胆甾醇琥珀酰基白及多糖自组装纳米粒的制备及其表征.pdf

论 著基金项目:国家自然科学基金项目,N o.8 1 1 7 3 5 5 9;吉林省科技发展计划项目,N o.2 0 2 1 0 2 0 4 0 1 2 Y Y作者简介:赵文萃,硕士,副主任药师。研究方向:药学新技术与新剂型。E-m a i l:z h a o w e n c u i 2 0 8 1 2 6.c o m作者单位:1 3 0 0 0 0 吉林长春,联勤保障部队第九六四医院;1 3 0 0 0 0 吉林长春,长春市人民医院;1 3 0 0 0 0 吉林长春,长春市急救中心;1 3 0 0 0 0 吉林长春,长春市口腔医院通信作者:王 莹,主任医师。E-m a i l:1 3 0 4 9 7 4 7 9 0q q.c o m胆甾醇琥珀酰基白及多糖自组装纳米粒的制备及其表征赵文萃,赵庆兰,赵洪昌,王 莹 摘 要 目的 利用白及多糖的疏水改性技术,将其自组装成具有良好性能的纳米粒。方法 采用透析法制备胆甾醇琥珀酰基白及多糖自组装纳米粒。通过稳态荧光探针法、透射电镜、动态光散射、X射线衍射以及差示扫描量热法对白及多糖及其衍生物进行物理表征。结果 经稳态荧光探针法测定不同取代度胆甾醇琥珀酰基白及多糖-临界胶束浓度分别为0.0 7 9 4、0.0 3 9 8、0.0 3 1 6 m gm l-1,结果表明取代度越大临界胶束质量浓度越小;对透射电镜、动态光散射纳米粒子的形态特征及粒径进行了表征,表明取代度越大,纳米粒子粒径越小。通过X射线衍射和差示扫描量热法的物理表征,结果表明胆甾醇琥珀酸酯是小分子晶体,白及多糖、胆甾醇琥珀酰基白及多糖及其纳米粒结晶性较差。结论 本方法成功制备了胆甾醇琥珀酰基白及多糖自组装纳米粒,制备方法简单可靠,为后续进一步研究奠定基础。关键词 白及多糖;胆甾醇琥珀酰基白及多糖;疏水改性;自组装纳米粒 中图分类号 R 9 4 3 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 8-9 9 2 6(2 0 2 3)4-0 2 8 3-0 4 D O I 1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 8-9 9 2 6.2 0 2 3.0 4.0 0 1P r e p a r a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f C h o l e s t e r o l S u c c i n y l B l e t i l l a S t r i a t a P o l y s a c c h a r i d e S e l f-a s s e m b l e d N a n o p a r t i c l e sZ HAO W e n-c u i,Z HAO Q i n g-l a n,Z HAO H o n g-c h a n g,WANG-Y i n gT h e 9 6 4 t h H o s p i t a l o f J o i n t L o g i s t i c S u p p o r t F o r c e o f P L A,C h a n g c h u n 1 3 0 0 0 0,C h i n a;C h a n g c h u n P e o p l e s H o s p i t a l,C h a n g c h u n 1 3 0 0 0 0,C h i n a;C h a n g c h u n M e d i c a l C e n t e r,C h a n g c h u n 1 3 0 0 0 0,C h i n a;C h a n g c h u n O r a l H o s p i t a l,C h a n g c h u n 1 3 0 0 0 0,C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e T o p r e p a r e s e l f-a s s e m b l e d n a n o p a r t i c l e s f r o m B l e t i l l a S t r i a t a p o l y s a c c h a r i d e w i t h f a v o r a b l e p h y s i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s v i a h y d r o p h o b i c m o d i f i c a t i o n.M e t h o d s T h e c h o l e s t e r o l s u c c i n y l B l e t i l l a S t r i a t a p o l y s a c c h a r i d e s e l f-a s s e m b l e d n a n o p a r t i c l e s w e r e p r e p a r e d t h r o u g h d i a l y s i s.T h e p r o d u c t a s