BCA蛋白定量.doc

凯基BCA蛋白含量检测试剂盒
Cat Number：KGPBCA For Research Use Only
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Expire date：

一、   试剂盒说明
BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为1～20微升。
二、   试剂盒组份
组 份
Cat: KGPBCA试 （100 assay酶标板/20assay 1mL比色杯）
Cat: KGPBCA （250 assay酶标板/50assay 1mL比色杯）
蛋白标准溶液（0. 5 μg/μL ）
2 mL
5 mL
BCA试剂A
20 mL
25 mL×2
BCA试剂B
0.4mL
1mL
三、      操作步骤
A．   酶标板操作
1.      标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂
孔号
0
1
2
3
4
5
6
7
蛋白标准溶液（μL）
0
1
2
4
8
12
16
20
去离子水（μL）
20
19
18
16
12
8
4
0
对应蛋白含量（μg）
0
0.5
1.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
2.      根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；
3.      各孔加入200μL BCA工作液；
4.      把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
5.      稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；
, 6.      根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
B．   分光光度计测定
1.        标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂
孔号
0
1
2
3
4
5
6
7
蛋白标准溶液（μL）
0
5
10
20
40
60
80
100
去离子水（μL）
100
95
90
80
60
40
20
0
对应蛋白含量（μg）
0
2.5
5.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
2.        根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；
3.        各管加入1000μL BCA工作液；
4.        各管充分混匀，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
5.        稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为100μL，加入BCA工作液1000μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；
6.        根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
四、     注意事项
1. 配制好的混合BCA工作液室温24小时内稳定。
2. 加入BCA工作液后，也可以在室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。
3. 待测样品浓度在50～2000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。
4. BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于1mM.不适用BCA法时建议使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。
5. 操作时要带手套。