大兴安岭南麓东北马鹿种群遗传多样性分析.pdf

由于人类活动干扰及自然环境变化，东北马鹿（Cervus elaphus xanthopygus）的生存面临诸多问题。为掌握东北马鹿遗传多样性现状，进而为马鹿种群的健康状况提供评估依据，利用线粒体Cyt b基因和微卫星2种分子标记对内蒙古大兴安岭南麓高格斯台罕乌拉国家级自然保护区内的东北马鹿进行种群遗传多样性评估。结果表明：246 份新鲜马鹿粪便隶属于 182 只个体；微卫星标记表明平均期望杂合度为（0.7290.016），平均观测杂合度为（0.7680.029），线粒体标记表明单倍型多样性为（0.3470.035），核苷酸多样性为（0.2480.025）%，种群存在较高比例的稀有单倍型（33.33%）。该地区马鹿种群遗传多样性处于中等偏低水平，未来可能存在单倍型丢失的风险。因此，为避免出现遗传多样性下降的风险，建议该地区加强对马鹿种群的管理与保护，并促进与邻近区域马鹿个体的基因交流。Population Genetic Diversity of Red Deer in the Southern of the Greater Khingan MountainsLI Zheng，GUO Jinhao，LIU Xinxin，ZHANG Minghai*（College of Wildlife and Protected Area，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China）Abstract：Due to the disturbance of human activities and changes in the natural environment，the survival of red deer（Cervus elaphus xanthopygus）is facing many problems.稿件运行过程收稿日期：2022-12-23修回日期：2023-02-17关键词：东北马鹿；分子粪便学；微卫星分子标记；线粒体分子标记；遗传多样性Key words：Red deer（Cervus elaphus xanthopygus）；Molecular scatology；Microsatellite markers；Mitochondrial markers；Genetic diversity中图分类号：Q953.3文献标识码：A文章编号：2310-1490（2023）-03-0548-08DOI：10.12375/ysdwxb.20230309基金项目：国家林业和草原局项目（2022）第一作者简介：李峥，女，23岁，硕士研究生；主要从事野生动物保护遗传学研究。E-mail：*通信作者：张明海，E-mail：李峥等：大兴安岭南麓东北马鹿种群遗传多样性分析第3期To understand the current status of the genetic diversity of red deer and to provide a basis for assessing the health status，we evaluated the genetic diversity of red deer in the Gaogesitai-Hanwula National Nature Reserve in the southern of the Greater Khingan Mountains in Inner Mongolia using mitochondrial Cyt b and microsatellite markers.Results showed that 246 fresh feces belonged to 182 individuals.Microsatellite makers showed that the average expected heterozygosity（He）was（0.7290.016），and the average observed heterozygosity（Ho）was（0.7680.029）.Mitochondrial marker showed that the haplotype diversity（Hd）was（0.3470.035），and the nucleotide diversity（Pi）was（0.2480.025）%.There was a large proportion of rare haplotypes（33.33%）in this population.Overall，the population genetic diversity of red deer in this region was at a low to medium level.Therefore，to avoid the risk of genetic diversity decline in the future，it is recommended to strengthen the management and protection of red deer in this region，and there is a need to promote gene exchange with red deer individuals in neighboring regions.