w e l l a s i t s d e r i v a t i v e s w a s c h a r a c t e r i z e d u s i n g t h e s t e a d y-s t a t e f l u o r e s c e n c e p r o b e m e t h o d,t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p e i m a g i n g,d y n a m i c l i g h t s c a t t e r i n g,X-r a y d i f f r a c t i o n a n d d i f f e r e n t i a l s c a n n i n g c a l o r i m e t r y.R e s u l t s T h e c r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n s o f c h o l e s t e r o l s u c c i n y l B l e t i l l a S t r i a t a p o l y s a c c h a r i d e w i t h d i f f e r e n t d e g r e e s o f s u b s t i t u t i o n w e r e d e t e r m i n e d a s 0.0 7 9 4,0.0 3 9 8 a n d 0.0 3 1 6 m gm l-1 b y t h e s t e a d y-s t a t e f l u o r e s c e n c e p r o b e m e t h o d,w h i c h d e m o n s t r a t e d a n e g a t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n c r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n s a n d d e g r e e s o f s u b s t i t u t i o n.T h e r e s u l t s f r o m t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p e i m a g i n g a n d d y n a m i c l i g h t s c a t t e r i n g i n d i c a t e d n e g a t i v e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n d e g r e e s o f s u b s t i t u t i o n a n d p a r t i c l e s i z e.A l t h o u g h t h e c h o l e s t e r y l s u c c i n a t e a p p e a r e d t o b e s m a l l m o l e c u l e c r y s t a l s,t h e c r y s t a l l i n i t y o f B l e t i l l a S t r i a t a p o l y s a c c h a r i d e a n d i t s c h o l e s t e r o l s u c c i n y l d e r i v a t i v e s w a s p o o r b e f o r e a n d a f t e r f o r m a t t i n g n a n o p a r t i c l e s a c c o r d i n g t o t h e X-r a y d i f f r a c t i o n a n d d i f f e r e n t i a l s c a n n i n g c a l o r i m e t r y r e a d o u t.C o n c l u s i o n T h e c h o l e s t e r o l s u c c i n y l B l e t i l l a S t r i a t a p o l y s a c c h a r i d e s e l f-a s s e m b l e d n a n o p a r t i c l e s a r e p r e p a r e d i n a s i m p l e a n d r e l i a b l e p r e p a r a t i o n p r o c e s s.K e y w o r d s B l e t i l l a S t r i a t a p o l y s a c c h a r i d e;c h o l e s t e r o l s u c c i n y l B l e t i l l a S t r i a t a p o l y s a c c h a r i d e;h y d r o p h o b i c m o d i f i c a t i o n;s e l f-a s s e m b l e d n a n o p a r t i c l e s382 解放军药学学报2 0 2 3年8月2 5日 第3 6卷 第4期 P h a r m J C h i n P L A,V o l.3 6,N o.4,A u g 2 5,2 0 2 3 由于白及多糖具有亲水性,容易被水分解,因此其控释效果较差。