大黄鱼slitrk3基因启动子克隆及转录调控分析.pdf

DOI:10.12131/20220309文章编号：2095 0780（2023）04 0068 09大黄鱼 slitrk3 基因启动子克隆及转录调控分析周锐涛，岳珠峰，纪焦军，温 靖，姜 丹，王志勇，方 铭集美大学 水产学院/农业农村部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门 361021摘要：神经突触相关蛋白Slitrk3具有调节抑制性突触发育的作用。研究大黄鱼(Larimichthys crocea)神经突触黏附分子slitrk3基因的转录调控机制，可为解决大黄鱼养殖面临的生长、应激及抗逆等问题提供新思路。通过生物信息学方法对大黄鱼及其他物种的Slitrk3氨基酸进行多重序列比对和系统进化树分析，并预测大黄鱼slitrk3基因启动子区域相关的调控元件，采用双荧光素酶报告基因系统检测大黄鱼slitrk3基因启动子区域的转录活性。生物信息学分析结果显示，Slitrk3氨基酸序列在鱼类中具有较高的保守性；大黄鱼slitrk3基因启动子区域预测存在2个潜在的转录起始位点、2个CpG岛以及Sp1、GR、C/EBP和C/EBP等多种转录因子结合位点。双荧光素酶报告基因系统结果显示，大黄鱼slitrk3基因启动子区域的19701614 bp、1210667 bp存在正调控元件，16141210 bp、667376 bp、376147bp存在负调控元件，推测147+16 bp为核心启动子。关键词：大黄鱼；slitrk3 基因；启动子；转录调控中图分类号：S 917.4文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Cloning and transcriptional regulation of slitrk3 gene promoter in largeyellow croaker(Larimichthys crocea)ZHOU Ruitao,YUE Zhufeng,JI Jiaojun,WEN Jing,JIANG Dan,WANG Zhiyong,FANG MingFisheries College of Jimei University/Key Laboratory of Healthy Mariculture in the East China Sea,Ministry of Agriculture and RuralAffairs,Xiamen 361021,ChinaAbstract:Slitrk3,a neurosynaptic-related protein,can regulate the development of inhibitory synapses.To explore the tran-scriptional regulation mechanism of slitrk3 gene of the large yellow croaker(Larimichthys crocea)can provide a new idea forsolving the problems of growth,stress and anti-stress in the L.crocea culture.We conducted a multiple sequence alignment anda phylogenetic tree analysis of amino acids for Slitrk3 in L.crocea and other species to investigate the transcriptional regulationmechanism of the neural cell adhesion molecule for slitrk3 gene.Besides,we predicted the potential core promoter regions,CpGislands and transcription factor binding sites of slitrk3 gene by bioinformatics methods,and detected the Luciferase activity ofpromoter of slitrk3 gene by the Dual-Luciferase Reporter System.Bioinformatics analysis shows that the amino acid sequences ofSlitrk3 were highly conserved in fish.There were two transcription start sites,two CpG islands,and multiple transcription factorbinding sites such as Sp1,GR,C/EBP and C/EBP in promoter of slitrk3 gene.Dual-Luciferase Reporter System shows that theregions from 1970 to 1614 bp and from 1 210 to 667 bp