由于人类活动和自然环境变化，野生动物的生存面临诸多威胁，如栖息地丧失、生境破碎化等严重威胁着野生动物的扩散和繁衍1，甚至导致种群近交风险上升、遗传多样性丧失，从而使种群对环境变化的响应及适应能力下降2。遗传多样性水平往往与种群的稳定和健康息息相关，遗传变异水平较高的种群对环境变化的适应能力更强，即使在种群数量下降后仍具备很强的恢复潜力3。遗传多样性水平的高低是衡量种群健康状况的重要依据，是进行种群管理与保护决策的重要工具之一4。东北马鹿（Cervus elaphus xanthopygus）是我国北方森林生态系统中具有代表性的有蹄类动物，在维持森林和草原生态系统的平衡与稳定中发挥重要作用，曾广泛分布于黑龙江省大小兴安岭、完达山、老爷岭及张广才岭，吉林省长白山地区，大兴安岭南麓内蒙古和河北省森林草原过渡带地区59。然而由于非法盗猎、森林资源过度利用以及自然环境变化，许多生境逐渐不适合马鹿的生存与活动，由此导致野生种群数量下降，分布区退缩，部分地区马鹿种群甚至出现斑块化分布，近亲繁殖、遗传多样性丧失的风险日益增大1011。大兴安岭南麓高格斯台罕乌拉国家级自然保护区（以下简称“高格斯台保护区”）是我国重要的马鹿分布区，马鹿平均密度为1.11只/km2，是目前野生马鹿种群密度最高的地区1213，对野生马鹿种群的恢复和历史分布区的重建具有重要意义。因此，本研究通过分子粪便学技术对分布在高格斯台保护区内的马鹿进行遗传学研究，评估马鹿种群遗传多样性现状，为马鹿种群保护及健康状况监测等工作提供理论依据。1材料与方法1.1样品采集样品均来自高格斯台保护区，保护区隶属于内蒙古赤峰市阿鲁科尔沁旗。2021年12月2022年1月，根据马鹿在保护区的分布现状，确定采样区域（图1）。选择样线调查法跟踪马鹿新鲜足迹链，并收集马鹿新鲜粪便，同时 GPS 定位。共采集新鲜粪便样品 246份，肌肉对照样品1份（来自野外发现的自然死亡雌性马鹿个体）。所有样品放置在超低温冰箱-80 保存。1.2DNA提取及物种鉴定粪 便 DNA 提 取 使 用 QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Germany），按操作说明进行。选择mtDNA Cyt b引物1415，L14724：5-CGAGATCTGAA-AAACCATCGTTG-3；H15149：5-AAACTGCAGCCC-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3用于粪便DNA的PCR 扩增（400500 bp）。扩增体系 20 L：2Rapid Taq Master Mix 10 L，10 mol/L Forward Primer 0.8 L，10 mol/L Reverse Primer 0.8 L，2550 ng/L DNA 2 L，ddH2O 6.4 L。反应条件：95 预变性3 min；95 变性30 s，53 退火30 s，72 延伸30 s，35个循环；最后72 终延伸5 min，4 保存，每次扩增均用肌肉DNA作阳性对照。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果后，将含有目的条带的扩增产物进行纯化并双向测序。所得序列使用DNAStar软件进行549野 生 动 物 学 报第44卷正反序列的拼接、比对和校正。最后在NCBI数据库中进行Blast同源比对，以确定粪便的物种来源。1.3个体识别根据东北马鹿已有研究结果，选取9对微卫星引 物（ETH225、T501、T156、BM848、T530、C143、DM45、N、T50716）用于东北马鹿个体识别。所有引物合成时，上游引物 5端均进行荧光标记（Fam、Hex、Tamra或Rox），下游引物不标记（表1）。扩增体系 20 L：2Rapid Taq Master Mix 10 L，10 mol/L Forward Primer 0.8 L，10 mol/L Reverse Primer 0.8 L，2550 ng/L DNA 6 L，ddH2O 2.4 L。反应条件同物种鉴定方法。采用多管PCR扩增法，对每个位点进行37次重复的阳性PCR，得到的产物使用 ABI 3730XL 测序仪（Applied Biosystems Inc.，America）进行基因扫描和判读等位基因大小。使用软件Excel mircosatellite tool kit寻找数据中相匹配的基因型17。判断不同样品属于同一个体的依据是：所有位点上的基因型均相同，或只有1个位点的1个等位基因不同18。1.4性别鉴定性别鉴定使用 SRY12 和 BMC1009 两对引物对粪便DNA进行复合扩增，其中引物SRY12扩增Y染色体中的SRY区域片段，引物BMC1009扩增常染色体微卫星位点，作为反应的阳性对照1920。