此外,由于白及多糖的分子中没有疏水基团,它的载药性能较差。为扩大其应用范围,提高生物利用度,可对白及多糖疏水改性,改变其理化性质,成为双亲性聚合物,并制备自组装纳米粒,成为难溶性药物的载体,疏水改性天然多糖是当前超分子自组装研究的热点 1-5。本研究对白及多糖胆甾醇化进行疏水改性,并将其自组装成具有良好性能的纳米粒,形成具有良好亲水性能的内核和外壳,并将其作为一种药物载体,有效地容纳难溶性药物,从而拓展白及多糖的应用领域。1 材料1.1 仪器 C P 2 2 5 D微量电子天平(北京赛多利斯仪器系统公司);7 9-2型双向磁力搅拌器(江苏荣华仪器制造有限公司);XW-8 0 A涡旋混合器(上海医科大学仪器厂);T H Z-8 2水浴恒温振荡器(金坛市华城创威实验仪器厂);R F 5 3 0 1 P C荧光分光光度计(日本岛津公司);UH-5 0 0 B超声波细胞粉碎仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);D 8-A D V A N C E广角X射线衍射仪(德国B R U K E R公司);P y r i s D i a m o n d T G/D T A热重/差热综合热分析仪(美国P E公司)。1.2 试 药 白 及 多 糖、胆 甾 醇 琥 珀 酸 酯(c h o l e s t e r o l s u c c i n a t e,CH S)联勤保障部队第九六四医院实验室自制;琥珀酸酐(天津市光复精细化工研究所);胆甾醇(北京鼎国生物技术公司);4-二甲氨基吡啶(天津市凯玛生化科技有限公司);1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(上海源叶生物科技有限公司);其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 胆甾醇琥珀酰基白及多糖的合成 取一定量的CH S、4-二甲氨基吡啶(DMA P,DMA P/CH S=1,mm o l/mm o l)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二 亚 胺 盐 酸 盐(E D C,E D C/CH S=1.2,mm o l/mm o l),加入二甲基亚砜2 0 m l使溶解,在室温下条件下,用磁力搅拌进行2 h的活化处理;精密称取适量的白及多糖样品,加入二甲基亚砜超声至完全溶解,将处理过的活化反应液缓慢混合至白及多糖溶液中,继续在室温下搅拌4 8 h后停止反应。接下来将反应液加入无水乙醇5 0 0 m l中,静置24 h至有白色沉淀析出,抽滤。将沉淀物依次用乙醇、四氢呋喃和乙醚洗涤,8 0 下真空干燥,得到胆甾醇琥珀酰基白及多糖(CH S B),通过调整CH S的用量,制备不同取代度CH S B,利用核磁共振技术测定取代度,记CH S B 1、CH S B 2、CH S B 3取代度分别为3.3 4%、6.2 3%、7.9 8%6-8。2.2 C H S B自组装纳米粒的制备 采用透析法9制备自组装纳米粒,精密称取2.1项下合成的C H S B 1、C H S B 2、C H S B 3样品各1 0 m g,置于二甲基亚砜2 m l中充分溶解,将溶液转移至透析袋(Mw 1 0 0 0 0)放置于2 L烧杯中,以蒸馏水为媒介透析4 8 h,前1 2 h每隔6 h换1次水,后3 6 h每隔9 h换1次水,直至将二甲基亚砜溶剂彻底透析干净。透析完毕,取出透析袋内溶液,在冰浴中用探头超声仪小功率超声2 m i n,重复2次,溶液转入量瓶内定容至1 0 m l。用0.4 5 m的微孔滤膜滤过,得到不同取代度的C H S B自组装纳米粒溶液,放置于冰箱4 冷藏备用。2.3 CH S B自组装纳米粒临界胶束浓度测定 精密称取芘1 2.3 m g置1 0 m l量瓶中,加入丙酮1 0 m l充分混合,取1 m l上述液体定容至1 0 0 m l,摇匀得6 0 m o lL-1芘的丙酮溶液。在试管内加入浓度为6 0 m o lL-1芘的丙酮溶液,氮气吹干,试管底部形 成 一 层 芘 膜。再 分 别 加 入 浓 度 为0.0 0 0 1、0.0 0 0 3、0.0 0 0 6、0.0 0 1、0.0 0 3、0.0 0 6、0.0 1、0.0 3、0.0 6、0.1、0.3、0.6、1 m gm l-1的CH S B 1、CH S B 2、CH S B 3纳米粒溶液,使芘最 终浓度定为0.6 m o lL-1。于3 7 水浴恒温振荡1 h,再超声1 h,避光放置过夜。采用荧光分光光度计测定,激发波长3 3 4 n m,发射和激发缝宽分别为3 n m和5 n m,扫描范围3 5 04 5 0 n m,得到芘的荧光发射光谱。