当归芍药散联合TLR4抑制剂对大鼠肝纤维化的抑制作用及NF-κB_NLRP3通路的调节作用研究.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究当归芍药散联合TLR4抑制剂对大鼠肝纤维化的抑制作用及NF-B/NLRP3通路的调节作用研究王雯1，胡传国1，梁伟林2（1.新疆维吾尔自治区人民医院 乌鲁木齐 830001；2.解放军总医院京西医疗区 北京 100144）摘要：目的研究当归芍药散联合Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）抑制剂对大鼠肝纤维化的抑制作用及对核因子 B（Nuclear factor kappa-B，NF-B）/NOD 样受体蛋白 3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）通路的调节作用。方法大鼠随机分为空白对照组及造模组，造模组采用腹腔注射四氯化碳（CCl4）法建立肝纤维化大鼠模型，造模完成后的大鼠随机分为肝纤维化模型组、当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组，12只/组，当归芍药散组大鼠按照10 gkg-1（以生药含量计）灌胃给予大鼠当归芍药散，TLR4抑制剂组腹腔注射给予大鼠TAK-242（3 mgkg-1），联合组同时给予大鼠当归芍药散（10 gkg-1）及TAK-242（3 mgkg-1），1次/天，连续给药13周，测定大鼠体质量、肝脏重量及肝脏指数，使用全自动生化分析仪测定大鼠血清直接胆红素（Direct bilirubin，DBIL）、总胆汁酸（Total bile acid，TBA）及总胆红素（Total bilirubin，TBIL）水平，使用酶联免疫吸附法（ELISA）测定肝组织细胞间黏附分子-1（Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）及还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）水平，Masson染色法检查大鼠肝组织病理学变化，实时定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Rt-qPCR）测定肝组织NLPR3及NF-B mRNA水平，免疫印迹法（Western blot）测定肝组织NLPR3及NF-B蛋白水平，免疫荧光法测定肝组织-SMA表达。结果与空白对照组比较，肝纤维化模型组大鼠肝脏质量、肝脏指数，血清DBIL、TBA及TBIL水平、肝组织ICAM-1及MDA水平、肝组织NLPR3及NF-B mRNA及蛋白水平、肝组织-SMA免疫荧光强度显著升高（P0.05），体质量、肝组织SOD及GSH水平显著降低（P0.05），肝组织明显纤维化改变；与肝纤维化模型组比较，当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组大鼠肝脏质量、肝脏指数，血清DBIL、TBA及TBIL水平、肝组织ICAM-1及MDA水平、肝组织NLPR3及NF-B mRNA及蛋白水平、肝组织-SMA免疫荧光强度显著降低（P0.05），体质量、肝组织SOD及GSH水平显著升高（P0.05），肝组织病理学明显恢复，且联合组各项指标变化显著优于当归芍药散及TLR4抑制剂单独给药组。结论当归芍药散联合TLR4抑制剂能显著改善肝纤维化大鼠肝功能，抑制肝组织纤维化进展，降低氧化应激损伤，其机制可能与调节NF-B/NLPR3通路有关。关键词：当归芍药散 TLR4抑制剂 NF-B/NLRP3通路 肝纤维化大鼠doi:10.11842/wst.20220111001 中图分类号:R285.5 文献标识码:A肝纤维化是由于过度饮酒、肝脏病毒感染、高脂肪饮食及其他不健康生活方式造成的肝组织细胞损 收稿日期：2022-01-11 修回日期：2022-04-14 新疆维吾尔自治区卫生健康委员会自治区卫生健康青年医学科技人才专项科研项目（WJWY-202226）：基于TLR4/NF-B/NLRP3通路探讨当归芍药散对CCl4肝纤维化大鼠的作用机制，负责人：王雯。