猪肝过氧化氢酶提取条件及应用研究.doc

****大学学士学位论文
摘要

本文主要讨论了以猪肝为原料对过氧化氢酶的提取条件进行了实验，以及对过氧化氢酶在牛奶保鲜方面的研究。根据猪肝过氧化氢酶在pH 5.3-8.0有活性，最适pH为7.0，溶于水的特性，采用水浸法提取猪肝过氧化氢酶，确定最佳提取条件，即：料、水质量比为1:5，浸取温度为25℃，浸取时间为8小时。同时测得猪肝过氧化氢酶Km值为0.029mol/L,并研究了过氧化氢酶在牛奶保鲜中的作用，发现过氧化氢酶能显著延长牛奶的保鲜期。

关键词：过氧化氢酶；猪肝；水浸法，Km值；牛奶保鲜
Title: Study on the Condition of Extraction of Catalase from Pig Liver and it’s Application

Abstract：
This article researched the extraction conditions of liver as the raw,and CAT in milk preservation research. The CAT possesses activity in pH 5.3~8.0 and dissolves to water,its optimum pH is 7.0.According to above properties,the method of lixiviating with water to extract CAT from pig liver was used.Frist choose the main factors,namely extraction time ,extraction temperature ,the ratio of pig liver to water,to acquire the most suitable combination conditions of extraction. The optimum extraction conditions of CAT from pig liver as follows:the ratio of pig liver to water is 1:5,extraction temperature is 25℃,ectraction time is 8 hours.Meanwhile, we measured the Km of catalase in the pig liver is 0.029mol/L,by studied the effect in milk preservation,we find that the catalase can prolong the preservation period obviously.

Key words ：CAT； Pig liver ；water immersion ；Km；milk preservation
目录

第一章 绪论 1
1.1 什么是过氧化氢酶 1
1.2 过氧化氢酶的反应机理 1
1.3 过氧化氢酶在动植物机体中的作用 2
1.3.1 过氧化氢酶提高植物的抗逆水平 2
1.3.2过氧化氢酶提高植物光合作用能力 4
1.3.3过氧化氢酶增强植物的防御能力 5
1.3.4过氧化氢酶延缓植物衰老 5
1.3.5过氧化氢酶诱导植物细胞的全能性 5
1.3.6过氧化氢酶在控制植物细胞氧化还原平衡中的作用 5
1.4 过氧化氢酶的来源 6
1.4.1 最新动态－从细菌发酵中得到过氧化氢酶 6
1.5 过氧化氢酶的测定 7
1.6过氧化氢酶的用途 8
1.7过氧化氢的害处及其控制 8
1.8过氧化氢酶活性的研究 8
1.8.1 不同植物过氧化氢酶的活性 9
1.8.2 不同动物器官过氧化氢酶活性 9
1.9过氧化氢酶在棉针织物漂染工艺中的应用研究 9
1.9.1 影响过氧化氢酶除去织物中过氧化氢的因素 12
1.10 过氧化氢酶作为食品添加剂在牛奶保鲜方面的研究 13
1.11过氧化氢研究的最新进展和应用前景 14
1.12关于过氧化氢酶的Km值 15
第二章 实验部分 18
2.1 猪肝过氧化氢酶浸取条件的研究 18
2.1.1 材料，药品与实验器材 18
2.1.2 浸取时间的选择 19
2.1.3 浸取温度的选择 19
2.1.4 料、水质量比的选择 20
2.1.5 正交试验设计 20
2.2 猪肝过氧化氢酶Km值的测定 21
2.2.1 实验原理 21
2.2.2 实验试剂 21
2.2.3 实验步骤 22
2.3 过氧化氢酶在牛奶保鲜中的应用 22
2.3.1研究材料与方法 22
2.3.2检测标准 23
第三章 实验结果与讨论 24
3.1 猪肝过氧化氢酶浸取条件单因素实验结果与分析 24
3.1.1 浸取时间对猪肝过氧化氢酶浸出酶活的影响 24
3.1.2 浸取温度对过氧化氢酶浸出酶活的影响 25
3.1.3 料、水质量比对过氧化氢酶浸出酶活的影响 25
3.1.4 正交实验结果分析及最终浸取条件的确定 26
3.1.5 关于猪肝过氧化氢酶浸取条件的讨论 27
3.2 猪肝过氧化氢酶Km值计算 27
3.3 过氧化氢酶在牛奶保鲜应用中的结果与讨论 28
第四章 实验结果 30
致谢 31
参考文献 32

33
化学与生命科学学院－ － 生物技术专业
第一章 绪论

1.1 什么是过氧化氢酶

过氧化氢酶（CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。过氧化氢酶是一个同源四聚体，每一个亚基含有超过500个氨基酸残基；并且每个亚基的活性位点都含有一个卟啉血红素基团，用于催化过氧化氢的反应。
过氧化氢酶的最适pH接近7，最适温度则因物种而异。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。其催发反应式如下：
2H2O2 → 2H2O + O2
一个过氧化氢酶分子可以每秒钟将数百万个过氧化氢分子转化为水和氧气。CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。H2O2浓度越高，分解速度越快。