记录3 7 3 n m和3 9 3 n m处的荧光吸收强度为I3 7 3和I3 9 3,以 白 及 多 糖 纳 米 粒 质 量 浓 度(C,m gm l-1)的对数值l gC为横坐标,I3 7 3/I3 9 3比值为纵坐标作图,计算临界胶束浓度。采用稳态荧光探针法1 0,测定3种取代度的CH S B自组装纳米粒的临界胶束浓度。当纳米粒浓度较低时,I3 7 3/I3 9 3比值基本没有变化,当纳米粒浓度增大时,产生1个突变点,I3 7 3/I3 9 3比值随着浓度的增大而直线下降,这是由于纳米粒形成后,芘从水中向纳米粒疏水内核中转移的量不断增加,溶液环境极性发生改变。通过对曲线进行线性拟合取交点,即 可 得 到CH S B的 临 界 胶 束 浓 度。CH S B 1、CH S B 2、CH S B 3的临界胶束浓度分别为0.0 7 9 4、0.0 3 9 8、0.0 3 1 6 m gm l-1。2.4 C H S B自组装纳米粒的形态观察 将0.5 m gm l-1浓度的C H S B 1、C H S B 2、C H S B 3纳米粒水溶液滴到铜网上,自然干燥,于透射电镜下进行观测。见图1。482 解放军药学学报2 0 2 3年8月2 5日 第3 6卷 第4期 P h a r m J C h i n P L A,V o l.3 6,N o.4,A u g 2 5,2 0 2 3 A:CH S B 1;B:C H S B 2;C:C H S B 3。图1 C H S B纳米粒透射电镜图 通过透射电镜图可以看出,CH S B 1、CH S B 2、CH S B 3自组装纳米粒粒径在7 7.9 01 6 3.6 9 n m;形成的纳米粒粒径随着取代度的增大而越小,并且纳米粒的分散性较好。2.5 动态光散射测定纳米粒粒径 CH S B自组装纳米粒的粒径根据动态光散射原理,采用动态光散射粒度仪测定制备的CH S B 1、CH S B 2、CH S B 3纳米溶液粒径分布,每个样品重复测定3次。见图2。CH S B 1、CH S B 2、CH S B 3纳米溶液通过动态光散射测得平均粒径分别为2 5 5.0、1 9 0.1、1 6 4.2 n m,测得结果比透射电镜的结果偏大。2.6 白及多糖及衍生物的X射线衍射表征 称取少量白及多糖、CH S、CH S B及CH S B纳米粒置于样品板,采用D 8 A D VAN C E广角X射线衍射仪测定样品的X射线晶体衍射图谱。检测条件:C u靶;检测波长:1.5 4,见图3。由 图 可 知CH S是 小 分 子 结 晶 物 质,在2 为6.3 8、1.5 2、1 4.4 0、1 5.4 3、1 6.8 3、1 9.1 0、2 0.9 8、A:C H S B 1;B:CH S B 2;C:C H S B 3。图2 C H S B纳米粒粒径分布直方图A:C H S;B:白及多糖;C:C H S B;D:C H S B纳米粒。图3 白及多糖及衍生物的 X射线晶体衍射图2 3.3 2 有晶体衍射峰,在2 5 4 5 有很多小晶体峰;白及多糖在1 3 有较宽的衍射峰;C H S B在1 2.5 有1个较宽衍射峰;C H S B纳米粒没有明显衍射峰。可以得知白及多糖、C H S B、C H S B纳米粒均没有良好的结晶性。2.7 白及多糖及衍生物的差示扫描量热法(D S C)表征 称取少量白及多糖、C H S、C H S B及C H S B自组装纳米粒压片密封,以1 0 m i n-1的速度升温,加热样品至2 0 0,记录样品D S C曲线。见图4。由D S C图谱可知CH S在1 2 0 左右有吸热峰,是小分子结晶物质,白及多糖的结晶性较差,在8 2 左 右 有 宽 吸 热 峰,CH S B和CH S B纳 米 粒在8 5 左右有吸热峰且位置很接近,与白及多糖吸热峰位置比较有些变化。582 解放军药学学报2 0 2 3年8月2 5日 第3 6卷 第4期 P h a r m J C h i n P L A,V o l.3 6,N o.4,A u g 2 5,2 0 2 3 A:C H S B;B:C H S B纳米粒;C:白及多糖;D:C H S。图4 白及多糖及衍生物的D S C曲线图3 讨论 自组装纳米粒的形成机制,透析法是指当水与有机溶剂交换时,疏水改性多糖的亲水基团会进行重新排列,胆甾醇基团之间通过疏水键或者氢键而发生聚拢,形成疏水结构域,而多糖分子为获得在水溶液中的最小能量状态,分子主链发生卷曲,形成包裹疏水结构域的亲水外壳,并最终组装形成具有多核结构的凝胶微粒或纳米粒子1 1。然而纳米粒子之间具有一定的相互作用,制备的纳米粒粒径偏大,为得到相对较小且均一的纳米粒,还需用小功率的超声对其进行分散。查阅相关文献得知,改性多糖疏水结构域是由于多糖和疏水基团连接后,多糖性质发生了改变。制备成纳米粒的过程中,疏水基团发生自聚集,多糖的亲水基团进而对其包裹,在水中达到稳定状态,形成自组装纳米粒1 2。由于透析法方法简单、易于操作、材料损失较少,大部分改性多糖自组装纳米粒的制备都采用透析法,并且改性后的多糖衍生物易溶于二甲基亚砜,透析过程中可通过溶剂交换形成相对均一的自组装纳米粒。本研究通过透析法制成3种不同取代度的CH S B自组装纳米粒。