通讯作者：胡传国，副主任医师，主要研究方向：中医内科。1147 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 伤，导致肝细胞长期处于炎症状态，进而使得肝星状细胞被激活，肝细胞外基质沉积，最终导致并促进肝纤维化的发生。肝纤维化患者临床表现为疲乏无力、消化不良等特点，若不及时接受治疗，往往会发展成为肝硬化甚至肝癌，进而导致患者死亡1-2。目前临床中对于肝纤维化的治疗尚缺乏特异性治疗药物，只能进行对症治疗以缓解病情进展，肝纤维化治疗药物的研发仍是当前临床研究的重要方向。当归芍药散出自 金匮要略，是由当归、芍药、茯苓、白术、泽泻、川芎等中药材组成的中药方剂，用于治疗肝脾两虚，腹中拘急等病症，具有养血调肝，健脾渗湿等功效。现代研究表明，当归芍药散具有显著的抗肝纤维化作用，有研究证实当归芍药散能够减少大鼠肝组织胶原蛋白的沉积，抑制肝纤维化的进展，减少腹水的发生3-5。TLR4在肝组织细胞中广泛分布，研究证实肝组织TLR4的异常激活是导致肝纤维化发生及发展的重要因素，抑制TLR4信号传导则能够显著减轻肝纤维化大鼠肝组织病变，进而减轻肝纤维化的发生及进展6-7。Ishida8研究表明，抑制TLR4能够显著抑制四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的发生。Mridha等9研究表明，NF-B/NLRP3通路相关蛋白水平的升高会促进肝组织细胞炎症聚集，加速肝纤维化的进展。Ramos-Tovar等10研究表明，NF-B的异常升高会导致肝组织细胞炎症聚集、凋亡。TAK-242 是目前已经证实的TLR4抑制剂，具有显著的TLR4靶向抑制作用。本实验首次通过研究当归芍药散联合TLR4抑制剂对肝纤维化的治疗效果，并研究其对NF-B/NLRP3通路的调节作用，进而为当归芍药散的药理作用深入研究提供参考。1 材料与方法 1.1材料1.1.1实验动物63只雄性 SD 大鼠，6-8周龄，200-220 g，健康清洁级，购自广东省实验动物监测所提供，实验动物生产许可证号 SCXK（粤）2018-0044，饲养于实验动物房，温度22-24，相对湿度40%-70%，自然光照，自由饮食。本研究经我院伦理委员会审核批准（审批号KY20210623087）。1.1.2设备与仪器IX83 荧光倒置显微镜（日本 Olympus 公司）；E-Gel Imager凝胶成像仪（赛默飞世尔科技有限公司）；HS-2205 石蜡切片机（金华市华速科技有限公司）；SpectraMax iD5 酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；Sigma 3-30KS 高速台式冷冻离心机（德国 Sigma 公司）；Viva-pro全自动生化分析仪（德国西门子公司）；PIONEER PX电子天平（北京赛百奥科技有限公司）。1.1.3药品及试剂TAK-242（货号 CLI-095，美国 MedChemExpress公司）；当归芍药散由中药配方颗粒当归（批号1911261）9 g，芍药（批号 1908071）30 g，泽泻（批号1909152）、川芎（批号 1910051）各 15 g，茯苓（批号1910181）、白术（批号1909201）各12 g组成，购自广东一方制药有限公司；大鼠 ICAM-1（货号 PI495）、SOD（货号 S0101S）、MDA（货号 S0131M）及 GSH（货号S0056）ELISA 检测试剂盒，免疫染色封闭液（货号P0102），免疫染色一抗稀释液（货号P0103），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（货号A0208）购自碧云天生物科技有限公司；NLPR3（货号ab263899）、NF-B（货号 ab76302）、GAPDH（货号 