大黄酰氨基酰胺类衍生物的合成及其抗菌活性.pdf

为改善大黄酸的理化性质及抗菌活性,对大黄酸结构进行改造。以大黄酸为原料,苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)为缩合剂、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)为催化剂,分别与 L-脯氨酸甲酯盐酸盐、L-色氨酸甲酯盐酸盐和 L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐反应,再加入取代苄胺,合成了 6 个目标化合物 4a 4f。利用核磁共振(1H NMR、13C NMR、19F NMR)及高分辨质谱对目标化合物结构进行确证和表征,并首次探讨了该类化合物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌的抑菌活性。研究结果表明:部分目标化合物具有较好的抑菌活性,其中化合物 4a 对金黄色葡萄球菌的最低抑制质量浓度(MIC)值为 0.78 mg/L,化合物 4e 对普通变形杆菌的 MIC 值为 0.39 mg/L,抑菌活性优于大黄酸,甚至优于对照药物氨苄西林。关键词:大黄酸;氨基酸;取代苄胺;抗菌中图分类号:TQ35;R914.5 文献标志码:A 文章编号:0253-2417(2023)04-0047-06引文格式:廖鹏,周灿,刘静姿,等.大黄酰氨基酰胺类衍生物的合成及其抗菌活性J.林产化学与工业,2023,43(4):47-52.Synthesis and Antibacterial Activity of Rhein Amidoamide DerivativesLIAO Peng1,2,ZHOU Can1,2,LIU Jingzi3,YU Huibin1,2,ZHAO Lijun1,2(1.Department of Pharmacy,Renmin Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;2.Hubei KeyLaboratory of Wudang Local Chinese Medicine Research(Hubei University of Medicine),Shiyan 442000,China;3.School of Pharmacy,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)Abstract:In order to improve the physicochemical properties and antibacterial activity of rhein,its structure was modified.UsingO-benzotriazole-N,N,N,N-tetramethylurea(HBTU)as condensing agent,and N,N-diisopropylethylamine(DIPEA)ascatalyst,six target compounds(4a-4f)were synthesized by the reaction of rhein with L-proline methyl ester hydrochloride,L-tryptophan methyl ester hydrochloride,L-phenylalanine methyl ester hydrochloride and substituted benzylamine.The structuresof the target compounds were confirmed and characterized by(1H,13C,19F)NMR and high-resolution mass spectrometry.Theantibacterial activities of these compounds against Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Proteus vulgaris were tested for thefirst time.The results indicated that some of the target compounds had good antibacterial activities,and the minimum inhibitoryconcentration(MIC)value of compound 4a against S.aureus was 0.78 mg/L,and the MIC value of compound 4e againstP.vulgaris was 0.39 mg/L.Their antibacterial activities were better than that of rhein and even better than that of the controldrug ampicillin.Key word:rhein;amino acid;substitute benzylamine;antibacterial大黄是一种常见的中药材,性寒味苦,具有利湿退黄、泻热通便、解毒消痈等功效。