1.2 过氧化氢酶的反应机理

虽然过氧化氢酶完整的催化机制还没有完全被了解，但其催化过程被认为分为两步：
H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E(.+)
H2O2 + O=Fe(IV)-E(.+) → H2O + Fe(III)-E + O2
其中，“Fe()-E”表示结合在酶上的血红素基团（E）的中心铁原子(Fe)。Fe(IV)-E(.+)为Fe(V)-E的一种共振形式，即铁原子并没有完全氧化到+V价，而是从血红素上接受了一些“支持电子”。因而，反应式中的血红素也就表示为自由基阳离子(.+).
过氧化氢进入活性位点并与酶147位上的天冬酰胺残基（Asn147）和74位上的组氨酸残基（His74）相互作用，使得一个质子在氧原子间互相传递。自由的氧原子配位结合，生成水分子和Fe(IV)=O。Fe(IV)=O与第二个过氧化氢分子反应重新形成Fe(III)-E，并生成水分子和氧气。活性中心铁原子的反应活性可能由于357位上酪氨酸残基（Tyr357）的苯酚基侧链的存在（帮助Fe(III)氧化为Fe(IV)）而得以提高。反应的效率可能是通过His74和Asn147与反应中间体作用而得以提高。该反应的速率通常可以通过米氏方程来确定。
过氧化氢酶也能够氧化其他一些细胞毒性物质，如甲醛、甲酸、苯酚和乙醇等。任何重金属离子，（如硫酸铜中的铜离子）可以作为过氧化氢酶的非竞争性抑制剂。另外，剧毒性的氰化物是过氧化氢的竞争性抑制剂，可以紧密地结合到酶中的血红素上，阻止酶的催化反应。

1.3 过氧化氢酶在动植物机体中的作用

过氧化氢是一种代谢过程中产生的废物，它能够对机体产生损害。为了避免这种损害，过氧化氢必须快速地被转化为其他无害或毒性较小的物质。正如前面所说，过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化氢分解的工具，从而不使机体发生H2O2中毒。
但是过氧化氢酶真正的生物学重要性并不是如此简单：研究者发现基因工程改造后的过氧化氢酶缺失的小鼠依然为正常表现型，这就表明过氧化氢酶只是在一些特定条件下才对动物是必不可少的。
一些人群体内的过氧化氢酶水平非常低，但也不显示出明显的病理反应，这很有可能是因为正常哺乳动物细胞内主要的过氧化氢清除剂是过氧化物还原酶（peroxiredoxin），而不是过氧化氢酶。
过氧化氢酶通常定位于一种被称为过氧化物酶体的细胞器中。植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸和共生性氮固定，但细胞被病原体感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂，部分病原体，如结核杆菌，嗜肺军团菌和空肠弯曲菌，能够产生过氧化氢以降解过氧化氢，使得他们能在宿主体内存活。与过氧化氢酶相关的疾病有由过氧化氢酶功能缺陷所造成的过氧化物酶体异常（peroxisomal disorder）和过氧化物酶缺乏症（acatalasia）。
在投弹手甲虫中，过氧化氢酶具有独特用途。这种甲虫具有两套分开储存于腺体中的化学物，大的腺体中储存者对苯二酚和过氧化氢，而小腺体中储存着过氧化氢酶和辣根过氧化物酶，当甲虫将两个腺体中的化学物质混合在一起时，就会释放出氧气，而氧气既可以氧化对苯二酚又可以作为助推剂。
近年来，过氧化氢酶在植物体内的生理功能方面的研究取得了很多的进展，其主要有提高植物的抗逆水平、提高植物光合作用的能力、强植物的防御能力、延缓衰老、诱导细胞的全能性、在控制植物细胞氧化还原平衡中起重要作用[1]。