contained positive regulatory elements;while the regions from 1614to 1210 bp,from 667 to 376 bp and from 376 to 147 contained negative regulatory elements;and the regions from 147to+16 bp might be core promoter of slitrk3 gene.The results lay a theoretical foundation for the further study of transcriptional第 19 卷第 4 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.42023 年 8 月South China Fisheries ScienceAug.，2023收稿日期：2022-12-04；修回日期：2023-02-27基金项目：国家重点研发计划项目(2018YFD0901201)作者简介：周锐涛(1998)，男，硕士研究生，研究方向为水产动物遗传与育种。E-mail:通信作者：方铭(1979)，男，教授，博士，研究方向为水产动物遗传与育种。E-mail:regulation mechanism of slitrk3 gene in L.crocea.Keywords:Larimichthys crocea;slitrk3 gene;Promoter;Transcriptional regulationSlitrk3 是 Slitrk 家族成员之一，Slitrk 家族目前在哺乳动物中共发现 6 名成员，分别为 Slitrk1Slitrk6，该家族主要参与控制神经突起的生长1。Slitrk 家族的结构包含 2 个富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat,LRR)结构域和 1 个羧基端酪氨酸残基结构域，因其两者保守结构域与轴突导向因子 SLIT 和神经营养因子受体 NTRK 高度同源而被命名为 Slitrk2。不同种类的 Slitrk 蛋白对神经突起生长有不同作用。Slitrk1 能够促进神经突起的生长发育，而 Slitrk2 则会抑制其生长3；Slitk3Slitrk6 广泛分布于脑组织的不同部位，可能协同Slitrk1 和 Slitk2 调节脑不同区域神经细胞的分化和神经突起的生长4。Slitrk3 作为突触后黏附分子，通过与轴突受体酪氨酸磷酯酶(Receptor tyrosinephosphatases,RPTP)相互作用，进一步调节抑制性突触发育，对正常功能性-氨基丁酸能神经元(GABAergic neurons)突触发育具有重要作用5。slitrk3基因在斑马鱼(Danio rerio)早期胚胎中的大脑增殖区和视网膜上均有表达，研究表明其在细胞增殖、迁移以及新神经元的诞生中发挥功能性作用6。-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)是一种能够介导突触传递、调节神经网络发育的关键抑制性神经递质7，其具有降血压、镇痛、抗焦虑以及抗癫痫等生物活性8。同时，GABA 在鱼类生长、抗氧化能力、应激反应、免疫功能等方面发挥重要作用9-11。大黄鱼是我国目前养殖规模最大的海水鱼类，但在养殖过程中，其对操作胁迫的应激反应相当敏感和激烈，剧烈的应激反应不利于其生长及抗逆。因此，研究 slitrk3 基因的转录水平可为解决大黄鱼养殖所面临的生长、应激及抗逆等问题提供一种新思路。转录水平的调控是基因表达过程中最重要、最复杂的环节。启动子通常是一段位于结构基因 5端上游区的 DNA 序列，能够激活 RNA 聚合酶，使之与模板 DNA 准确地结合并具有转录起始的特异性。核心启动子通常为能够准确指导 RNA 聚合酶启动转录的最小 DNA 序列12，其被认为是复杂基因表达网络中的重要调控模块13。转录因子是一组可直接或间接与顺式作用元件结合并调控基因转录效率的蛋白14。目前 slitrk3 基因在哺乳动物中的研究较多，而鱼类 slitrk3 基因的转录水平研究鲜有报道。因此，为了深入探究鱼类 slitrk3 基因的转录调控机制，本研究以大黄鱼(Larimichthys crocea)为实验材料，对大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列进行多重序列比对和系统进化树分析，通过预测大黄鱼slitrk3 基因潜在的转录起始位点、CpG 岛和转录因子结合位点，推测其对启动子活性的影响；构建大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段的重组载体并测定转录活性，确定启动子区域内的转录调控元件，为更好地阐明大黄鱼 slitrk3 基因的表达调控机制提供理论依据。1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用大黄鱼来自宁德市官井洋大黄鱼养殖有限公司；DH5 Competent E.coli Strain 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；HEK293T 细胞为本实验室保存。