使用SRY引物对所有样本再次单独扩增，以避免因引物间互相干扰造成的扩增失败（表2）。根据PCR结果中条带的出现情况对东北马鹿的性别进行判别。1.5遗传数据分析对于mtDNA序列，使用软件DnaSP 6.12分别计算变异位点数（variable sites，S）、单倍型数量（number of haplotypes，H）、单倍型多样性（haplotype diversity，Hd）和核苷酸多样性（nucleotide diversity，Pi）21。对于微卫星数据，使用GenAlEx 6.5将等位基因数据转化为分析软件所需的各种格式，并计算等位基因数（number of alleles，Na）、有效等位基因数（effective allele number，Ne）、观测杂合度（observed heterozygosity，Ho）和期望杂合度（expected heterozygosity，He）22。应用Cervus 3.0计算微卫星位点的多态信息含量（polymorphism information contents，PIC）；使用GIMLET 1.3.323计算9个微卫星位点的联合PID值，即无亲缘关系或同胞个体之间具有相同基因型的概率；使用Microchecker 2.2.0.324检测微卫星位点 是 否 存 在 无 效 等 位 基 因（null allele）。使 用GENEPOP 4.025测算总体和每个位点是否偏离哈图1马鹿粪便采样点示意图（内蒙古高格斯台保护区）Fig.1 Fecal sample collection sites of red deer（Gaogesitai Reserve in Inner Mongolia）550李峥等：大兴安岭南麓东北马鹿种群遗传多样性分析第3期迪温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），同时检验各位点间连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD），LD和HWE检验通过马尔科夫链法（Markov chain method）生成p值，并使用Bonferroni法对显著性进行校正26。2结果2.1物种鉴定及个体识别共采集粪便样品246份，其中成功提取DNA样品222份，样品利用率为90.24%。222份样品成功扩增Cyt b基因，扩增产物为424 bp。序列经过正反拼接、校正及 Blast比对后，最终鉴定出 209份马鹿DNA样本。GIMLET分析结果显示，9个微卫星位点的联合Prod（unbias）为 6.39810-10，即使出现双胞胎，误判概率Prod（sibs）只有0.047 3%。当2个多态性最高的位点扩增失败时，Prod（sibs）增加到0.460 0%，仍小于1.000 0%（图2）。因此，9个微卫星位点中至少有7个位点扩增成功才可用于后续分析。209份马鹿样品中获得了203个成功扩增的微卫星样本，基因分型利用率为97.13%。基于9个微卫星位点，同时结合线粒体和性别鉴定结果，个体识别结果显示 203份马鹿粪便样本属于182只不同的马鹿个体。根据扩增结果，最终在182只马鹿个体中鉴定出雌性马鹿 125 只，雄性马鹿 57 只，雌雄性比为2.19 1。表1用于东北马鹿个体识别的9对微卫星引物信息Tab.1 Details of nine microsatellite loci used for red deer individual identification位点LocusETH2251T5012T1563BM8484T5304C1431DM453N2T5073引物序列（53）Primer sequence（53）F：GATCACCTTGCCACTATTTCCTR：ACATGACAGCCAGCTGCTACTF：CTCCTCATTATTACCCTGTGAAR：ACATGCTTTGACCAAGACCF：TCTTCCTGACCTGTGTCTTGR：GATGAATACCCAGTCTTGTCTGF：TGGTTGGAAGGAAAACTTGGR：CCTCTGCTCCTCAAGACACF：GTCCTCACAGCAGCTCTATGR：GCATTCTTTAGAACTCCAACTGF：AAGGAGTCTTTCAGTTTTGAGAR：GGTTCTGTCTTTGCTTGTTGF：CACCGTTTCTTACAATCTCAR：AGGGGTCAGGTTCTCAGTTTCTACF：TCCAGAGAAGCAACCAATAGR：GTGTGCCTTAAACAACCTGTF：AGGCAGATGCTTCACCATCR：TGTGGAGCACCTCACACAT等位基因大小/bpAllele length133185238262135207350366244292152164440460282290144176重复单位大小/bpRepeat type244244244退火温度/Annealing temperature56.055.056.454.555.054.055.556.056.6注（Note）：1.Tamra；2.Rox；3.Fam；4.Hex表2东北马鹿性别鉴定引物信息Tab.2 