1.3.1 过氧化氢酶提高植物的抗逆水平

1） 抗干旱。Bailly等研究表明,干燥诱导使向日葵种子中过氧化氢酶活性增加,H2O2和脂质过氧化水平降低,说明过氧化氢酶保护种子免受脱水过程中产生的氧化损伤,也暗示H2O2可能在脱水信号传导中起作用,调节过氧化氢酶基因的表达；耐旱的干种子具有高的过氧化氢酶活性也说明其在耐旱中的作用。玉米等植物的过氧化氢酶活性在干旱条件下增加,但在恢复正常生长条件时,过氧化氢酶活性转为正常水平。转大肠杆菌过氧化氢酶基因的烟草,能抗除草剂百草枯,提高了在强光下的耐旱性及抗氧化胁迫的水平。研究还发现,用适量ABA(10～100mmol/ L)处理玉米苗促进H2O2的产生并明显提高SOD、CAT和APX等抗氧化酶的活性,增强对干旱等氧化胁迫的抵抗能力。
2）　增强耐盐能力。盐胁迫诱导过氧化氢酶活性的增加。Liang等研究盐敏感型和耐盐型大麦发现,用盐处理2d,显著刺激其根内SOD、POD和CATs活性的增加,但4d后则下降,若添加硅,则明显提高过氧化氢酶等抗氧化酶的活性,增强耐盐性。用不同浓度的NaCl处理盐敏感和耐盐棉花,随着浓度的提高耐盐品种活性逐渐减低,而100 mmol/ L NaCl则使盐敏感品种CATs活性提高,说明耐盐品种本身具有较高的活性。反义表达过氧化氢酶的转基因烟草对盐胁迫更加敏感；盐胁迫下大麦等植物体内过氧化氢酶的活性明显增加,耐盐番茄(Lycopersicon pennellii)根部线粒体和过氧化物酶体H2O2和脂质过氧化水平低,而抗氧化酶活性如SOD、APX和CAT活性高。这些结果表明,植物高的抗盐能力与高水平的抗氧化酶密切相关。研究发现,一定浓度的氨基乙酰丙酸(52aminolevulinic acid2ALA)、γ2氨基丁酸(Gamma2aminobutyric acid)和外源GB (Glycinebetaine)能提高植物体内APXs和CATs的活性,增强对盐诱发的氧化胁迫的耐性过氧化氢酶。
3）　减轻重金属毒害。重金属抑制植物对P、K、S、Ca、Zn、Mm等营养元素的吸收,破坏细胞的正常代谢,导致过氧化损伤。研究表明,用一定浓度的Cd2+处理豌豆等植物引起H2O2的产生,过氧化氢酶活性有不同程度的增加；Cd2+超量积累植物Thlaspi caerulescens根内有高的活性,该植物的生长甚至不受Cd2+的影响,说明高的过氧化氢酶活性水平与减轻Cd2+毒害有关。用不同浓度的Pb2+处理小麦等植物幼苗,其CATs和SODs活性都有所提高； Pb2+还诱导Pb2+积累植物幼苗过氧化氢酶活性增加[2]。镧(Lanthanum La3＋)能提高过氧化氢酶的活性,减轻Pb2＋的毒害。这些研究表明,过氧化氢酶在抵抗重金属引起的氧化胁迫中可能发挥重要作用。
4）　提高对温度胁迫的抗性。研究表明,高的过氧化氢酶活性与高水平的耐冷性密切相关。过氧化氢酶是在热激诱导的耐冷性中起主要作用的抗氧化酶。Rainwater等发现,热胁迫导致番茄产量降低,耐热品种比热敏感品种降低少,在所有品种中过氧化氢酶活性都明显增加。马铃薯在低温贮藏期间前6周过氧化氢酶活性下降,而6周后直到15周则提高,说明过氧化氢酶活性的变化与低温持续时间有关。研究还发现，乙烯、ABA、ACC和GB等能诱导CATs和PAL活性的提高,增强植物对温度胁迫的抗性。
5）　抗除草剂。有证据表明,过氧化氢酶能提高植物对除草剂的抗性。反义表达CAT的转基因烟草对百草枯(Methyl violo2gen)更加敏感；百草枯明显诱导水稻等过氧化氢酶的活性增加；耐除草剂大豆(Rehmannia glutinosa)过氧化氢酶活性比除草剂敏感大豆高12倍。适量的SA(Salicylic acid)预处理可增加大麦过氧化氢酶等抗氧化酶的活性,提高对除草剂的抗性。
6）　减轻DNA损伤。研究发现,反义表达CAT1的转基因烟草根内过氧化氢酶活性比对照降低了60%,用前诱变剂苯二胺处理根时,诱发高水平的DNA损伤,说明CAT能减少DNA损伤。H2O2诱导的DNA损伤还与细胞的发育时期有关,在相同的H2O2水平条件下,培养2d的烟草细胞比培养12d的细胞更敏感,其过氧化氢酶活性明显提高。
7）　保护植物减轻辐射损伤。Zaka等研究显示,Gamma辐射引起过氧化氢酶等抗氧化酶活性的增加；反义表达CAT的转基因烟草和拟南芥对臭氧更敏感,并诱导细胞死亡；紫外光诱导玉米CAT1、和CAT3的表达,表明过氧化氢酶与保护植物减轻辐射损伤有关。