1.2 主要试剂琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、无内毒素质粒小量提取试剂盒均购自北京天漠科技开发有限公司；DNA 提取试剂盒(FastPure Cell/Tissue DNAIsolation Mini Kit)、高保真酶(2 Phanta MaxMaster Mix)、一步克隆试剂盒(ClonExpress II OneStep Cloning Kit)、无内毒素质粒大量提取试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA Mark-er、Loading Buffer、限制性内切酶 Sac I 和 HindIII 均购自 TaKaRa；氨苄青霉素(Amp)购自上海翊圣生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco 公司；PBS 缓冲液、胰蛋白酶消化液和DMEM High Glucose 均购自 BI 公司；双抗(Peni-cillin 10000 IUmL1-Streptomycin 10 mgmL1)购自MP 公司；化学发光试剂盒(BeyoECLPlus)、双萤光素酶报告基因检测试剂盒、转染试剂(Lipo8000)均购于碧云天生物技术有限公司；pGL3-Basic、pRL-TK 载体由本实验室保存。1.3 方法1.3.1生物信息学分析通过 NCBI 的 GenBank 数据库获得大黄鱼及第 4 期周锐涛等:大黄鱼 slitrk3 基因启动子克隆及转录调控分析69其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列(表 1)，采用 Meg-Ailgn 软件中的 Clustal W 进行多重序列比对，同时使用 MEGA 11 软件中的近邻相接法，设置 boot-strap 重复 1 000 次，构建大黄鱼及其他物种的Slitrk3 氨基酸序列系统进化树。利用在线分析软件 BDGP(http:/www.fruitfly.org/seq_tools/pro-moter.html)设置 Minimum promoter score 为 0.8，预测 slitrk3 基因潜在转录起始位点，利用在线分析软件 Methprimer(http:/www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)设置 length100，Obs/Exp0.6，GC%50%，预测 slitrk3 基因潜在的 CpG 岛。利用在线分析软件 AliBaba2.1(http:/gene- pairsim to known sites 为 64，matrix con-servation 为 80%，预测 slitrk3 基因潜在转录因子结合位点。1.3.2引物设计根据生物信息学分析的结果，利用 Primerpremier 6.0 软件设计大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段扩增引物(表 2)，引物合成均由北京擎科生物科技有限公司完成。1.3.3slitrk3 基因启动子不同长度片段的扩增以提取大黄鱼腹鳍组织的 DNA 为模板，根据设计的扩增引物进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为10 L：DNA 模板 1 L，2PCR Mix 预混液 5 L，上下游引物各 0.2 L，ddH2O 3.6 L。PCR 反应程序：94 预变性 5 min；94 变性 15 s，58 退火 10 s，72 延伸 2 min，35 个循环；72 再延伸10 min。取 PCR 扩增产物进行 1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测。表1 大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列的GeneBank 登录号Table 1 GeneBank ID of amino acid sequences ofSlitrk3 in L.crocea and other species物种SpeciesGeneBank登录号GeneBank ID大黄鱼 Larimichthys croceaXP_010750353.1棘头梅童鱼 Collichthys lucidusTKS81208.1金钱鱼 Scatophagus argusXP_046245335.1大西洋鲷 Sparus aurataXP_030298892.1黃鲈 Perca flavescensXP_028430026.1大鳍弹涂鱼 Periophthalmus magnuspinnatusXP_033832314.1斑马鱼 Danio rerioXP_021323398.1大鼠 Rattus norvegicusNP_001101153.1小鼠 Mus musculusNP_001344780.1智人 Homo sapiensNP_001305739.1表2 大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段的扩增引物Table 