通过采用稳态荧光探针法,测定CH S B自组装纳米粒的临界胶束浓度。原理是利用探针在某种特殊环境下产生的物化特征,来测定一些物质的结构或者某些体系的物化过程。芘通常用作测定两亲性聚合物自组装行为的探针。目前芘荧光探针法是测定临界胶束浓度最准确、灵敏的方法之一。芘对于微环境比较敏感,当芘从非极性介质转变到极性介质中时,其荧光强度会发生很大变化。通常可根据质量浓度及I3 7 3/I3 9 3比值确定临界胶束浓度。疏水改性白及多糖在自组装纳米粒过程中,形成亲水性外壳和疏水性内核,不同浓度疏水改性白及多糖对芘的 增 溶 能 力 不 同。随 着 纳 米 粒 浓 度 的 增 大,I3 7 3/I3 9 3比值会有1个突变值,即临界胶束浓度也叫临界聚集浓度。对曲线走势绘制其交点对应浓度即为CH S B样品的临界胶束浓度。本研究中CH S B 1、CH S B 2、CH S B 3临 界 胶 束 浓 度 分 别 为0.0 7 9 4、0.0 3 9 8、0.0 3 1 6 m gm l-1。随着胆甾醇取代度的增加,临界胶束浓度值越小。参考文献1 Z HAN G G,Q I AO J,L I U X,e t a l.I n t e r a c t i o n s o f s e l f-a s s e m-b l e d b l e t i l l a s t r i a t a P o l y s a c c h a r i d e n a n o p a r t i c l e s w i t h B o v i n e S e r u m A l-b u m i n a n d b i o d i s t r i b u t i o n o f i t s d o c e t a x e l-l o a d e d n a n o p a r t i c l e sJ.P h a r m a c e u t i c s,2 0 1 9,1 1(1):4 3.2 曹庆龙,吴 浩,高文婧,等.疏水改性乳清分离蛋白-普鲁兰多糖复合气凝胶的制备及性能研究J.食品工业科技,2 0 2 2,4 3(1):1 2 7-1 3 3.3 赵 丽.疏水改性普鲁兰多糖的制备、性质及作为纳米载体的研究D.无锡:江南大学,2 0 2 2.4 P R A S HE R P,S HA RMA M,MEHT A M,e t a l.C u r r e n t-s t a-t u s a n d a p p l i c a t i o n s o f p o l y s a c c h a r i d e s i n d r u g d e l i v e r y s y s t e m sJ.C o l l o i d I n t e r f a c e S c i,2 0 2 1,4 2:1 0 0 4 1 8.5 U S MAN M,Z HAN G C,P A T I L P J,e t a l.P o t e n t i a l a p p l i c a-t i o n s o f h y d r o p h o b i c a l l y m o d i f i e d i n u l i n a s a n a c t i v e i n g r e d i e n t i n f u n c t i o n a l f o o d s a n d d r u g s A r e v i e wJ.C a r b o h y d r P o l y m,2 0 2 1,2 5 2:1 1 7 1 7 6.6 成 念,赵文萃,张 琦,等.用疏水改性的白及多糖制备载紫杉醇纳米 粒 并 对 其 表 征 J.药 学 实 践 杂 志,2 0 1 7,3 5(1):4 8-5 3.7 王艳萍,刘福强,刘天娇,等.白及多糖疏水改性后胆甾醇取代度的测定方法J.解放军药学学报,2 0 1 5,3 1(4):2 8 5-2 8 7.8 黄小倩,李佳琪,孙家会,等.多糖的修饰及其改善乳化性能的研究进展J.食品工业科技,2 0 2 3,4 4(9):4 3 7-4 4 5.9 赵文萃,张 琦,刘福强,等.疏水改性白芨多糖自组装载紫杉醇纳 米 粒 抗 小 鼠 肝 癌 作 用 J.中 成 药,2 0 1 9,3 9(7):1 5 1 2-1 5 1 4.1 0 周 亭,杨世超,张志庆,等.芘荧光探针法测定表面活性剂聚集体参数实验研究J.实验技术与管理,2 0 1 8,3 5(1):5 3-5 6.1 1 王 蕾,曹雪晓,栗焕焕,等.中药化学成分的分子识别与自组装在中药研究中的应用J.中草药,2 0 2 0,5 1(2):5 1 6-5 2 1.1 2 邹佳峰,朱志红,李范珠,等.B o x-B e h n k e n响应面法优化疏水改性普鲁兰纳米粒的制备工艺J.中国药学杂志,2 0 1 9,5 4(1 4):1 1 5 4-1 1 6 1.(收稿日期:2 0 2 3-0 3-2 4;修回日期:2 0 2 3-0 6-1 9)(本文编辑 吴 艳)682 解放军药学学报2 0 2 3年8月2 5日 第3 6卷 第4期 P h a r m J C h i n P L A,V o l.3 6,N o.4,A u g 2 5,2 0 2 3