1.3.2过氧化氢酶提高植物光合作用能力

　在强光等逆境条件下,植物进行光呼吸,降低光合效率。过氧化氢酶减少光呼吸产生的H2O2,提高光合效率。过氧化氢酶还能抑制ABA等引起的气孔关闭,有利于CO2进入植物体,促进光合作用。反义表达CAT导致H2O2在光呼吸条件下过量积累,降低了植物的光合水平并诱发叶脉处的栅栏组织细胞主动死亡,说明了过氧化氢酶在植物光合作用中的重要性。在干旱胁迫条件下,2倍的CO2明显增加CAT、SOD CAT的活性,抑制气孔关闭,促进光合作用。研究表明,植物在胁迫条件下产生ABA,ABA诱导H2O2积累,进而触发保卫细胞质膜上内流K+通道的关闭,从而引起气孔关闭,过氧化氢酶分解过多的H2O2,促进K+通道的开放,抑制气孔关闭,因而提高光合效率。转大肠杆菌CAT基因的烟草在干旱条件下,能耐受高光强,光合作用水平提高,而在相同条件下对照烟草光合作用受到严重伤害。反义表达CAT的转基因烟草增强了对光的敏感性,过氧化氢酶在中等光强下[150～200mmol/ (m2·s)],叶片即产生坏死斑,其光合能力明显受到抑制,而呼吸速率增大,说明过氧化氢酶是植物光合作用特别是逆境条件下保持较高光合效率不可缺少的抗氧化酶。

1.3.3过氧化氢酶增强植物的防御能力

过氧化氢酶在植物防御中有重要作用。转基因烟草反义表达CAT过氧化氢酶,降低了清除活性氧介质的能力,导致H2O2等过量积累,增加了对病原侵染的敏感性并触发细胞程序性死亡,而抗TMV(Tobacco mosaic virus)侵染的烟草其CAT的转录受到H2O2的抑制,表明H2O2能调节CAT的表达。过量表达酵母CAT1的烟草,抗病毒侵染能力提高,产生的坏死斑比未转基因植物小,但其作用是局部的,没有达到整株抗病性提高的水平；转烟草II型CAT基因的马铃薯,激活了转基因植物体内同源基因的表达,也增强了抗病能力。

1.3.4过氧化氢酶延缓植物衰老

Goel等研究发现,人为促进棉花(Gossypiumhirsutum L)种子老化,降低了过氧化氢酶等抗氧化酶的活性,增加了MDA(Malon dialdehyde)和过氧化物的积累,说明种子的衰老与抗氧化水平的降低密切相关。黑莓果实成熟过程中也有同样的变化,对辣椒贮存期抗氧化酶变化的研究也得到类似的结果。从木薯克隆的CAT1过氧化氢酶对延缓其收割后的生理退化有重要作用。Dat等也发现,反义表达CAT的转基因烟草,由于过氧化氢酶活性的降低,导致H2O2过氧化氢酶过量积累而失去平衡,从而触发细胞主动死亡。这些研究显示,高活性的过氧化氢酶对延缓衰老起重要作用。

1.3.5过氧化氢酶诱导植物细胞的全能性

Siminis等用烟草和葡萄藤(Vitisvinifera L)进行原生质体(Protoplasts)培养发现,分裂的原生质体诱导过氧化物的产生,过氧化氢酶活性明显增加,而未分裂原生质体则没有明显变化,表明过氧化氢酶活性在分裂原生质体专一性的增加可能与诱导细胞的全能性有关。用烟草原生质体培养,研究过氧化物浓度对细胞再生的影响,也发现过氧化氢酶与细胞壁的形成和细胞分裂有关。大麦缺乏过氧化氢酶活性的突变体细胞分裂水平降低,叶片产生坏死斑,后代存活率低,产量也低。镧能提高过氧化氢酶的活性,促进LoquatPlant-let分化苗根的生长。有证据表明,血红蛋白也能明显提高棉花培养细胞中过氧化氢酶的活性,刺激细胞生长。

1.3.6过氧化氢酶在控制植物细胞氧化还原平衡中的作用

　氧化还原平衡是细胞功能的关键决定因子,任何重要的不平衡都会导致严重损伤或细胞死亡。细胞的氧化还原平衡与ROS(Reactiveoxygen species)的积累水平有关,现在已经清楚的认识到ROS如H2O2等具有双重作用。低浓度下作为重要的信号分子,H2O2通过诱导细胞内一系列保护和防御基因来保护植物；高浓度下则产生危害,H2O2使酶的巯基氧化而失活,破坏光合作用等代谢过程,而且过量的H2O2还通过Fenton反应产生毒性更强的OH·,由于植物体内没有清除OH·的酶,因此过多的OH·会引起细胞过氧化,最终导致细胞死亡。所以,ROS的水平必须严格控制。研究发现,过氧化氢酶在控制ROS的水平和植物细胞的氧化还原平衡中起关键作用。过氧化氢酶活性低导致ROS增加,GSH(Glutathione)库氧化,抗坏血酸减少,使植物不能产生足够的还原力,不能持续进行抗坏血酸—谷胱甘肽再循环,破坏细胞内的氧化还原平衡；过氧化氢酶活性低的植物对盐和除草剂等环境胁迫特别敏感,离子渗漏、膜脂过氧化加重,光合色素破坏,导致光合活性和PSII效率降低。过氧化氢酶活性低的转基因拟南芥对臭氧和光呼吸产生的H2O2敏感,诱导细胞死亡。研究还表明,高水平的过氧化氢酶活性是植物抗氧化胁迫必需的。转基因烟草在叶绿体内表达大肠杆菌CAT增强了对光、干旱和除草剂等诱导的氧化胁迫的抗性。同样,转玉米CAT2的烟草对除草剂引起的伤害减轻。