ab181602）兔单克隆抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司；-SMA 兔单克隆 抗 体（上 海 恪 敏 生 物 科 技 有 限 公 司，货 号bs-0189R）；Masson 染 色 试 剂 盒（货 号 G1340），2SYBRGreenPCRMastermix（货号SR1120），组织裂解液（货号R0010），磷酸盐缓冲液（货号P1010），二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒（货号PC0020）购自北京索莱宝科技有限公司；PCR引物设计及合成由赛默飞世尔科技公司完成。1.2方法1.2.1分组及造模63 只大鼠按照随机数字表法分为空白对照组（12只）及造模组（51只），参照文献11方法建立肝纤维化大鼠模型，造模组腹腔注射给予大鼠40%的CCl4-橄榄油溶液（5 mLkg-1），随后按照3 mLkg-1隔日1次腹腔注射，持续8周，随机取3只大鼠进行组织病理学检查，以大鼠肝组织明显纤维化视为造模成功，将造模完成后的大鼠随机分为肝纤维化模型组、当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组，每组12只。1.2.2给药当归芍药散组大鼠按照 10 gkg-1（以生药含量计）12灌胃给予大鼠当归芍药散，TLR4抑制剂组腹腔注射给予大鼠TAK-242（3 mgkg-1）13，联合组同时给1148 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究予大鼠当归芍药散（10 gkg-1）及TAK-242（3 mgkg-1），每天1次，连续给药13周14。末次给药24 h后进行后续实验。1.2.3大鼠体质量、肝脏重量及肝脏指数的测定使用电子天平分别测定各组大鼠体质量后，采用颈椎脱臼法处死大鼠后，分离大鼠肝脏，称量肝脏重量，并计算大鼠肝脏指数。肝脏指数=肝脏重量（mg）/体质量（g）100%。1.2.4大鼠血清DBIL、TBA及TBIL的测定腹腔注射给予大鼠3.5 mLkg-1的体积分数为10%的水合氯醛对大鼠进行麻醉后，取仰卧位，腹主动脉取血至离心管，4静置1 h，在离心机中，4条件下，8000 rmin-1离心10 min，取上清液，使用全自动生化分析仪测定DBIL、TBA及TBIL水平。1.2.5大鼠肝组织 ICAM-1、SOD、MDA 及 GSH 的测定颈椎脱臼法处死大鼠后，分离肝组织，加入4预冷的蒸馏水，置于组织匀浆器中研磨匀浆后，4条件下，8000 rmin-1，离心 10 min，取上清液，使用 ELISA试剂盒测定肝组织ICAM-1、SOD、MDA及GSH水平。1.2.6Masson染色法检查大鼠肝组织病理学变化颈椎脱臼法将大鼠处死后迅速分离肝组织，使用石蜡包埋后，进行5 m切片，常规脱蜡至水后，常规Masson染色后，二甲苯透明处理，中性树胶封片，置于显微镜下进行病理学检查。1.2.7大鼠肝组织 NLPR3 及 NF-B mRNA 水平的测定颈椎脱臼法处死大鼠后，分离肝组织，使用4预冷的蒸馏水进行组织灌流后，使用RNA提取试剂盒提取 总 RNA，并 使 用 逆 转 录 试 剂 盒 将 RNA 逆 转 为cDNA，使用 PCR 试剂盒测定肝组织 NLPR3 及 NF-BmRNA水平，结果以GAPDH为内参，采用2-Ct法计算相对表达量。各基因引物序列为：NLPR3：正向引物：5-ATGGTGGCTTTCAGTTCAGC-3，反向引物：5-TGGGGTTTCAGAGAGTTTGG-3；NF-B：正向引物：5-TCACCTCTGAGACCGACA-3，反 向 引 物：5-ACTGGCTGAGGAGAACTG-3；GAPDH：正向引物：5-AACTTTGGCATCGAAGG-3，反 向 引 物：5-GTGGATGCAGTGATGTTC-3。反 应 体 系 为：DNA 模 板 1 L，上 下 游 引 物 各 0.5 L，2GreenqPCRMixture10 l，补充无 RNA 酶水至 20 L。反应程序为94预变性2 min，94变性15 s，60退火15 s，72延伸30 s，进行40个循环。