大黄酸是大黄的标志性有效成分之一,属于羟基蒽醌类衍生物,具有抗肿瘤1-3、抗炎4-5、抑菌6-8、降血糖9等药理活性。但是,大黄酸的特殊平面结构,使其存在溶解性差、体内生物利用度低等问题,限制了其临床应48 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷用,因此,对大黄酸进行结构改造,改善其理化性质并进一步研究其生物活性成为国内外研究的热点。目前,对大黄酸结构修饰的研究,主要集中在大黄酸的 1,8-二羟基10和 3-羧基11部位。但由于蒽醌类化合物通常具有较强的抗菌活性12-14,如果将 1,8-二羟基部位保留,3-羧基部位引入酰胺结构,可以增强该类化合物的抗菌活性15,所以,寻找相应活性基团对大黄酸进行酰胺化改造是增强其抗菌活性的有效手段。-氨基酸,具有多官能团和手性中心,是药物合成和结构改造中的理想构建单元。氨基酸类药物具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤等重要的生物活性16-18。尤其是在新药设计中引入含(杂)环骨架氨基酸将显著改造药物分子结构,对药物的理化性质及生物活性有积极作用19-20。因此,在前期课题组的理论和实验研究基础上21-23,本研究将 L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、L-脯氨酸甲酯盐酸盐和 L-色氨酸甲酯盐酸盐引入到大黄酸结构中,并加入拥有吸电子基团的取代苄胺,合成了新型的大黄酰氨基酰胺衍生物,对其结构进行表征,并对其抑菌活性进行测试,旨在为大黄酸结构改造和开发利用提供新的途径。1 实验部分1.1 试剂与仪器大黄酸,阿拉丁工业公司;苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA),上海阿拉丁生化科技有限公司;L-色氨酸甲酯盐酸盐、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐,萨恩化学技术(上海)有限公司;L-脯氨酸甲酯盐酸盐,上海源叶生物科技有限公司;对三氟甲基苄胺,上海毕得医药科技有限公司;对氟苄胺,上海麦克林生化科技有限公司;MHB 培养基(牛肉粉 2.0 g,可溶性淀粉 1.5 g,酸水解酪蛋白 17.5 g),青岛高科园海博生物技术有限公司。其他试剂均为市售分析纯。RE-52AA 旋转蒸发器;JEOL ESC-400 核磁共振仪,日本 JEOL 公司;薄层层析硅胶板,青岛海洋化工厂分厂;ZF-2 型三用紫外仪,上海安亭电子仪器厂。1.2 大黄酰氨基酰胺类衍生物的合成1.2.1 合成路线 先将大黄酸(1)与 L-氨基酸甲酯盐酸盐缩合得中间体 2a 2c,然后脱甲酯处理得到中间体 3a 3c,再与取代苄胺发生反应得到目标化合物 4a 4f,合成路线见图 1。图 1 目标化合物 4a 4f 的合成路线Fig.1 Synthetic route of target compounds 4a-4f1.2.2 中间体 2a 2c 的合成 向 50 mL 干燥圆底烧瓶中加入大黄酸 2.2 mmol,加约 5 mL CH2Cl2和DIPEA(6 mmol)使其充分溶解后,加入 HBTU(2.4 mmol)搅拌 5 min,最后将 L-氨基酸甲酯盐酸盐(2 mmol)投入圆底烧瓶中,室温下搅拌反应 2 4 h,薄层色谱(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂,体积比 25 1,紫外 254 nm 显色)跟踪反应至结束。将反应液转移至分液漏斗,用 20 mL 5%NaHCO3溶液洗涤 3 次,合并 3 次所得水层,用适量 CH2Cl2萃取,合并有机层,依次用 10%柠檬酸溶液(20 mL)、饱和 NaCl 溶液(20 mL 2)洗涤后,无水 Na2SO4干燥过夜,蒸除有机溶剂得到黄色黏稠液体的中间体粗产物。将所得第 4 期廖 鹏,等:大黄酰氨基酰胺类衍生物的合成及其抗菌活性49 中间体经柱层析分离纯化(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇,体积比 1001),得中间体 2a 2c。1.2.3 中间体 3a 3c 的合成 分别将中间体 2a 2c 用 20 mL 1 mol/L NaOH 溶解,室温下搅拌反应60 min,逐滴加入 10%盐酸,紫色渐渐变浅,析出大量浅黄色固体,再加两滴 10%盐酸搅拌至溶液不再变紫,用乙酸乙酯(20 mL)萃取两次,收集有机层,用无水 Na2SO4干燥过夜,减压抽滤,蒸除乙酸乙酯得黄色黏稠液体即中间体 3a 3c。