1.4 过氧化氢酶的来源

过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别是在哺乳动物的肝与红细胞中以高浓度存在。过氧化氢酶也普遍存在于植物中，但不包括真菌，虽然有些真菌被发现在低pH值和温暖的环境下能够产生该酶。绝大多数需氧微生物都含有过氧化氢酶，例外部分厌氧微生物，如Methanosarcina barKeri也含有过氧化氢酶。但是国内外多从动物的肝脏中提取，也有从动物血液、贻贝和人的胎盘中提取的[3][4][5][6]。溶壁微球菌，黑曲霉等也产生过氧化氢酶。目前市售的过氧化氢酶的来源有3个：通过牛肝，猪肝提取纯化而得，由变种黑曲霉在通风搅拌等控制下培养而得，由枯草杆菌等细菌经深层发酵提取精致而得[7][8]。

1.4.1 最新动态－从细菌发酵中得到过氧化氢酶

过氧化氢酶广泛用于生物，医药，临床医学和食品领域中的某些成分测定以及纺织，制浆和造纸工业，其需求量是十分巨大的。以往商品化的过氧化氢酶主要来源于牛肝，微球菌和黑曲霉。但是近年来，由于人类环保意识和能源意识的增强，对嗜热菌，嗜碱菌，或嗜热嗜碱菌生产有特殊性质的CAT称为过氧化氢酶研究的新热点，包括极端微生物的筛选，基因工程菌的构建以及酶学性质的研究。2007年，江南大学科学家华兆哲等探究了用枯草杆菌Bacillus sp F26发酵产生过氧化氢酶的条件。确定了Bacillus sp F26产生过氧化氢酶最佳发酵培养基组成为：15g/L牛肉膏，10g/L玉米浆，5g/L酵母膏，1g/L磷酸二氢钾，0.2g/L氯化镁，50g/L氯化钠，10g/L碳酸钠。适宜环境条件为：初始pH 9.0，装液量50mL(250mL的摇瓶)，温度37℃。在对数生长后期（16h）添加2mmol/L H2O2对CAT的诱导效果最好。以指数速率方式流加H2O2可降低H2O2对菌体的毒害作用，与分批发酵和恒速流加相比分别将酶活提高了92.8%和20.7%，证明了它是一种比较好的发酵产CAT的诱导方式。

1.5 过氧化氢酶的测定

雷厚成等(1994)研究了过氧化氢酶活性的化学发光法测定。根据平均发光强度, 从过氧化氢浓度与化学发光强度关系曲线上查找余留的过氧化氢浓度。应用本法与传统的光度法, 同时对市售的5个抗氧化、防衰老的保健产品进行了测定
徐镜波等测定过氧化氢酶活性的原理是动植物和微生物细胞内的过氧化氢酶可催化过氧化氢分解为水和分子氧, 加入一定量的H2O2, 用碘量法测定未被催化分解的H2O2, 根据被催化分解的H2O2量, 可计算过氧化氢酶的活性。实验材料为鱼。
彭志英等(1995)采用紫外速率直接法测定过氧化氢酶活性, 这种方法是利用CAT分解H2O2生成H2O和O2这一反应。实验结果表明, 人全血溶血液正常范围为168.8~320.2K/L, 包括在测定范围内。
陈大义等(2000)研究用催化分光光度法快速测定血清过氧化氢酶活性。他们利用过氧化氢酶催化分解底物过氧化氢, 剩余的过氧化氢与钼酸铵、碘化钾反应生成单质碘, 后者与淀粉反应生成蓝色, 其蓝色深浅与酶的活性成反比。此方法灵敏度高, 稳定性较好, 简单快速, 适用于血清过氧化氢酶活性的测定。
周强、曹春艳(2001)研究了血清过氧化氢酶的比色测定。根据酶促反应后剩余的过氧化氢与钼酸铵形成稳定的黄色复合物, 其颜色的深浅与酶活性成反比, 进行比色测定。
在过氧化氢酶的修饰研究方面, 王玉洁等以乙基纤维素为膜材, 用干燥法将过氧化氢酶微胶囊化。周祖新(1998)通过更换烷基化试剂, 即用三乙基氧鎓四氟化硼代替硫酸二甲酯, 使固定化过氧化氢酶的性能有了很大改善。胡杨等(2001)采用聚阳离子复合物用于过氧化氢酶与酵母细胞的共固定化, 可防止使用过程中酶的渗漏, 改善了供氧效果和酵母的增殖。姜招峰等(2001)用Cu(Ⅱ)对过氧化氢酶进行修饰,制备了Cu(Ⅱ)络合的CAT, 称为Cu(Ⅱ)CAT, Cu(Ⅱ)CAT除了具有CAT的活性外, 还有SOD样活性, 它可以抵抗O2·的氧化损伤作用[16]。