1.2.8大鼠肝组织NLPR3及NF-B蛋白水平的测定颈椎脱臼法处死大鼠后NF-B，分离肝组织，使用4预冷的蒸馏水灌洗后，置于冰盒上，向组织研磨匀浆器中加入组织裂解液，充分研磨匀浆后，置于4离心机中，12 000 rmin-1，离心10 min，取上清液，使用BCA试剂盒进行蛋白定量后，取相当于50 g蛋白的匀浆液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏氟乙烯膜上，使用牛血清白蛋白室温条件下封闭2 h，分别经NLPR3、及GAPDH兔单克隆抗体（1 1000稀释）在4条件下孵育过夜，使用含1%吐温的磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5 min，使用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1 2000稀释）室温孵育1 h，再次清洗3次，滴加ECL化学发光液，置于凝胶成像仪中拍照后，使用Image J 1.12.0测定各蛋白灰度值，计算各蛋白相对表达量。1.2.9大鼠肝组织-SMA表达大鼠采用颈椎脱臼法处死后，分离肝组织，使用石蜡包埋后进行5 m切片，依次经脱蜡、水化、抗原修复后，固定液室温固定10 min，洗涤液洗涤3次，每次5 min，封闭液室温封闭1 h，加入-SMA兔单克隆抗体（1 1000 稀释），4孵育过夜，再次用洗涤液洗涤3次，加入荧光标记的山羊抗兔IgG室温孵育1 h，洗涤液洗涤3次后，滴加抗荧光淬灭剂，于荧光显微镜下进行观察拍照，并使用Image J pro plus 1.15计算相对荧光强度。1.3数据处理所有数据采用统计学软件SPSS 26.0进行处理分析，计量资料以平均值标准差（x s）的形式表示，结果均符合正态分布且方差齐，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，计数资料采用2检验，P0.05表示差异有统计学意义。2 结果 2.1当归芍药散联合TLR4抑制剂对大鼠体质量、肝脏质量及肝脏指数的影响当归芍药散联合TLR4抑制剂对大鼠体质量、肝脏质量及肝脏指数的影响如表1所示，结果表明，与空白对照组比较，肝纤维化模型组大鼠体质量显著降低（P0.05），肝脏质量及肝脏指数显著升高（P0.05）；与1149 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 肝纤维化模型组比较，当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组大鼠体质量显著升高（P0.05），肝脏质量及肝脏指数显著降低（P0.05），与当归芍药散组及TLR4抑制剂组比较，联合组体质量显著升高（P0.05），肝脏质量及肝脏指数显著降低（P0.05）。2.2当归芍药散联合TLR4抑制剂对大鼠血清DBIL、TBA及TBIL的影响当归芍药散联合TLR4抑制剂对大鼠血清DBIL、TBA及TBIL的影响如表2所示，结果表明，与空白对照组比较，肝纤维化模型组大鼠血清 DBIL、TBA 及TBIL 水平显著升高（P0.05）；与肝纤维化模型组比较，当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组大鼠血清DBIL、TBA及TBIL水平显著降低（P0.05），与当归芍药散组及TLR4抑制剂组比较，联合组大鼠血清DBIL、TBA及TBIL水平显著降低（P0.05）。2.3当归芍药散联合 TLR4 抑制剂对大鼠肝组织ICAM-1、SOD、MDA及GSH的影响当归芍药散联合 TLR4 抑制剂对大鼠肝组织ICAM-1、SOD、MDA 及 GSH 的影响如表 3 所示，结果表明，与空白对照组比较，肝纤维化模型组大鼠肝组织 ICAM-1 及 MDA 水平显著升高（P0.05），SOD 及GSH 水平显著降低（P0.05）；与肝纤维化模型组比较，当归芍药散组、TLR4 抑制剂组及联合组大鼠ICAM-1及MDA水平显著降低（P0.05），SOD及GSH水平显著升高（P0.05），与当归芍药散组及 TLR4抑制剂组比较，联合组大鼠 ICAM-1 及 MDA 水平显著 降 低（P0.05），SOD 及 GSH 水 平 显 著 升 高（P0.05）。2.4当归芍药散联合TLR4抑制剂对大鼠肝组织病理学的影响当归芍药散联合TLR4抑制剂对大鼠肝组织病理学的影响如图1所示，结果表明，空白对照组大鼠肝组织结构正常，无明显病理性改变；与空白对照组比较，肝纤维化模型组大鼠肝组织明显纤维化改变，存在大量胶原沉积，炎症细胞浸润；与肝纤维化模型组比较，当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组肝组织胶原图1大鼠肝组织病理学检查结果（Masson 200）注：A：空白对照组；B：肝纤维化模型组；C：当归芍药散组；D：TLR4抑制剂组；E：联合组。表3大鼠肝组织ICAM-1、SOD、MDA及GSH比较结果组别空白对照组肝纤维化模型组当归芍药散组TLR4抑制剂组联合组ICAM-1（nggprot-1）203.886.31643.197.72*431.689.67#408.7111.25#2348.12#abSOD（Umgprot-1）91.293.1748.772.76*72.761.71#65.265.79#86.512.67#abMDA（nmolmgprot-1）0.890.144.710.89*2.470.56#2.950.41#1.350.64#abGSH（IUL-1）346.317.72183.974.41*253.376.69#228.386.32#323.454.38#ab注：与空白对照组比较，*P0.05；与肝纤维化模型组比较，#P0.05；与当归芍药散组比较，aP0.05；与TLR4抑制剂组比较，bP0.05。表1大鼠体质量、肝脏质量及肝脏指数比较结果组别空白对照组肝纤维化模型组当归芍药散组TLR4抑制剂组联合组体质量（g）510.051.37324.712.68*391.252.63#419.261.99#467.192.58#ab肝脏质量（mg）11.070.4928.410.43*17.121.14#18.981.41#14.390.40#ab肝脏指数（%）2.170.798.750.64*4.231.37#4.051.12#3.081.40#ab注：与空白对照组比较，*P0.05；与肝纤维化模型组比较，#P0.05；与当归芍药散组比较，aP0.05；与TLR4抑制剂组比较，bP0.05。表2大鼠血清DBIL、TBA及TBIL水平比较结果组别空白对照组肝纤维化模型组当归芍药散组TLR4抑制剂组联合组DBIL（molL-1）3.170.08128.932.58*43.741.63#36.611.12#15.410.39#abTBA（molL-1）14.931.75402.563.71*62.191.06#55.652.18#27.781.13#abTBIL（molL-1）2.670.1597.332.65*43.261.74#32.671.81#12.880.14#ab注：与空白对照组比较，*P0.05；与肝纤维化模型组比较，#P0.05；与当归芍药散组比较，aP0.05；与TLR4抑制剂组比较，bP0.05。1150 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究沉积明显减轻，肝组织纤维化减轻，炎症细胞浸润减轻。2.5当归芍药散联合 TLR4 抑制剂对大鼠肝组织NLPR3及NF-B mRNA水平的影响当归芍药散联合 TLR4 抑制剂对大鼠肝组织NLPR3及 NF-B mRNA 水平的影响如表 4所示。结果表明，与空白对照组比较，肝纤维化模型组大鼠肝组织NLPR3及NF-B mRNA水平显著升高（P0.05）；与肝纤维化模型组比较，当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组肝组织NLPR3及NF-B mRNA水平显著降低（P0.05），与当归芍药散组及 TLR4抑制剂组比较，联合组大鼠肝组织NLPR3及NF-B mRNA水平显著降低（P0.05）。