1.2.4 目标化合物 4a 4f 的合成 分别取中间体3a 3c(2 mmol)于50 mL 干燥圆底烧瓶中,加5 mLCH2Cl2溶解,再加入 DIPEA(6 mmol)和 HBTU(2.4 mmol),最后将取代苄胺(2.4 mmol)投入圆底烧瓶中,室温下搅拌反应 2 4 h,薄层色谱(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇,体积比 40 1)跟踪反应至结束。将反应液转移至分液漏斗,用 20 mL 1 mol/L HCl 溶液洗涤 3 次,用适量 CH2Cl2萃取所得水层,合并有机层,用无水 Na2SO4干燥过夜,减压蒸除有机溶剂得到黄色粉末(粗产物4a 4f)。将所得化合物经柱层析分离纯化(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯,体积比 31),蒸除溶剂得最终产物 4a 4f。1.3 化合物的表征以 DMSO-d6为溶剂,在核磁共振仪上进行1H NMR、13C NMR 和19F NMR 的分析。将产物配置成质量浓度为 1 mg/L 的溶液,采用电喷雾(ESI)电离源在高分辨液相色谱-质谱(UPLC-MS)联用仪上进行色谱分析。1.4 化合物的抗菌活性测试采用两倍稀释法,检测目标化合物 4a 4f 对大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的最低抑菌质量浓度(MIC)值。将复苏后的实验耐药菌株用接种针挑取一环接种在 MH(B)培养基中,37 培养 18 h,麦氏比浊法调节菌液的最终浓度为(0.8 1.2)106CFU/mL。将大黄酸和化合物 4a 4f 分别用蒸馏水(DMSO 助溶,质量分数 0.5%)配制成 100 mg/L 的储备液,二倍稀释至所需浓度。参考美国临床实验室标准委员会(CLSI 2015)标准15,以氨苄西林为阳性对照,无菌水溶液为阴性对照,采用96 孔板法检测单体化合物的 MIC 值,实验重复 3 次。为消除化合物本身颜色干扰,每组待测化合物均设置不加菌液的空白对照。2 结果与讨论2.1 化合物的表征结果实验将 1与 L-氨基酸甲酯盐酸盐先缩合,然后脱甲酯处理,再与取代苄胺发生反应得到目标化合物4a 4f,4a 4f 的得率分别是 78.1%、76.6%、74.2%、72.7%、74.9%和 71.9%。对化合物 4a 4f进行结构表征。1-(4,5-二羟基-9,10-蒽醌)-N-(4-(三氟甲基)苄基)-L-吡咯烷-2-羧酰胺(4a):黄色固体,熔程117.8 120.4;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):11.75(s,2H,C6OH,C14OH),8.50(s,1H,NH),7.86 7.03(m,9H,ArH),4.53 4.01(m,3H,CcH,C18H),3.62 3.14(m,2H,CaH),2.36 2.15(m,1H,CdH),1.99 1.72(m,3H,CdH,CeH);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6):192.1(C-10),181.8(C-7),172.0(C-16),166.7(C-15),161.7(C-6,C-14),145.1(C-19),143.9(C-12),141.7(C-2),138.1(C-4),134.3(C-8),133.8(C-22),128.6(C-20),128.2(C-24),127.9(C-21),126.3(C-23),125.5(CCF3),125.1(C-1),122.7(C-11),120.0(C-3),118.1(C-9),117.4(C-5),116.5(C-13),70.5(C-c),50.0(C-a),42.3(C-18),29.4(C-d),22.8(C-e);19F NMR(376 MHz,DMSO-d6):62.2;ESI-MS m/z:539.141 6(M+H+)。1-(4,5-二羟基-9,10-蒽醌)-N-(4-氟苄基)-L-吡咯烷-2-羧酰胺(4b):黄色固体,熔程113.2 115.8;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):11.83(s,2H,C6OH,C14OH),8.57 8.21(m,1H,NH),8.05 6.71(m,9H,ArH),4.59 4.05(m,3H,CcH,C18H),3.74 3.36(m,1H,CaH),2.27 2.05(m,1H,CaH),1.98 1.64(m,4H,CdH,CeH);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6):192.0(C-10),181.6(C-7),171.8(C-16),166.9(C-15),162.0(C-6,C14),161.7(C-22),145.2(C-12),50 