1.6过氧化氢酶的用途

现过氧化氢酶主要应用与纺织印染也当中，也有应用于食品加工业中。以往纺织印染业中在棉针织物痒漂洗染色工艺中，主要使用传统的高温水洗工艺去除残留的双氧水。这样不仅成本高，生产效率低，而且对环境的污染非常严重。而近些年用到的过氧化氢酶生物除氧的方法，就很好的解决了这些问题，它具有节省水、点、时间、人力等特点。同时作为一种生物催化剂，它对环境的污染也比传统工艺要小得多。在食品行业中，过氧化氢酶主要是作为一种食品添加剂来使用的，其作用就是用来消除食品由紫外线照射后产生的过氧化氢和作为抗氧化剂。另外在一些食品的后期处理中，可以用过氧化氢酶来去除残留的过氧化氢，使其消除异味。
在一些文献中还提到，由于过氧化氢酶普遍存在于微生物体内，因此可以应用于生态毒理及生态化学领域。

1.7过氧化氢的害处及其控制

尽管过氧化氢酶在生活生产中有很多的用处,单是其在某些方面同样有危害,如在脱墨过程中,过氧化氢酶即是一种有害物质,需要除去[10]。这主要表现在，在废纸脱墨系统中，过氧化氢酶对过氧化氢效率的发挥非常不利，由于该物质能迅速消耗掉大量的过氧化氢，使得碱性饭黄现象得不到控制，从而引起废纸浆白度降低和脱墨化学品成本上升等一系列问题的出现。主要控制方法有加大过氧化氢用量，勤清洗系统中易形成沉积物的死角，合理利用系统内的循环白水，选择合适的杀菌剂等。这些方法在一定程度上能有控制过氧化氢酶的活性。

1.8过氧化氢酶活性的研究

过氧化氢广泛的存在于动植物体内，但是其活性却不尽相同。本部分主要探究不同植物体内过氧化氢酶的活性和动物体内不同器官内的过氧化氢酶活性[8]。

1.8.1 不同植物过氧化氢酶的活性

表1.不同植物过氧化氢酶的活性

序
号
材料名称
3mL 30％ H2O2
反应现象
反应速度
产生气泡多少
1
元葱肉质鳞叶
3mL 30％ H2O2
较快
较多
2
马铃薯块茎
3mL 30％ H2O2
迅速
大量
3
胡萝卜直根
3mL 30％ H2O2
快
多
4
苹果果实
3mL 30％ H2O2
慢
不多
5
白菜叶柄
3mL 30％ H2O2
较快
较多
6
空白
3mL 30％ H2O2
缓慢
少量

通过观察上述实验反应得出结论：不同植物催化过氧化氢速度不同，其过氧化氢酶催化效率依次是马铃薯，胡萝卜，元葱，白菜，苹果。

1.8.2 不同动物器官过氧化氢酶活性

表2.动物不同器官过氧化氢酶活性

序
号
器官名称
3m l30% H2O2
反应现象
反应速度
产生气泡多少
助燃情况
反应时间
1
肝脏
3m l30% H2O2
迅速
大量
迅速复燃
长
2
肺
3m l30% H2O2
较快
较多
发亮
较长
3
脾
3m l30% H2O2
较快
较多
发亮
较长
4
肾
3m l30% H2O2
快
多
能复燃
短
5
空白
3m l30% H2O2
较慢
少
不能
短

通过观察上述反应得出结论：不同动物器官催化过氧化氢分解速率不同，其催化效率依次为肝脏，肺，脾，肾。可见肝脏分解过氧化氢能力最强，这也可以解释为什么肝脏的解毒能力是最强的。