2 Primers used for fragments amplification primers of L.crocea slitrk3 gene引物Primer序列(53)Sequence(53)扩增区域Amplification region/bp产物大小Amplification size/bpslitrk3-P1F:ctatcgataggtaccGAGCTCATCCGTAGCTCATTCACATGC1970+162029R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCGslitrk3-P2F:ctatcgataggtaccGAGCTCGCGGAATCAATCATTTCTGGA1614+161673R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCGslitrk3-P3F:ctatcgataggtaccGAGCTCGAATCCTCGATCAGCCGATGT1210+161269R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCGslitrk3-P4F:ctatcgataggtaccGAGCTCCAAACTGACACCTATTTTTCC667+16726R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCGslitrk3-P5F:ctatcgataggtaccGAGCTCTGTCTGAGTGGAGAGATTTGT376+16435R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCGslitrk3-P6F:ctatcgataggtaccGAGCTCCTTTGTGAGGGTGTGTGTATC147+16206R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG注：单下划线为 Sac I 酶切位点，下划线为 Hind III 酶切位点，小写字母为质粒同源序列。Note:The single underline are the Sac I restriction enzyme digestion sites;the underline is the Hind III restriction enzyme digestion site;and thelowercase letters are the plasmid homologous sequences.70南 方 水 产 科 学第 19 卷1.3.4slitrk3 基因启动子不同长度片段双荧光素酶报告基因质粒构建按照胶回收试剂盒说明书要求对 PCR 扩增产物进行胶回收纯化；利用限制性内切酶 Sac I 和Hind III 对载体 pGL3-Basic 进行酶切线性化处理；酶切线性化反应体系为 40 L：Sac I 和 Hind III 各1 L，Buffer 4 L，载体 4 L，ddH2O 24 L。酶切线性化反应条件：37 酶切 1 h，65 终止 20 min。将线性化的 pGL3-Basic 进行琼脂糖凝胶电泳后，按照胶回收试剂盒说明书要求进行胶回收纯化；根据一步克隆试剂盒说明书要求将纯化后的 slitrk3 基因启动子不同长度片段分别与线性化的 pGL3-Ba-sic 载体进行重组反应，然后转化至大肠杆菌 DH5感受态细胞中，在含 Amp 的 LB 固体培养基上进行筛选，37 恒温培养箱中培养约 12 h；挑取单个菌落并接种至含 Amp 的 LB 液体培养基中，37 恒温摇床培养约 12 h；按照质粒提取试剂盒说明书要求提取质粒并酶切鉴定，产物进行 1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定成功后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将构建成功后的重组质粒分别命名为 pGL3-slitrk3-P1pGL3-slitrk3-P6。扩大培养重组质粒的菌株，并使用无内毒素质粒大量提取试剂盒提取重组质粒备用。1.3.5slitrk3 基因启动子双荧光素酶报告基因系统活性检测待培养 HEK293T 细胞密度达到 2106个细xsx胞孔1时，将其接种至含 10%胎牛血清的 DMEM培养基的 24 孔板中，置于恒温培养箱中 5%二氧化碳(CO2)，37 培养过夜。待细胞密度达到80%90%时，使用 Lipo8000转染试剂参照使用说明书将构建好的的重组载体质粒 pGL3-slitrk3-P1pGL3-slitrk3-P6 与内参载体质粒 pRL-TK 按401 共转染到 HEK293T 细胞内，以 pGL3-Ba-sic 作为空白对照，24 h 后收集细胞，进行双荧光素酶荧光检测；每个样品设 3 个平行。使用 SPSS25.0 对不同样品间的报告基因的萤光素酶活性进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和 Tukey 多重比较，计算出样本间的差异；所有数据均表示为“平均值标准误()”，P0.05 表示差异显著，P0.01 表示差异极显著。