.01;与模型组比较2)P0.05。图 2 3 组大鼠 PBG 的比较(xs,n8)注:与正常组比较1)P0.01,2)P0.05;与模型组比较3)P0.05。图 3 3 组大鼠 IPGTT 血糖比较(xs,n8)注:与正常组比较1)P0.01;与模型组比较2)P0.01。图 4 3 组大鼠 GIR 的比较(xs,n3)注:与正常组比较1)P0.01;与模型组比较2)P0.05。图 5 各组大鼠肝脏 IRS-1、p-IRS-1、AKT、p-AKT 蛋白表达比较(xs,n8)968 Shanghai J Acu-mox,Sep 2023,Vol 42,No 9 注:与正常组比较1)P0.01;与模型组比较2)P0.01。图 6 3 组大鼠肝脏组织 p62、LC3B-蛋白表达比较(xs,n8)注:与正常组比较1)P0.01;与模型组比较2)P0.01。图 7 各组大鼠 GFP-LC3 荧光的比较(xs,n8)3 讨论 大量的临床及动物研究14-17证实,电针能有效治疗 IR 相关疾病,并且有环保安全、无不良反应等优势。中医学认为 IR 与痰浊内阻、脾肾亏损等密切相关18,故可从化痰祛湿、补益脾肾着手进行治疗。中脘、关元、足三里和丰隆为针刺治疗 IR 研究的常用穴19,关元和足三里固护先天肾气之本和后天脾胃之本,提升机体正气,避免向糖尿病和多囊卵巢综合征等 IR 相关性疾病转化;配伍中脘和丰隆理气化痰祛湿,祛除病邪。有研究表明,高脂饮食能促进大鼠的肥胖与 IR,并且 Wistar 大鼠经过高脂饮食饲料喂养建模能较好地模拟 IR 的临床自然过程20-21。IRS-1 与 Akt 是关键的肝脏胰岛素信号调控因子22,IRS-1 磷酸化后,Akt 发生磷酸化,使葡萄糖转移至细胞内,从而改善 IR23。若胰岛素代谢分泌异常,将造成上述功能障碍。因此,本研究采用高脂饮食饲喂法,制备 IR 大鼠模型,并选取中脘、关元、足三里和丰隆进行电针治疗。检测大鼠肝脏组织中 IRS-1、p-IRS-1、AKT、p-AKT 蛋白表达,以观察肝脏胰岛素敏感性的变化;检测大鼠 GIR,以观察全身胰岛素敏感性的变化。结果显示,与正常组相比,模型组PBG显著上升,GIR显著降低,IPGTT血糖水平明显上升,肝脏组织 IRS-1、p-AKT、p-IRS-1 蛋白表达显著降低;与模型组相比,电针组PBG显著降低,GIR显著上升,IPGTT 血糖水平明显降低,肝脏组织 p-IRS-1 蛋白表达显著上升。提示高脂饮食会引起胰岛素敏感性降低,导致 IR,而电针治疗能够提高胰岛素敏感性,从而改善 IR。这与现有研究24-25较为一致。研究表明,自噬水平的变化与 IR 呈负相关26-27,IR 状态下,肝脏自噬相关基因表达显著降低,提示 IR 与肝脏自噬水平下降密切相关,且肝脏自噬受损可导致 IR 的发生发展28。故此,自噬成为 IR 机制研究的热点。目前关于IR 的研究多为电针对脂质生成和水平的影响,自噬虽是脂肪降解和储存的重要环节,但对自噬的相关报道甚少,导致其深入的机制未揭示。因此,本研究从自噬角度入手,研究电针改善 IR 效应与肝脏自噬水平的关系,结果显示电针可以通过激活肝脏自噬改善全身与肝脏胰岛素敏感性,明确了自噬在治疗中的作用,对既往研究结果进行了补充。上海针灸杂志 2023 年 9 月第 42 卷第 9 期 969 微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和 p62 是自噬相关的重要标志物29,LC3 是检测自噬发生的标志性蛋白。当自噬作用发生的时候,型经泛素样反应与磷脂酰乙醇胺结合,并直接形成型,此时,LC3 含量与自噬泡数成正比例关系30-31。LC3-可反映自噬活性水平,其值越大,自噬越强,反之则越弱。LC3 蛋白共分为多种亚型,其中 LC3B 起到自噬调控作用,与自噬的关系最密切,通过结合脂质形成 LC3B-发挥自噬功能32。p62 是泛素化蛋白,可以和底物蛋白及 LC3-特定结构域结合,有利于底物进入自噬体被降解,p62 越高表示自噬越弱,反之则越强33。通过荧光显微镜观察肝细胞 GFP-LC3 荧光斑可很好地监测细胞自噬,当发生细胞自噬时,细胞自噬强度与 GFP 荧光强度成正比,自噬强度越强,荧光强度越强。本研究结果显示电针干预后IR大鼠LC3B-蛋白表达显著上升,p62蛋白表达均显著下降,电针组 GFP-LC3 荧光密度显著上升,由此可推论电针激活了大鼠肝脏细胞自噬。研究证实电针对细胞自噬具有调节作用。田洪昭等34发现,电针可增加自噬相关蛋白 LC3-表达,降低 p62 的表达,促进自噬流修复损伤脊髓。黄小珍等35通过研究后发现,电针可降低脊髓及神经组织 p62 的蛋白含量,对神经根型颈椎病大鼠具有显著镇痛作用,可通过调节大鼠脊髓及神经组织神经细胞的自噬保护神经细胞。有研究发现,电针治疗可降低 LC3 的表达,上调 p62 的表达,有效抑制肥胖大鼠白色脂肪组织的自噬水平36。本研究结果显示,电针可以上调 LC3B-表达,下调 p62 表达,提示电针能激活肝脏自噬,与以上众多研究报道相符。综合上述内容,电针疗法可提高 IR 大鼠全身及肝脏胰岛素敏感性,有效改善 IR,其作用机制可能与调节 LC3B-和 p62 的表达,从而激活肝脏自噬有关。参考文献 1 刘妍,常丽萍,高怀林.胰岛素抵抗的发病机制研究进展J.世界中医药,2021,16(11):1671-1674.2 WANG 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