1.9过氧化氢酶在棉针织物漂染工艺中的应用研究

过氧化氢酶在棉针织物漂染工艺中的应用，主要是在染色之前，去除氧漂后残留于纺织品及其工艺环境中的过氧化氢。它将过氧化氢分解成水和氧气, 而对纤维和染料没有影响, 因而漂白后染色前, 通H2O2分解酶去除漂白织物上和染缸中残留的过氧化氢, 以避免纤维的进一步氧化和染色时染料的氧化。同时能缩短加工时间,减少水洗用水, 降低废水量。尤其对纱线、筒子纱和针织物更为适用。　同样, 过氧化氢酶随pH 值和温度的改变, 其活力随之变化, 在pH7 左右和30～40 ℃活性最大。过氧化氢浓度增大, 会加快分解反应速度, 但必须注意当浓度大于一定量时, 酶的作用将减弱, 这样过多的残留H2O2 对纤维和染料是不利的。所以不能因为有了H2O2 分解酶, 就能任意地加大H2O2 的用量。使用时, 通常要注意H2O2 分解酶对常用表面活性剂和H2O2稳定剂的相容性, 实际生产应用pH为6～8 , 温度20～55 ℃, 酶用量5～10KCLU/ 升,时间10～20min。此技术已慢慢地被国内所认识和接受, 它对提高活性染料色泽鲜艳度很有利。　
使用过氧化氢酶的意义在于能大幅度节约水资源和其他能源的情况下，高效快速地清除氧漂后织物和水浴中残留的过氧化氢。以免残存的过氧化氢对染料的破坏，出现染色疵病。它能有效的提高染色质量，缩短工序时间，减少三废排放。
其使用方法及具体流程为：
1、放掉用过的漂液。
2、冷水清洗一次，或直接加人冷水致适合染色的浴比。
3、控制PH在6—8．温度低于50℃，建议用常温。
4、加入0.05—0.1g/L过氧化氢酶（除氧酶）（液体）（如果用于连续设备上或某些处理时间不宜过长的情况，可以分别将用量加大至0.5g/L—3g/L）。过量使用过氧化氢酶（除氧酶）不存在任何风险。
5、运转10－20分钟后，可以检测过氧化氢是否完全分解（这可以使用MERCK双氧水试纸来检测）。
6、继续在同浴中进行染色工艺。
过氧化氢酶在PH6--8和温度50℃以下时表现最佳，当过氧化氢浓度大于1000PPM时，酶的作用会减弱。 过氧化氢酶与绝大多数常用活性剂及过氧化氢稳定剂相容。
它与传统工艺比较具有一下有点：
1.节约用水，过氧化氢酶（DXT）生物净化工艺只需要一道冷洗，甚至可以不用水洗，并可以与染色工艺同浴。
2.缩短时间，氧漂生物净化工艺可在10-20分钟完成。
3.节能降耗，工艺执行过程中无须加热，工艺流程短．降低能源消耗。
4.安全染色，在这个简单易控制的工艺中，过氧化氢可以有效的被除去。 同时过氧化氢酶（除氧酶）对染料和纺织品毫无影响。
5.绿色工艺，过氧化氢被分解成天然组分水和氧气，而不生成硫酸盐或氮盐等有害物质。
下面从工艺流程和去除双氧水程度上对传统工艺和过氧化氢酶工艺（生物工艺）进行比较。

1. 工艺流程的比较

传统工艺：
用清水洗的过程：漂白        →        热水清洗        →        热水清洗        →        冷水清洗        →        冷水清洗 → 染色
用还原剂洗的过程：漂白 → 清水洗 → 还原剂还原 → 清水洗 → 染色
生物工艺（过氧化氢酶）：
漂白        →        冷水清洗        →        过氧化氢酶除氧同浴染色
从上述比较可以看出，用过氧化氢酶进行生物净化比传统工艺省出了至少2到3到水洗过程并能与染色同浴，节省处理时间50％左右，显著的降低了水的消耗，并且它反应之后产生的是H2O和O2，而不像传统工艺产生大量的硫酸盐，氮盐等有害物质。

2. H2O2残留量的比较

表3.传统工艺与生物工艺除去H2O2程度的比较
工艺条件
H2O2残余量％（owf）
漂白后
0.305
漂白后热水洗一次
0.0605
漂白后热水洗二次
0.0123
漂白后热水洗三次
0.00964
漂白后水洗一次酶处理
0.00744
漂白后直接酶处理
0.00877

由表可知，未漂白的织物上留有大量的过氧化氢，而经一次水洗后，过氧化氢含量就大为减少，二次水洗后含量就更少了，三次水洗后治含有微量的过氧化氢。这说明工厂实际生产中使用三次水洗工艺很有效，单是此工艺不仅消耗大量热能和水，还产生大量的工业污水。漂白后水洗一次再用过氧化氢酶处理，织物上的过氧化氢残留比经过三次水洗还少，而漂白后直接用酶处理效果跟漂白后再经过一次水洗酶处理效果没有多大差距，单是仍然比使用三次水洗的效果要好。因此，过氧化氢酶在漂白后代替水除去过氧化氢的工艺具有节省时间，降低能耗，减少污染的优点。因此过氧化氢酶工艺相比较传统工艺是一种更先进的工艺[12]。
需要说明的是用酶可促进漂白的进行, 羊毛在含有蛋白酶Bactosol ST的过氧化氢漂液中漂白, 可显著提高羊毛的白度和亲水性。这是由于酶促进羊毛纤维初始受到快速的浸蚀, 致使羊毛漂白较易进行。从此原理出发, 将蛋白酶对羊毛先预处理, 使纤维表面裸露, 再进行漂白, 显然效果更好, 且纤维损伤也易控制。

