常见猪病检测方法.doc

猪病诊断技术规范

一、致病性大肠杆菌的检测
1 引用标准
参考NY/T 555-2002（动物产品大肠杆菌、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法）。
2 范围
适用于猪大肠杆菌病的诊断。
3 检测方法
3.1 材料
3.1.1 营养肉汤
3.1.2 营养琼脂
3.1.3 EMB
3.1.4 TSI
3.1.5 IMViC生化鉴定管
3.1.6 小白鼠
3.2 分离培养
a) 将采集的肝、脾、心血或肠内容物等分别接种伊红美兰琼脂平板（同时接种营养肉汤增菌备用），置37 ℃培养18~24 h。
b) 观察培养特性，挑取黑色有金属光泽的菌落，用该菌落涂片，革兰氏染色，镜检。
c) 如可见到两端钝圆并多以单个存在的革兰氏阴性粗短杆菌，应取5~10个典型菌落再接种于TSI琼脂。
d) 同时挑取典型菌落接种营养琼脂，37 ℃培养16~18 h的菌液用于生化特性鉴定。
3.3 生化鉴定
挑取上述菌落纯培养物接种以下生化培养基和乳糖发酵管，(36±1) ℃培养24 h后观察结果。
3.3.1 靛基质试验：
a) 滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1 mL于靛基质试验培养基中混合，观察结果。
b) 出现红色环的为反应阳性；出现黄色环的为反应阴性。
3.3.2 甲基红（MR）试验
a) 滴加甲基红指示剂0.2 mL于MR-VP培养基中混合，观察结果。
b) 出现红色为阳性反应；出现黄色为阴性反应。
3.3.3 VP试验
a) 滴加VP试剂甲液0.2 mL于MR-VP培养基中混匀，再滴加VP试剂乙液0.1 mL混匀，静置，观察结果。
b) 在15 min内出现红色的为阳性反应；无颜色变化的为阴性反应。阴性结果1 h后再观察一次，出现红色也为阳性反应。
3.3.4 枸橼酸盐试验：观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应；不变色为阴性反应。
3.4 大肠杆菌鉴定结果
应符合表1要求。
表1 大肠杆菌鉴定结果
靛基质
MR
VP
枸橼酸盐
鉴定
+
+
-
-
典型大肠埃希氏杆菌
-
+
-
-
非典型大肠埃希氏杆菌
+
+
-
+
典型柠檬酸盐杆菌
-
+
-
+
非典型柠檬酸盐杆菌
-
-
-
+
典型产气杆菌
+
-
-
+
非典型产气杆菌

出现表1的生化反应类型时，如果为组织样品，由此可初步报告为致病性大肠杆菌。如果为粪便，尿液，饲料，饮水，应进一步做致病性试验。
3.4 致病性试验
a) 取经营养肉汤37 ℃培养16~18 h后的纯化菌株培养液，分别腹腔接种体重20g左右的小白鼠，每株接种2~3只，每只0.3 mL（含菌量约为1×1012 cfu／mL），同时用相同数量的小白鼠接种无菌肉汤作对照。
b) 饲养观察、记录死亡数，并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。在24小时内出现死亡的可报告为致病性大肠杆菌。
4 药敏试验
a) 挑选琼脂平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，37 ℃培养16~18 h，菌液用于药敏试验。
b) 将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1×109 cfu／mL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片2~5张，置37 ℃培养24 ｈ后观察。
c) 根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。

二、沙门氏菌的检测
1 引用标准
参考NY/T 550-2002（动物和动物产品沙门氏菌检测方法）。
2 范围
适用于猪沙门氏菌病的诊断。
3 检测方法
3.1 材料
3.1.1 SC
3.1.2 DHL
3.1.3 TSI
3.1.4 赖氨酸脱羧酶（LD）
3.1.5 邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（DNPG）
3.1.6 甘露醇糖发酵管
3.2分离培养
a) 采集疑似病例的肝、脾、心血或肠内容物样品。
b) 无菌剪取肝、脾样品1 g，投入10 mL SC增菌液中（血液、粪便样品可以采适量直接投入10 mL增菌液），36±1 ℃培养18~24 h。
c) 取一接种环增菌液划线接种于DHL琼脂平板上，36±1 ℃培养18~24 h。观察平板上菌落生长形态。沙门氏菌在DHL平板上呈无色半透明，产硫化氢（H2S），菌落中心黑色或几乎全黑色。
3.3 生化鉴定
a) 挑取DHL平板上可疑菌落3~5个，每个菌落先洗入TSI培养基冷凝水中，继而在斜面上划线接种并高层穿刺接种。
b) 再挑取同一菌落依次接种氨基酸脱羧酶发酵试验（LD）和ONPG，甘露醇糖发酵管三支生化管，若菌落偏小，二次挑取菌落有困难，可用接种环醮取TSI培养基中冷凝水接种其余生化管，36±1 ℃培养18~24 h（挑取菌落后的平板，应置于4 ℃冰箱保留48 h以备复查）。
c) 按表1记录反应结果，对照表2进行判定。
d) 凡符合表2生化反应模式，可报告为沙门氏菌。
表1 生化反应结果判定
生化管
TSI
LD
ONPG
MAN
底a
斜面b
硫化氢
第一次颜色
记录符合
黄
+
黄
+
黑
+
紫
+
深黄
+
黄
+
第二次颜色
记录符号
红
-
红
-
无黑色
-
黄
-
无色或淡黄
-
紫
-
a “底”观察葡萄糖反应。
b “斜面”观察乳糖和蔗糖反应。
表2 生化检测沙门氏菌属判定表
序
号
TSI
LD
ONPG
MAN
判定
底
斜面
硫化氢
A
Ba
C
Db
Ec
Fd
G
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
-
-
-
+-
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
+
-
+-
-
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+-
沙门氏菌亚种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ
沙门氏菌亚种Ⅲb、15％Ⅲa
沙门氏菌亚种Ⅲa、Ⅴ、15％Ⅲb、15％Ⅱ
少数沙门氏菌亚种Ⅰ
少数沙门氏菌亚种Ⅰ
甲型副伤寒沙门氏菌
非沙门氏菌
a含1％硫化氢阳性的大肠埃希氏菌，可加试靛基质加以鉴别，其中大肠杆菌阳性，沙门氏菌阴性。
b赖氨酸阴性的沙门氏菌主要有：甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种、鸡等。
c 硫化氢阴性的沙门氏菌主要有：甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱、