丹桃养肝丸对四氯化碳致肝纤维化大鼠的保护作用研究.pdf

丹桃养肝丸对四氯化碳致肝纤维化大鼠的保护作用研究卢芬萍胡世平唐颖慧李粉萍薛敬东叶苗青(.北京中医药大学北京.北京中医药大学深圳医院广东 深圳.陕西省中医医院陕西 西安)摘要 目目的的 观察丹桃养肝丸对四氯化碳()诱导肝纤维化大鼠的保护作用 方方法法 取 只 大鼠随机选择 只作为对照组其余大鼠采用连续 周轮替四肢内侧皮下注射 方法制备肝纤维化模型 将造模成功大鼠随机分成 组秋水仙碱组给予秋水仙碱./灌胃丹桃养肝丸高、中、低剂量组分别给予 /、/、./丹桃养肝丸灌胃对照组和模型组给予去离子水灌胃均 次/连续灌胃 大鼠处死后全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸转氨酶()、天冬氨酸转氨酶()、碱性磷酸酶()、谷氨酰转移酶()水平计算/值分离肝、脾和胸腺计算脏器指数 法检测肝组织中羟脯氨酸()含量 染色观察肝脏组织纤维化程度并根据评分标准进行评分 结结果果 与对照组相比模型组血清、水平有上升趋势/有下降趋势肝组织中 含量、肝纤维化评分均明显升高(均.)与模型组比较丹桃养肝低剂量组血清 水平丹桃养肝中、低剂量组/值秋水仙碱组和丹桃养肝高、中剂量组肝组织中 含量和肝纤维化评分均明显降低(均.)秋水仙碱组和丹桃养肝高、中剂量组胸腺指数均明显增高(均.)结结论论 丹桃养肝丸能够改善肝纤维化大鼠肝功能增强脏器免疫功能减少胶原纤维生成减轻肝纤维化损伤关键词 肝纤维化丹桃养肝丸四氯化碳大鼠:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 卢芬萍女在读博士研究生主治医师研究方向为中西医结合治疗慢性肝病通信作者 叶苗青 :.基金项目 国家中医药管理局区域中医(肝病)诊疗中心培育单位建设项目(国中医药办医政函 号)陕西省自然科学基础研究计划一般面上项目()西安市科技计划项目()陕西省创新能力支撑计划项目()(.):().:././.()()()现代中西医结合杂志 ()()/()./(.)./(.)(.).:肝纤维化是一个复杂的病理发展过程是在慢性肝病过程中由多种致病因子诱发肝内结缔组织异常增生导致肝内细胞外基质()蛋白堆积而形成的纤维性瘢痕组织一般由肝毒性损伤和胆汁淤积损伤引起 肝毒性损伤一般是由肝细胞的慢性损伤引起的如乙型肝炎和(或)丙型肝炎、酒精或代谢综合征引起的非酒精性脂肪性肝炎 胆汁淤积损伤一般是由于胆汁流动受阻而引起的如原发性和继发性胆管炎、原发性硬化性胆管炎和胆管闭锁 肝纤维化是一种可逆转的生理病理过程积极治疗可以延缓疾病发展提高患者生活质量 但目前尚未有上市的标准的抗纤维化药物因此开发安全、有效的抗肝纤维化药物是临床上亟须解决的问题 肝纤维化在中医多归为“肝着”“胁痛”等范畴 陕西省中医医院、国家名老中医专家成冬生主任医师认为肝纤维化患者多见肝血虚损、瘀血阻络证型治之当活血化瘀、养血柔肝 因此根据其多年临床经验研制出中药复方制剂丹桃养肝丸临床应用效果较好 本课题组拟以四氯化碳()诱导肝纤维化大鼠模型进一步探讨丹桃养肝丸抗肝纤维化的作用为临床应用提供客观依据 实验材料与方法 动物 只 大鼠体重 雌雄各半由西安交通大学医学院实验动物中心提供许可证号:(陕)饲养于陕西省中医药研究院中药研究所 级动物实验室中饲养环境温度 湿度 昼夜明暗交替(/)每笼 只饲养 周 本研究经陕西省中医医院伦理委员会审核通过()药物 丹桃养肝丸:陕西省中医医院肝病科提供(批号分别为)生药含量为./秋水仙碱片:云南植物药业有限公司生产国药准字 规格:./片批号:仪器与试剂低温高速离心机(型号:)可调微量移液管(规格:、上海求精生化仪器厂)电子天平(型号:精确度:.北京赛多利斯天平厂)组织研磨器(北京科实玻璃仪器有限公司)电热恒温水浴锅(型号:型北京科伟永兴仪器有限公司温度波动率.)羟脯氨酸()试剂盒(批号:南京建成生物工程研究所)(纯度.天津市天大化工实验厂)金龙鱼食用调和油(第二代产品标准号:/西安嘉里油脂工业有限公司)实验方法随机取 只大鼠作为对照组其余大鼠轮替给四肢内侧皮下注射 植物油 混悬液 /每周注射 次共 周 并分别于造模开始后 周、周、周进行随机抽检每次取对照组大鼠 只、造模大鼠 只直至造模大鼠肝组织切片出现明显的纤维增生 除去造模过程中死亡的 只和抽检的 只大鼠外将剩余的造模成功大鼠按体重随机分为模型组 只、秋水仙碱组 只、丹桃养肝高剂量组 只、丹桃养肝中剂量组 只、丹桃养肝低剂量组 只 对照组和模型组给予去离子水灌胃秋水仙碱组给予秋水仙碱./灌胃丹桃养肝高、中、低剂量组分别给予丹桃养肝丸/、/、./灌胃均 次/连续 周 检测指标及方法 血清肝酶指标水平大鼠于末次灌胃后禁现代中西医结合杂志 ()食 乌拉坦麻醉颈总动脉采血离心后取血清采用全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸转氨酶()、天冬氨酸转氨酶()、碱性磷酸酶()、谷氨酰转移酶()水平计算/值 脏器指数和肝组织中 含量取血后处死大鼠分离肝、脾和胸腺称重计算各脏器指数称 重后各组称取同一部位肝脏组织(湿重)加 生理盐水制成匀浆离心采用 试剂盒测定肝组织中 含量 肝组织病理形态及肝纤维化评分肝脏组织用 福尔马林溶液固定取材常规石蜡包埋连续切片对肝组织切片行 染色用 生物显微镜进行观察 依照以下评分标准对肝纤维化情况进行评分:级(分)无纤维化级(分)纤维结缔组织局限于汇管区或汇管区扩大级(分)纤维结缔组织增生进入肝小叶/形成不完全间隔同时有级样改变级(分)纤维结缔组织增生进入肝小叶达中央静脉周围有个别菲薄的完全间隔形成(假小叶)或较厚的不完全间隔级(分)纤维结缔组织在全小叶呈多处弥漫性增生完全间隔较厚假小叶大量形成并有级样改变 统计学方法用 .软件进行统计分析 计量资料若符合正态性分布和方差齐性数据以 表示多组间比较采用单因素方差分析组间两两比较采用 法若为非正态分布或方差不齐采用非参数检验中的 检验组间比较采用 检验 .)丹桃养肝低剂量组大鼠血清 水平和丹桃养肝中、低剂量组大鼠/值均明显低于模型组(均.)见表 表 对照组和肝纤维化各组大鼠血清肝酶指标水平比较()组别只数/(/)/(/)/(/)/(/)/对照组.模型组.秋水仙碱组.丹桃养肝高剂量组.丹桃养肝中剂量组.丹桃养肝低剂量组.注:与模型组比较.)肝组织中 含量明显升高(.)与模型组比较秋水仙碱组和丹桃养肝高、中剂量组大鼠胸腺指数均明显增高(均.)肝组织中 含量均明显降低(均 .)见表 表 对照组和肝纤维化各组大鼠脏器指数及肝组织中 含量比较()组别只数肝脏指数脾脏指数胸腺指数/(/)对照组.模型组.秋水仙碱组.丹桃养肝高剂量组.丹桃养肝中剂量组.丹桃养肝低剂量组.注:与对照组比较.与模型组比较.各组大鼠肝脏病理组织学形态及肝纤维化评分比较 对照组大鼠的肝小叶结构清晰肝细胞无明显变性、坏死肝小叶内及门管区无明显纤维组织增生及炎性细胞浸润肝纤维化评分为(.)现代中西医结合杂志 ()分 模型组大鼠肝组织内重度纤维组织增生增生的纤维组织形成纤维隔、假小叶门管区出现炎性细胞浸润肝纤维化评分为(.)分明显高于对照组(.)秋水仙碱组和丹桃养肝高、中、低剂量组大鼠肝纤维化评分分别为(.)分、(.)分、(.)分、(.)分秋水仙碱组和丹桃养肝高、中剂量组肝纤维化评分均明显低于模型组(均.)镜下见肝组织内的纤维组织增生较轻 见图 讨 论图 对照组和肝纤维化各组大鼠肝脏病理形态(染色)病毒性或代谢性慢性肝病引起的肝纤维化是全球健康面临的重大挑战 肝纤维化是影响肝脏疾病转归和引发肝细胞癌的关键因素与肝脏疾病的进展密切相关 目前肝纤维化的治疗主要以病因治疗为主如抗病毒、调节代谢紊乱、免疫抑制等尚不能完全改善肝纤维化奥贝胆酸、多烯磷脂酰胆碱等药物虽然在动物实验中显示有较好的抗肝纤维化作用但临床试验中一直存在缺陷和不足丹桃养肝丸为名中医成冬生主任医师的经验方由丹参、桃仁、当归、黄芪、枸杞子、太子参、叶下珠、柴胡组成 