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷138.1(C-2),134.2(C-19),133.9(C-4),129.3(C-8),124.8(C-20,C-24),122.5(C-1),119.9(C-3,C-11),116.6(C-5,C-13),115.3(C-21,C-23),61.0(C-c),50.1(C-a),41.8(C-18),30.2(C-d),25.5(C-e);19F NMR(376 MHz,DMSO-d6):115.7;ESI-MS m/z:489.277 3(M+H+)。1-(4,5-二羟基-9,10-蒽醌)-N-(4-(三氟甲基)苄基)-L-吲哚甲基-2-羧酰胺(4c):棕黄色固体,熔程125.7 128.1;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):12.25(s,2H,C6OH,C14OH),9.31(s,2H,C17NH,CjNH),8.16 8.01(m,2H,C2H,C13H),7.91 7.53(m,8H,ArH),7.37 7.08(m,2H,C20H,C24H),7.02 6.39(m,3H,C1H,CdH,CeH),4.44(d,J=5.5 Hz,2H,C18H),4.28 3.92(m,1H,CjH),2.15 1.82(m,2H,CiH);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6):188.3(C-10),183.7(C-7),171.2(C-16),167.5(C-15),162.0(C-6),161.8(C-14),145.2(C-19),144.3(C-12),141.5(C-b),136.7(C-2),134.9(C-4),133.1(C-8),129.5(C-22),128.7(C-20,C-24),126.6(C-g),121.7(C-21,C-23),120.8(CCF3),119.3(C-1,C-a),116.5(C-11,C-f,C-3),116.3(C-5,C-13),112.5(C-h,C-c),56.5(C-j),43.3(C-18),28.7(C-i);19F NMR(376 MHz,DMSO-d6):62.3;ESI-MS m/z:627.270 7(M+H+)。1-(4,5-二羟基-9,10-蒽醌)-N-(4-氟苄基)-L-吲哚甲基-2-羧酰胺(4d):棕黄色固体,熔程 118.9 121.6;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):12.18(s,2H,C6OH,C14OH),9.27(s,2H,C17NH,CjNH),8.02 7.63(m,3H,C2H,C3H,C13H),7.53 7.32(m,6H,ArH),7.27 7.15(m,3H,C1H,C21H,C23H),7.06(d,J=8.2 Hz,2H,CdH,CeH),4.40(d,J=5.9 Hz,2H,C18H),4.10 3.91(m,1H,CjH),2.18 1.77(m,2H,CiH);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6):187.1(C-10),182.8(C-7),172.0(C-16),166.8(C-15),163.4(C-22),160.8(C-6,C-14),145.1(C-12),143.5(C-b,C-2),139.2(C-19),138.4(C-8),136.8(C-4),134.1(C-20,C-24),124.9(C-g),124.2(C-1,C-a),121.8(C-d,11),118.6(C-3,C-9),116.6(C-5,C-13),115.3(C-21,C-23),111.9(C-h,C-c),55.8(C-j),43.9(C-18),29.5(C-i);19F NMR(376 MHz,DMSO-d6):115.4;ESI-MS m/z:577.245 6(M+H+)。