2.6当归芍药散联合 TLR4 抑制剂对大鼠肝组织NLPR3及NF-B蛋白的影响当归芍药散联合 TLR4 抑制剂对大鼠肝组织NLPR3及NF-B蛋白的影响如图2所示，结果表明，与空白对照组比较，肝纤维化模型组大鼠肝组织NLPR3及NF-B蛋白水平显著升高（P0.05）；与肝纤维化模型组比较，当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组肝组织 NLPR3及NF-B蛋白水平显著降低（P0.05），与当归芍药散组及TLR4抑制剂组比较，联合组大鼠肝组织 NLPR3 及 NF-B 蛋白水平显著降低（P0.05）。2.7当归芍药散联合 TLR4 抑制剂对大鼠肝组织-SMA表达的影响当归芍药散联合 TLR4 抑制剂对大鼠肝组织-SMA表达的影响如图3所示，结果表明，与空白对照组比较，肝纤维化模型组大鼠肝组织-SMA免疫荧光强度显著升高（P0.05）；与肝纤维化模型组比较，图3大鼠肝组织-SMA表达结果比较注：A：空白对照组；B：肝纤维化模型组；C：当归芍药散组；D：TLR4抑制剂组；E：联合组；与空白对照组比较，*P0.05；与肝纤维化模型组比较，#P 0.05；与当归芍药散组比较，aP0.05；与TLR4抑制剂组比较，bP0.05。图2大鼠肝组织NLPR3及NF-B蛋白水平比较结果注：A：空白对照组；B：肝纤维化模型组；C：当归芍药散组；D：TLR4抑制剂组；E：联合组；与空白对照组比较，*P0.05；与肝纤维化模型组比较，#P0.05；与当归芍药散组比较，aP0.05；与TLR4抑制剂组比较，bP0.05。表4大鼠肝组织NLPR3及NF-B mRNA水平比较结果组别空白对照组肝纤维化模型组当归芍药散组TLR4抑制剂组联合组NLPR31.180.366.230.51*2.700.64#2.450.39#1.760.33#abNF-B0.840.245.540.31*3.130.45#2.670.41#1.180.21#ab注：与空白对照组比较，*P0.05；与肝纤维化模型组比较，#P0.05；与当归芍药散组比较，aP0.05；与TLR4抑制剂组比较，bP0.05。1151 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 当归芍药散组、TLR4 抑制剂组及联合组肝组织-SMA免疫荧光强度显著降低（P0.05），与当归芍药散组及 TLR4 抑制剂组比较，联合组大鼠肝组织-SMA免疫荧光强度显著降低（P0.05）。3 讨论与结论 3.1当归芍药散显著改善肝纤维化大鼠肝功能血清 DBIL、TBA 及 TBIL是反应肝功能及肝组织纤维化程度的指标，血清DBIL、TBA及TBIL升高则提示肝功能降低，肝组织纤维化程度加重15。王晓慧等16研究表明，ICAM-1水平升高会导致肝纤维化加重及肝组织炎症浸润，而抑制ICAM-1则能够显著改善肝纤维化进展；SOD及GSH能够抵抗肝组织细胞的氧化应激损伤，其水平下降表明肝组织抗氧化应激能力降低，而肝组织中MDA水平的升高则能够加重肝组织细胞损伤，导致细胞处于炎症浸润状态，进而加重肝纤维化进展17。本实验结果表明，与空白对照组比较，肝纤维化大鼠血清DBIL、TBA及TBIL水平显著升高，提示肝组织功能受损，同时肝组织SOD及GSH水平降低，MDA水平升高，提示肝组织氧化损伤加重；与肝纤维化模型组比较，当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组血清 DBIL、TBA 及 TBIL 则已明显降低，肝组织 SOD 及GSH水平升高，MDA水平降低，提示肝组织细胞功能恢复，抗氧化应激能力明显提高。3.2当归芍药散显著抑制大鼠肝纤维化进展-SMA在肝组织中广泛分布，研究表明-SMA是肝组织发生纤维化的重要标志物，-SMA在肝组织表达水平升高提示肝组织纤维化进展加重，吴宙光等18研究表明，肝组织-SMA水平升高导致患者肝组织纤维化及肝功能障碍，且-SMA水平与肝功能障碍程度及肝纤维化程度呈正相关；贾荣军等19研究表明，-SMA 水平升高提示肝组织纤维化，而降低肝组织-SMA水平，则能够抑制肝组织胶原蛋白沉积。