2 结果 2.1 生物信息学分析2.1.1Slitrk3 氨基酸序列多重序列比对利用 MegAilgn 软件中的 Clustal W 对大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列进行多重序列比对分析，结果显示大黄鱼与棘头梅童鱼(Collichthyslucidus)的一致性高达 99.7%，与其他 5 种鱼类的一致性介于 89.2%99.0%；大黄鱼与哺乳动物中的大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)和智人(Homo sapiens)的一致性分别为 76.6%、76.5%和 76.2%(图 1)。结果显示，Slitrk3 氨基酸序列在鱼类中具有较高的一致性。2.1.2Slitrk3 氨基酸序列系统进化树利用 MEGA 11 软件构建大黄鱼及其他物种的Slitrk3 氨基酸序列系统进化树。结果显示，大黄鱼与棘头梅童鱼同为一支，说明两者的亲缘关系最近，具有较高的同源性；智人与大鼠和小鼠成簇，说明 Slitrk3 氨基酸序列在哺乳动物中高度保守；鱼类与哺乳动物分别成两大簇，说明 Slitrk3 氨基酸序列在鱼类与哺乳动物之间的亲缘关系较远(图 2)。一致性 Identity/%离散度 Divergence/%12345678910199.7 99.0 98.2 97.6 94.8 89.2 76.6 76.5 76.21大黄鱼 Larimichthys crocea20.398.9 97.9 97.5 94.5 89.0 75.7 75.6 75.32棘头梅童鱼 Collichthys lucidus31.0 1.197.8 97.2 94.6 89.1 76.1 76.3 75.93金钱鱼 Scatophagus argus41.8 2.1 2.296.7 94.1 88.5 76.1 76.1 75.74大西洋鲷 Sparus aurata52.5 2.6 2.8 3.493.8 88.5 75.7 75.7 75.65黃鲈 Perca flavescens 65.4 5.7 5.6 6.2 6.588.3 75.7 75.7 75.26大鳍弹涂鱼 Periophthalmus magnuspinnatus711.7 12.0 11.8 12.5 12.5 12.877.2 77.2 77.17斑马鱼 Danio rerio828.1 29.3 28.8 28.9 29.4 29.4 27.298.9 96.28大鼠 Rattus norvegicus928.2 29.6 28.6 28.9 29.4 29.4 27.2 1.196.49小鼠 Mus musculus1028.7 30.0 29.1 29.4 29.5 30.2 27.4 3.9 3.710智人 Homo sapiens12345678910图1 大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列多重序列比对Fig.1 Multiple alignments of amino acid sequences of Slitrk3 in L.crocea and other species第 4 期周锐涛等:大黄鱼 slitrk3 基因启动子克隆及转录调控分析712.1.3slitrk3 基因潜在的转录起始位点预测分析利用在线分析软件 BDGP 对大黄鱼 slitrk3 基因潜在转录起始位点进行预测，结果显示大黄鱼slitrk3 基因启动子中含有 2 个潜在的转录起始位点且预测得分(01)均为 0.94，分别位于551502 bp 中的 A 及426377 bp 中的 T。前者序列为 CTGTTATGTAATAAACACAGCCGGGGGACGGTGTCTCCTCACCACTAACC，后者序列为ATATCTGCTGTATAATAAATGGCAATCCCCCCCTATATACTGACGTTAAC。2.1.4slitrk3 基因潜在的 CpG 岛预测分析利用在线分析软件 Methprimer 对大黄鱼slitrk3 基因潜在的 CpG 岛进行预测，结果显示(图 3)，大黄鱼 slitrk3 基因启动子中含有 2 个潜在的 CpG 岛，分别位于1 9211 760 bp 和1 4151 240 bp。2.1.5slitrk3 基因潜在的转录因子结合位点预测分析利用在线分析软件 AliBaba 2.1 对大黄鱼 slitrk3基因潜在的转录因子结合位点进行预测，预测结果见表 3。结果显示，共预测到大黄鱼 slitrk3 基因启动子区域存在 15 种转录因子的结合位点。其中，启动子区域主要富集了 Sp1、GR 及 C/EBP 这 3 种转录因子的结合位点。2.2 双荧光素酶报告基因系统构建及活性检测2.2.1slitrk3 基因启动子双荧光素酶报告基因质粒构建以大黄鱼基因组为模板，利用扩增大黄鱼slitrk3 启动子不同长度片段的 6 对引物(slitrk3-P1slitrk3-P6)分别进行 PCR 扩增，胶回收纯化，产物经 1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带与预期一致(图 4)。重组反应、转化、单菌落挑选后，提取质粒进行酶切鉴定，产物经 1%(质1001001009110088880.02节点处数字代表自展值；0.02 代表遗传距离标尺。Te numbers at the nodes indicate the bootstrap;the 0.02 indicates the genetic distance scale.大黄鱼 Larimichthys crocea棘头梅童鱼 Collichthys lucidus金钱鱼 Scatophagus argus大西洋鲷 Sparus aurata黃鲈 Perca flavescens大鳍弹涂鱼 Periophthalmus magnuspinnatus斑马鱼 Danio rerio大鼠 Rattus norvegicus小鼠 Mus musculus智人 Homo sapiens图2 大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences of Slitrk3 in L.crocea and other speciesCpG 岛 CpG Island200200 400 600 800 1 000 1 2001 400 1 6001 800序列长度 Sequence length/bp6080GC 百分比GC percentage/%40100图3 大黄鱼 slitrk3 基因启动子 CpG 岛的预测Fig.3 Prediction of CpG islands of slitrk3 gene promoter in L.crocea72南 方 水 产 科 学第 19 卷量分数)琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带与预期一致(图 5)。将构建成功的重组质粒名称与引物名称相对应，即 pGL3-slitrk3-P1、pGL3-slitrk3-P2、pGL3-slitrk3-P3、pGL3-slitrk3-P4、pGL3-slitrk3-P5 和 pGL3-slitrk3-P6。经测序确认，序列正确。2.2.2slitrk3基因启动子双荧光素酶报告系统活性检测利用双荧光素酶报告基因系统测定分析slitrk3 基因启动子区域不同长度片段重组质粒的活性，结果显示所构建的 6 个不同长度片段的重组载体的启动子区域活性均极显著高于对照组 pGL3-Basic(P0.01，图 6)，且 pGL3-slitrk3-P6 启动子区域活性最高；pGL3-slitrk3-P2 启动子区域活性极显著低于 pGL3-slitrk3-P1 和 pGL3-slitrk3-P3(P0.01)；pGL3-slitrk3-P4 的启动子区域活性极显表3 大黄鱼 slitrk3 基因启动子转录因子结合位点的预测Table 3 Prediction of transcription factor binding sites ofslitrk3 gene promoter in L.crocea转录因子Transcription factor起始Star/bp终止End/bp序列(53)Sequence(53)Sp11 9011 889gtgcccccccctc1 4221 413gctcaggcca1 0371 028cgcccactgc646637ccgtcctctt520511gtctcctcac504495cctcacccac145136tgtgagggtg10798tccctccttt8475cccatcccctGR1 8931 884ccctctgttc1 8011 792aacagaacac7869ccctctgttcC/EBP1 6971 688ttattttttt551542tgttatgtaa361352tttgtttgca312303tatattttgt6758gttttgcagtC/EBP979970attggaaaatGATA-11 7351 726gacatgataaTBP1 6911 682tttttagattTEC11 5771 568cggaatgaaaRAP11 3271 318gtgtttgtgtNF-1757748tggcacccatMEB-1698689ttatttttaaGLO698689ttatttttaaE1498489ccacctgctgMyf-3498489ccacctgctgOct-1339330aaattatccaIRF-17263gttctgttttM123456bp2 0001 000750500250100图4 大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段的 PCR 产物电泳注：M.DL2000 DNA Marker；1.slitrk3-P1 片段；2.slitrk3-P2 片段；3.slitrk3-P3 片段；4.slitrk3-P4 片段；5.slitrk3-P5 片段；6.slitrk3-P6 片段。