1-(4,5-二羟基-9,10-蒽醌)-N-(4-(三氟甲基)苄基)-L-苄基-2-羧酰胺(4e):棕黄色固体,熔程126.7 129.4;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):11.89(s,2H,C6OH,C14OH),9.42(s,2H,C17NH,ChNH),8.16(t,J=6.2 Hz,1H,C3H),7.87 7.50(m,9H,ArH),7.44 7.10(m,3H,CbH,CcH,CdH),7.01 6.88(m,1H,C1H),4.57(d,J=5.9 Hz,2H,C18H),4.13 3.98(m,1H,ChH),2.05 1.89(m,1H,CgH),1.58 1.36(m,1H,CgH);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6):184.6(C-10),181.7(C-7),172.6(C-16),162.0(C-15),161.8(C-6,C-14),144.5(C-19),142.0(C-12),138.3(C-f,C-2),134.3(C-4),134.1(C-8),133.4(C-22),128.5(C-20,C-24,C-b,C-d),128.0(C-a,C-e),126.3(C-c,C-1),125.7(C-21,C-23),120.1(CCF3),118.3(C-11),116.7(C-3,C-9),116.1(C-5,C-13),57.8(C-h),40.3(C-18),29.4(C-g);19F NMR(376 MHz,DMSO-d6):62.5;ESI-MS m/z:589.305 2(M+H+)。1-(4,5-二羟基-9,10-蒽醌)-N-(4-氟苄基)-L-苄基-2-羧酰胺(4f):棕黄色固体,熔程 119.9 122.5;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):11.83(s,2H,C6OH,C14OH),9.33(d,J=5.4 Hz,2H,C17NH,ChNH),8.17(t,J=9.5 Hz,2H,C2H,C3H),7.95 7.61(m,4H,C11H,C13H,C20H,C24H),7.46 7.32(m,4H,CaH,CbH,CdH,CeH),7.15 7.03(m,4H,CcH,C1H,C21H,C23H),4.46(d,J=5.8 Hz,2H,C18H),4.05 3.88(m,1H,ChH),2.06 1.90(m,1H,CgH),1.55 1.36(m,1H,CgH);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6):192.1(C-10),181.7(C-7),173.7(C-16),167.8(C-15),164.6(C-6,C-14),161.9(C-22),144.4(C-12),142.3(C-f),138.1(C-2),137.1(C-19,C-5),135.8(C-8),129.3(C-20,C-24,C-b,C-d),125.6(C-a,C-e),123.1(C-c,C-1),122.0(C-11),118.3(C-3,C-9),115.6(C-5,C-13),114.6第 4 期廖 鹏,等:大黄酰氨基酰胺类衍生物的合成及其抗菌活性51 (C-21,C-23),58.2(C-h),41.9(C-18),29.5(C-g);19F NMR(376 MHz,DMSO-d6):116.1;ESI-MS m/z:539.307 8(M+H+)。在1H NMR 谱中,蒽醌环上羟基活泼氢化学位移()在 11.80 12.25 之间,酰胺键上的活泼氢的 出现在 8.5 9.42 之间;苯环上 ArH 主要集中在 8.20 6.39 之间,受到 F 原子的吸电子效应,邻位的氢原子化学位移向低场运动;4.40 附近出现的 d 峰,是取代苄胺中亚甲基的氢;与酰胺键相连的次甲基的氢,主要出现在 4.28 3.80 之间;吡咯环中的亚甲基的氢的 在2.36 1.64 之间,与氮原子相连的亚甲基的氢,周围电子云密度减小,增大;吲哚甲基与苄基的亚甲基氢的 出现在 2.15 1.36 附近。在13C NMR谱中,蒽醌环上两个羰基碳的 依次出现在 190 和 188 附近,酰胺键的两个羰基碳的 出现在 171.2 和 167.5 附近;蒽醌环上与羧基相连的碳的 出现在 161.9 和 160.1 附近;取代基为 CF3时,其碳原子的 在 124.1 附近,与之相连的芳香碳变化不大;取代基为 F 时,与之相连的碳原子的 则出现在 161.7 附近,且相邻的碳原子的向高场运动;其他芳香环上的碳化学位移在 145.2 116.6 之间;吡咯环中与酰胺键相连的次甲基的 出现在 70.5 附近,而直链的次甲基碳的 出现在 58.2 附近;其他饱和碳的 则在 43.3 以下。19F NMR 中,单取代 F 的 在 116.1 附近;三氟甲基中 F 的 主要在 63.0附近。2.2 反应溶剂对中间体 2 产率的影响由于大黄酸在多数有机溶剂中溶解度均欠佳,故反应及处理过程中,选择适宜溶剂对整个反应尤为重要,而首要影响的步骤即为中间体 2 的合成。以中间体 2a 的合成为例,考察了不同溶剂对其产率的影响。实验按 1.2.1 节操作,L-氨基酸甲酯盐酸盐选择 L-脯氨酸甲酯盐酸盐,溶剂分别选择正己烷、乙醚、四氢呋喃、丙酮、二氯甲烷和甲苯,则对应的中间体 2a 的得率分别为 40%、70%、46%、57%、85%和 69%。