Gender primer sequences of red deer位点LocusBMC1009SRY12SRY引物序列（53）Primer sequence（53）F：GCACCAGCAGAGAGGACATTR：ACCGGCTATTGTCCATCTTGF：CTTCATTGTGTGGTCTCGTGR：CGGGTATTTGTCTCGGTGTAF：TGAACGCTTTCATTGTGTGGTCR：GCCAGTAGTCTCTGTGCCTCCT退火温度/Annealing temperature61.061.055.0551野 生 动 物 学 报第44卷2.2基于mtDNA的遗传多样性182条Cyt b序列（424 bp）共检出5个变异位点，包括4个转换位点和1个颠换位点（C/A，350 bp处），未发现插入或缺失位点。5个变异位点中，单一变异位点 2 个（128、367 bp），简约信息位点 3 个（250、295、350 bp）。（G+C）整体含量较低，为37.8%，存在AT偏倚性，符合脊椎动物线粒体碱基的组成特点。182条序列共测定3个单倍型，分布频率分别为78.0%、21.4%和 0.5%，研究地区整体单倍型多样性指数（Hd）为（0.3470.035），核苷酸多样性指数（Pi）为（0.2480.025）%。2.3基于微卫星标记的遗传多样性根据多态信息含量（PIC）对9个扩增位点进行筛选。当PIC0.500）的扩增数据进行后续分析（表3）。各位点检测结果显示未发现无效等位基因及等位基因丢失等情况，说明基因分型结果可靠，可用于后续分析。Hardy-Weinberg 平衡检测结果显示，研究地区整体水平显著偏离 Hardy-Weinberg平衡，但固定系数为负值（Fis=-0.062），证明不存在无效等位基因或近交的影响。连锁不平衡分析结果显示8个位点间不存在连锁不平衡，可进行后续种群遗传学分析。研究区域整体种群平均等位基因数（Na）为（7.400.47）；平均有效等位基因数（Ne）为（4.400.30），有效等位基因与等位基因数二者差异显著（p0.01）。等位基因丰富度（AR）为 4.537；平均多态信息含量（PIC）为0.691。平均期望杂合度（He）为（0.7290.016）；平均观测杂合度（No）为（0.7680.029），观测杂合度与期望杂合度之间存在差异 （p0.05）。3讨论野生动物的性比既是估计物种生存力的重要指标，又是描述种群结构的重要参数，深入了解珍稀濒危野生动物的性比对制定保护与管理策略具有重要指导意义27。本研究表明，大兴安岭南麓森林草原过渡带马鹿种群雌雄性比为2.19 1，与杨淼28和图29个微卫星位点按照pID顺序的个体基因型相似概率曲线Fig.2 Probability of identity（pID）curve generated by nine microsatellite loci表38个微卫星位点的遗传多样性参数Tab.3 Genetic diversity indicators for the eight microsatellite loci位点LocusETH225T501T156BM848T530T507DM45N等位基因数Na2071410109123样本数量No.of samples175182178172176181179164观测杂合度Ho1.0000.6540.6910.5470.7900.5860.9500.994期望杂合度He0.8740.7040.8690.6550.7800.7140.8780.594多态信息含量PIC0.8600.6530.8540.6320.7520.6660.8630.509552李峥等：大兴安岭南麓东北马鹿种群遗传多样性分析第3期张沼等29对内蒙古地区马鹿的研究结果一致，均显示雌性高于雄性，符合马鹿一雄多雌的交配体制。本研究选择线粒体与核微卫星2种分子标记，从不同角度对种群遗传多样性状况进行评价。单倍型多样性（Hd）与核苷酸多样性（Pi）是衡量线粒体DNA多样性水平的重要参数30。已有学者利用线粒体Cyt b基因对马鹿部分亚种进行遗传多样性研究，如刘鑫鑫31研究表明东北地区的马鹿野生群体单倍型多样性较高（Hd=0.586），核苷酸多样性相对较低（Pi=0.305%）；刘艳华等32研究表明西藏东南部分布的西藏马鹿（Cervus elaphus wallichi）整体遗传多样性较高（Hd=0.897，Pi=2.781%）；塔依尔江 麦麦提等33发现塔里木马鹿（Cervus elaphus yarkandensis）3 个地理种群的遗传多样性不平衡（Hd=0.845，Pi=1.500%）。本研究在182只马鹿个体中发现3个单倍 型，单 倍 型 多 样 性（0.347）和 核 苷 酸 多 样 性（0.248%）均低于西藏马鹿、塔里木马鹿及分布在黑龙江和吉林地区的马鹿。根据对比国内其他马鹿亚种基于线粒体Cyt b基因的研究结果（表4），结合种群 遗 传 多 样 性 水 平 的 判 定 标 准（Hd0.500，Pi0.500%）3435，研究地区东北马鹿线粒体DNA多样性水平处于中等偏低水平。