1.9.1 影响过氧化氢酶除去织物中过氧化氢的因素

影响过氧化氢酶除去过氧化氢的主要条件有pH，温度，酶用量等[9]。
1）pH对过氧化氢酶除去过氧化氢效果的影响：由于过氧化氢酶也是一种蛋白质，所以不同的pH值对蛋白质分子的结构会有影响，而改变酶的活性。pH过高或过低都会影响酶活性中性的有关基团的解离从而影响酶与底物的结合。实验表明，在pH值为6～10的范围内，过氧化氢酶都表现出较好的活力，但是在pH为7的时候，过氧化氢酶表现出最好的活力，催化过氧化氢的效果最好。
2）温度对过氧化氢酶除去过氧化氢效果的影响：实验表明，过氧化氢酶在50℃以下都具有良好的催化过氧化氢的效果，但是考虑到酶促反应跟一般的化学反应一样，在一定范围内随着温度的升高而剧烈，但是在温度达到一定值的时候酶会因为其自身蛋白质结构的改变而失活，所以它必然有一个最适温度，过氧化氢酶促进过氧化氢分解的最适温度是30℃。高于或低于这个温度，其催化分解过氧化氢的效果都要减弱。但是在50℃以下，过氧化氢酶的催化效果都很好。
3）酶量对过氧化氢酶催化过氧化氢效果的影响：酶是一种高效的生物催化剂，在过氧化氢酶处理过氧化氢织物的实验中，酶量使用的越大，对过氧化氢的分解效果越好，但是考虑到在酶量达到一定程度以后，酶量的增加对分解效果的影响将不再有显著增加，综合经济因素考虑，在实际生产中，用0.1％过氧化氢酶处理20分钟以上较妥。

1.10 过氧化氢酶作为食品添加剂在牛奶保鲜方面的研究

牛乳是人们的日常消费品，特别适合老人、婴幼儿和体弱者食用，因而牛乳的保鲜安全是第一位的，既要安全无毒，又要防腐效果佳。目前，国内外对鲜牛乳的杀菌一般采用热力杀菌法和化学杀菌法两种。工业生产的鲜乳，加热处理方法有3种：（1）低温长时间间歇式杀菌（LTLT）；（2）高温短时杀菌（HTST）；（3）超高温灭菌（UHT）。这三种方法的有效性都是以加热温度与时间的结合来考虑的。从微生物学的观点上来看，鲜牛乳需要进行较强的加热处理，若采用提高加热温度或延长加热时间的方法，或者两者兼用会对牛乳的色泽、滋味以及营养价值产生不良的影响，可以说热力不是一种理想的杀菌方式。
另一种被广泛应用于牛乳生产或干酪制造中的杀菌方法，是过氧化氢酶法。这种方法在杀菌后利用过氧化氢酶将剩余的过氧化氢除去，以达到食品卫生的要求。即简便实用，效果又好。但是由于强氧化剂——过氧化氢的上时间作用，对牛乳内一些有效的活性物质会因氧化而受到破坏。在过氧化氢作用的一段时间后（0.5——1小时）再加入过氧化氢酶，以除去剩余的过氧化氢，从而保护牛奶中的维生素C和其他已被氧化的物质[20]。
自上世纪60年代酶固定化技术兴起后，以过氧化氢(H2O2)作为奶保鲜剂。近年来，固定化过氧化氢酶技术保鲜奶制品的方法已被世界粮农组织和世界卫生组织批准，并确认不会对健康带来任何危害。下面就其合理使用方法进行探讨。
H2O2生奶保鲜方法本方法设计了用氧化铝吸附、用海藻酸钙包埋固定化的过氧化氢酶对生奶进行保鲜。H2O2添加量据试验，在17℃~23℃的气温下，保鲜牛奶放置不到1天就会变质，而加入0.1% H2O2，暴露于空气中可保鲜1天。若将H2O2含量分别提高到0.2%、0.4%、0.5%，暴露于空气中的保鲜时间可分别达到14天、18天、20天。
在30℃~34℃气温下，新鲜牛奶放置不到1天就会变质。若加入0.1% H2O2，暴露于空气中可保鲜1天。H2O2含量分别提高到0.14%、0.2%、0.25%、0.35%，可分别保鲜2天、7天、8天、10天。H2O2超过0.35%，由于气温高，牛奶酶的作用及H2O2自行分解，使保鲜时值不多于10天。在40℃气温下，加入0.1% H2O2