Fig.4 Electrophoresis of PCR products of slitrk3 gene pro-moter different length fragments in L.croceaNote:M.DL2000 DNA Marker;1.slitrk3-P1 fragment;2.slitrk3-P2fragment;3.slitrk3-P3 fragment;4.slitrk3-P4 fragment;5.slitrk3-P5 fragment;6.slitrk3-P6 fragment.bp1234565 0003 0002 0001 5001 000800500300M0图5 大黄鱼 slitrk3 基因启动子重组质粒酶切电泳注：M.DL5000 DNA Marker；0.pGL3-Basic 质粒；1.pGL3-slitrk3-P1 质粒；2.pGL3-slitrk3-P2 质粒；3.pGL3-slitrk3-P3 质粒；4.pGL3-slitrk3-P4 质粒；5.pGL3-slitrk3-P5 质粒；6.pGL3-slitrk3-P6 质粒。Fig.5 Electrophoresis of restriction enzymes digestion ofslitrk3 gene promoter recombinant plasmids in L.croceaNote:M.DL5000 DNA Marker;0.pGL3-Basic plasmid;1.pGL3-slitrk3-P1 plasmid;2.pGL3-slitrk3-P2 plasmid;3.pGL3-slitrk3-P3plasmid;4.pGL3-slitrk3-P4 plasmid;5.pGL3-slitrk3-P5plasmid;6.pGL3-slitrk3-P6 plasmid.第 4 期周锐涛等:大黄鱼 slitrk3 基因启动子克隆及转录调控分析73著低于 pGL3-slitrk3-P3 和 pGL3-slitrk3-P5(P0.01)；pGL3-slitrk3-P6 的启动子区域活性极显著高于 pGL3-slitrk3-P5 和 pGL3-Basic(P0.01)。3 讨论由于与神经生长发育相关，Slitrk 家族的结构和功能研究已被关注多年。Slitrk 家族是一个跨膜蛋白家族，在中枢神经系统中发挥营养作用，促进神经突触生长和神经元存活15-18。已有研究表明，Slitrk 家族中的 slitrk1、slitrk2 和 slitrk5 基因可能与精神疾病有关19-20。Slitrk 家族中的 slitrk3 作为一种神经细胞突触后黏附分子，主要参与调节神经细胞的抑制性突触发育，对正常功能性 GABA 能神经元突触发育具有重要作用21-22。研究表明，在早期发育的神经元中，当 GABA 能突触最初形成时，slitrk3 基因的表达水平相对较低，随着突触发育而不断增加，slitrk3 基因的表达水平也随之提高，对发育成熟的 GABA 能突触更为重要23。Li 等24的研究也同样揭示了抑制性突触细胞黏附分子 Slitrk3的羧基端保守酪氨酸残基 GABA 能在突触的发育和传递中发挥着重要作用。Round 等6探究了 Slitrk家族在斑马鱼大脑、视网膜以及脊髓发育过程中的时空表达模式。目前对于鱼类 slitrk3 基因的研究较为缺乏，为了深入探究鱼类 slitrk3 基因启动子的调控机制，本研究首先分析了大黄鱼及其他物种的Slitrk3 氨基酸同源性，再预测大黄鱼中 slitrk3 基因潜在的转录起始位点、CpG 岛和转录因子结合位点，最后通过双荧光素酶报告基因系统检测启动子区域内的转录调控活性，以初步确定大黄鱼 slitrk3基因启动子的转录调控机制。利用生物信息学方法对大黄鱼及其他物种的Slitrk3 氨基酸序列进行多重序列比对及构建系统进化树发现，大黄鱼与亲缘关系较近的棘头梅童鱼的氨基酸序列一致性为 99.7%，与其他 5 种鱼类的一致性介于 89.2%99.0%，表明其在鱼类中具有高度保守性。Slitrk3 氨基酸序列在鱼类和哺乳动物的系统进化树中分为两大簇，两者的氨基酸序列一致性最低仍有 75.2%。Round 等6对斑马鱼 Slitrk 家族的氨基酸序列进行蛋白结构域预测，发现其氨基酸序列均具有 1 个信号肽、2 个 LRR 结构域、1 个跨膜结构域和羧基末端的保守磷酸酪氨酸基序，表明 Slitrk 家族的蛋白质结构在鱼类中同样具有较高的保守性。基因启动子区域的 DNA 甲基化是抑制基因表达最常见的表观遗传现象之一，基因启动子区域CpG 岛的甲基化状态对基因表达调控具有重要作用25。本研究通过对大黄鱼 slitrk3 基因启动子区域的 CpG 岛进行预测，发现含有 2 个潜在的 CpG岛，分别位于1 9211 760 bp 和1 4151 240 bp。目前 slitrk3 基因的 CpG 岛甲基化与其表达之间的关系尚未明确，相关作用机制有待进一步确定。对 slitrk3 基因启动子潜在转录因子结合位点的预测结果显示，其有 Sp1、GR、C/EBP 和 C/EBP 等多种转录因子结合位点。Sp1(特异性蛋白 1)是一种转录激活因子，其转录激活域主要负责 DNA 的结合和转录激活26。预测结果主要集中在克隆片段的147+16 bp，该结果与双荧光素酶报告基因系统显示147+16 bp 存在正调控元件的结果一+161 970slitrk3-P1LUC1 614slitrk3-P2LUC1 210slitrk3-P3LUCslitrk3-P4667LUCslitrk3-P5376LUC147 slitrk3-P6LUCLUC00.1BasicP6P5P4P3P2P11357911 13 15相对荧光素酶活性Relative luc