由此可看出,采用不同溶剂合成中间体 2a 的收率相差较大。其中以二氯甲烷为反应溶剂,其产物收率最高,达到了 85%;而在极性较小的正己烷溶剂中,产物收率仅为 40%。这可能是因为不同极性的溶剂对大黄酸的溶解性、极化程度等的不同,导致缩合反应中催化剂的催化效率不同。2.3 化合物的抗菌活性对制备的大黄酸氨基酰胺类衍生物4a 4f 的抗菌活性进行测试,结果见表1。由表1 可以看出,部表 1 化合物 4a-4f 的最低抑菌浓度(MIC)Table 1 The minimum inhibitory concentration(MIC)values of compounds 4a-4f化合物compoundMIC/(mg L-1)E.coliS.aureusP.vulgaris4a1.560.783.134b3.131.563.134c6.2512.5012.504d25.0025.006.254e1.563.130.394f1.566.250.78大黄酸 rhein3.133.131.56氨苄西林 ampicillin0.781.560.78空白对照 control分化合物对大肠埃希菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、普通变形杆菌(P.vulgaris)具有较好的抑制能力,其中化合物 4a 对 S.aureus 的MIC 值为 0.78 mg/L,而化合物 4e 对 P.vulgaris的 MIC 值为 0.39 mg/L,抑菌活性优于大黄酸。从结构上看,化合物 4a 和 4b 比,当 R1=N-L-吡咯烷基(脯氨酸侧链),R2=p-CF3时,化合物抑制 S.aureus 活性显著提高;化合物 4e 和 4f 比,当 R1=N-L-苄基,R2=p-CF3时,对 P.vulgaris 的抑制能力较大黄酸有一定提升。可见,在大黄酸结构中,引入不同种类氨基酸及具有吸电子基团的取代苄胺,可能影响其目标产物的生物活性。3 结 论采用活性基团拼接原理,以大黄酸为母体结构,将苄基、氨基酸引入到大黄酸结构中,合成了 6 个新型大黄酰氨基酰胺类衍生物。对目标化合物抑菌活性测试表明:该类化合物在抑菌能力方面,较大黄酸有较好的改善,尤其是化合物 4a(R1=N-L-吡咯烷基,R2=p-CF3)和 4e(R1=N-L-苄基,R2=p-CF3)分别对金黄色葡萄球菌(S.aureus)、普通变形杆菌(P.vulgaris)抑制能力较好,其 MIC 值分别为 0.78 和0.39 mg/L,具有进一步深入研究价值。52 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷参考文献:1LI Y W,XU Y Q,LEI B,et al.Rhein induces apoptosis of human gastric cancer SGC-7901 cells via an intrinsic mitochondrial pathwayJ.Brazilian Journal of Medical&Biological Research,2012,45(11):1052-1059.2CHANG C Y,CHAN H L,LIN H Y,et al.Rhein induces apoptosis in human breast cancer cellsJ/OL.Evidence Based Complementary andAlternative Medicine,2012,2012:9525042022-05-10.https:doi.org/10.1155/2012/952504.3BLACHER E,BEN B B,LEVY A,et al.Inhibition of glioma progression by a newly discovered CD38 inhibitorJ.International Journal ofCancer,2015,136(6):1422-1433.4倪弘,薛小平,杨秀竹,等.大黄酸抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性介质活化的作用机理J.天津中医药,2001,18(1):35-36.NI H,XUE X P,YANG X Z,et al.The mechanism of rhein inhibiting the activation of inflammatory mediators in mouse peritoneal macrophagesJ.Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine,2001,18(1):35-36.5ANTONISAMY P,AGASTIAN P,KANG C W,et 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