方中丹参、桃仁活血化瘀养血止痛凉血消肿发挥推陈致新之功不论血滞血结新瘀久瘀均可取效当归补血、活血、止痛黄芪、枸杞子、太子参益气养血柴胡疏肝解郁可引诸药入肝经叶下珠清热利湿、解毒平肝 诸药配伍共奏活血化瘀、养血柔肝之效 现代药理研究证实丹参中活性成分丹参酮 可有效降低肝脏的氧化应激反应抑制肝细胞凋亡改善肝功能同时可通过靶向调节肝星形细胞、内源性干细胞、/蛋白抑制肝纤维化 桃仁提取物可通过增加肝血流量促进、和型胶原降解阻止、型前胶原沉积抑制脂质过氧化损伤等作用预防肝纤维化的形成 黄芪具有抗衰老、抗炎、抗肺纤维化等作用环黄芪醇可通过降低糖酵解水平抑制肝纤维化的发展 当归阿魏酸可通过抑制肝星形细胞的增殖发挥抗纤维化作用 欧当归内酯 可通过抗脂质过氧化损伤改善内皮细胞功能抑制肝纤维化 枸杞多糖可以通过调节胰岛素样生长因子()和胰岛素样生长因子结合蛋白()在血液和肝组织中的表达来缓解肝纤维化损伤 柴胡皂苷 具有抑制肝星形细胞活化、减轻肝脏炎症的作用 太子参具有调节免疫、抗氧化、降血糖、抗应激等作用 叶下珠可通过抑制氧化应激和炎症反应调控 平滑肌肌动蛋白()、转化生长因子 ()蛋白表达发挥抗肝纤维化作用腹腔注射肝毒性物质 可导致肝内组织损伤及炎症引起肝纤维化的发生 肝纤维化时肝细胞损伤、坏死、释放入血血清中、水平升高二者水平可反映肝损伤情况但缺乏特异性 由于 主要位于肝细胞胞浆内主要位于肝细胞线粒体内因此轻度肝脏损伤时以 升高为主当肝细胞严重受损线粒体发生病变时会造成 升高且/值越高提示肝细胞损伤越重 本实验结果显示中、低剂量丹桃养肝丸能下调肝纤维化大鼠血清中 水平及/现代中西医结合杂志 ()值表明丹桃养肝丸对肝纤维化损伤的细胞有一定保护作用中、低剂量作用明显分析与丹桃养肝丸为中成药制剂化学成分多药理作用复杂药物在体内经肝脏代谢酶代谢后药物的吸收代谢过程相关具体的作用机制还需要进一步实验验证脏器指数是反映动物功能状态的重要指标胸腺和脾脏作为机体的免疫器官二者指数可直接反映机体的免疫功能状态 肝纤维化时导致肝细胞肿胀、炎性浸润 进而发生代偿性增生肝脏质量增加但目前没有研究证实肝指数与抗肝纤维化疗效具有直接的关系 本实验结果显示模型组的胸腺指数下降肝指数升高提示造模后胸腺萎缩肝细胞损伤丹桃养肝高、中剂量组大鼠胸腺指数均明显高于模型组提示丹桃养肝丸可上调肝纤维化大鼠胸腺指数有增强免疫作用但对肝指数影响不明显 肝组织内 含量是衡量肝脏胶原组织代谢的重要指标能客观地反映肝纤维化程度及其演变过程 本实验结果显示丹桃养肝丸可显著降低肝组织中 含量对大鼠肝纤维化具有一定的保护作用 肝组织病理染色显示模型组肝组织炎细胞渗出和纤维组织增生明显有部分形成假小叶而丹桃养肝高、中剂量组的肝纤维化程度明显轻于模型组并且肝纤维化评分明显降低表明丹桃养肝丸可改善肝纤维化大鼠肝组织损伤减轻肝纤维化程度综上所述丹桃养肝丸可改善肝纤维化大鼠肝功能提高脏器免疫功能减少胶原纤维生成减轻肝纤维化损伤抑制肝纤维化形成但其具体作用机制有待进一步研究利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 .():.:.():.:.():./.:.:.():.陆伦根尤红谢渭芬等.肝纤维化诊断及治疗共识(年).实用肝脏病杂志():.():.:.:.:.柳诗雨.基于现代文献的中医药抗乙肝肝纤维化用药规律研究.长沙:湖南中医药大学.吴红雁顾亚琴周红成等.环黄芪醇对四氯化碳致小鼠肝纤维化及糖酵解的影响.中国药房():.孙墨晗.当归阿魏酸对肝纤维化中肝星状细胞增殖的抑制作用及对、表达的影响.兰州:甘肃中医药大学.赵志敏黄恺沈丽等.欧当归内酯 对实验性纤维化肝脏 及内皮细胞功能的影响.世界中医药():.高深霍丽民韩艳珍等.枸杞多糖对肝纤维化大鼠血液及肝组织中 和 表达的影响.现代中西医结合杂志():.黄祎夏莉雷青松等.柴胡皂苷 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