本实验通过研究肝纤维化大鼠-SMA表达，结果表明，肝纤维化模型组大鼠肝组织-SMA免疫荧光强度升高，分别给予大鼠当归芍药散、TLR4抑制剂及当归芍药散联合TLR4抑制剂后，大鼠肝组织-SMA表达明显降低，且当归芍药散联合 TLR4 抑制剂组肝组织-SMA表达降低程度明显高于当归芍药散及TLR4抑制剂单独给药组，提示当归芍药散联合TLR4抑制剂能够显著抑制肝纤维化的进展。3.3当归芍药散显著抑制肝组织炎症水平NLPR3 作为一种炎症小体，其水平升高会导致肝组织细胞炎症水平升高，进而导致肝组织胶原沉积，加重肝组织纤维化，崔东娟等20研究表明，肝组织NLPR3水平升高导致肝损伤加重并导致纤维化的发生，而抑制 NLPR3 水平则能够显著抑制肝纤维化进展；黄晨恺等21研究报道降低NLPR3水平能够显著减少肝组织胶原蛋白沉积，抑制肝纤维化。NF-B 则能够通过级联反应促进肝组织炎症因子的释放，加重肝纤维化。王思为等22研究证实NF-B及NLPR3水平是导致肝纤维化进展的关键因素，抑制肝组织NF-B及NLPR3水平能改善小鼠肝组织纤维化及炎症改变。由此可见抑制肝组织NLPR3及NF-B的表达可能是治疗肝纤维化的有效方法。本实验结果表明，与空白对照组比较，肝纤维化模型组大鼠肝组织NF-B 及 NLPR3 水平明显升高，分别给予大鼠当归芍药散、TLR4 抑制剂及当归芍药散联合 TLR4 抑制剂，大鼠肝组织NF-B及NLPR3水平显著降低，且当归 芍 药 散 联 合 TLR4 抑 制 剂 组 肝 组 织 NF-B 及NLPR3 水平明显低于单独使用当归芍药散及 TLR4抑制剂组，提示当归芍药散联合TLR4抑制剂能显著降低肝纤维化大鼠肝组织 NF-B及 NLPR3水平，进而抑制肝组织纤维化进展，改善大鼠肝功能。本实验首次表明了当归芍药散联合 TLR4 抑制剂能够显著改善肝纤维化进行，并显著恢复肝组织细胞功能，且当归芍药散联合 TLR4 抑制剂明显优于单独使用当归芍药散及单独应用TLR4抑制剂组，并首次验证当归芍药散对肝纤维的抑制作用机制与调节NF-B/NLPR3 通路有关，为当归芍药散在肝纤维化治疗中的应用提供参考。综上所述，当归芍药散联合TLR4抑制剂能显著改善肝纤维化大鼠肝功能，抑制肝组织纤维化进展，降低氧化应激损伤，其机制可能与调节NF-B/NLPR3通路有关。参考文献 21152 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究1Shen W J,Chen G,Wang M,et al.Liver fibrosis in biliary atresia.World J Pediatr,2019,15(2):117-123.2Kisseleva T,Brenner D.Molecular and cellular mechanisms of liver fibrosis and its regression.Nat Rev Gastroenterol 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group,Danggui Shaoyao San group,TLR4 inhibitor group and combination group,12 rats/group,rats in the Danggui Shaoyao San group were given by intragastric administration at the dose of 10 gkg-1(based on crude drug content)of Danggui 1153 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 Shaoyao San,the TLR4 inhibitor group was intraperiton