微卫星位点的多态信息含量（PIC）是衡量遗传标记所提供信息含量的参数，根据Botstein等43提出的多态信息含量标准，本研究选择的9个微卫星位点中仅有 C143位点 PIC=0.1800.250，表明 C143位点提供的遗传信息相对匮乏，故最终确定其他8个高度多态位点用于遗传多样性分析。研究结果显示整体种群平均等位基因数（Na）为7.40，平均有效等位基因数（Ne）为4.40，二者差异显著（p0.01），可能存在等位基因丢失的风险。研究区域整体种群观测杂合度（Ho）为0.768，期望杂合度（He）为0.729。杂合度作为有效量化遗传多样性水平的参数44，与其他地区马鹿亚种研究结果相比较，发现本研究地区马鹿遗传多样性处于中等偏低水平。线粒体表达的遗传多样性水平低于微卫星标记，这可能与标记方法本身有关。微卫星标记的进化速度高于线粒体DNA。相比之下，线粒体DNA的整体结构、大小及基因排列相对保守，一般不发生重组。线粒体DNA为单倍体母系遗传，有效种群大小仅为核DNA的1/4，因此，对瓶颈效应等种群变化较为敏感45，本研究表明大兴安岭南麓马鹿种群历史上可能经历了瓶颈效应。基于Cyt b测序结果可知，本研究检出的单倍型数量相对较少，Hap3仅有1只个体构成，稀有单倍型比例达33.33%。20世纪50年代，由于林业资源采伐、放牧和狩猎，本地区野生马鹿种群数量急剧下降。直到本世纪初期，经过合理的管理措施，马鹿种群数量才逐渐恢复。因此，为了马鹿种群的可持续发展，有必要对稀有单倍型实施监测，并且加强管理和保护该地区的马鹿种群，防止遗传多样性进一步下降，甚至丧失。致谢：感谢内蒙古高格斯台罕乌拉国家级自然保护区钱宏远局长、石光磊副局长对本研究调查工作的大力支持，感谢保护区业务部、资源部及科研管理部以阮行舟、宝音达来等为主要代表的全体参与表4中国马鹿种群遗传多样性参数Tab.4 Comparison of genetic diversity of red deer populations in China物种Species东北马鹿 Cervus elaphus xanthopygus东北马鹿 Cervus elaphus xanthopygus31阿拉善马鹿 Cervus elaphus alashanicus36西藏马鹿 Cervus elaphus wallichi32，37塔里木马鹿 Cervus elaphus yarkandensis33，38阿尔泰马鹿 Cervus elaphus sibiricus39天山马鹿 Cervus elaphus songaricus40甘肃马鹿 Cervus elaphus kansuensis4142研究区域Region内蒙古大兴安岭南麓吉林汪清、黑龙江穆棱宁夏、内蒙古贺兰山国家级自然保护区西藏桑日县新疆塔里木盆地新疆北屯市新疆喀拉乌成山甘肃山丹军马场微卫星MicrosatelliteHo0.7680.6630.7920.5190.0830.3660.8300.430He0.7290.7120.5960.7190.3780.5850.7100.548细胞色素bCytochrome bHd0.3470.5860.1500.8970.84500.154Pi（%）0.2480.3050.0192.7811.50000.088553野 生 动 物 学 报第44卷者的热心帮助和大力配合。参考文献：1 FRANKEL O H，SOUL M E.Conservation and evolution M.Cambridge：Cambridge University Press，1981：31-75.2 FRANKHAM R，BALLOU J D，RALLS K，et al.Genetic management of fragmented animal and plant populations M.Oxford：Oxford University Press，2017：65-86.3 PLIS K，NIEDZIAKOWSKA M，BOROWIK T，et al.Mitochondrial DNA diversity and the population genetic structure of contemporary roe deer（Capreolus capreolus）in Europe J.Mammalian Biology，2022，102（5）：1743-1754.4 GARCA-DORADO A，CABALLERO A.Neutral genetic diversity as a useful tool for conservation biology J.Conservation Genetics，2021，22（4）：541-545.5 许庆翔，张明海，路秉信.黑龙江省野生马鹿种群资源现状研究 J.经济动物学报，2000，4（1）：57-62.XU Q X，ZHANG 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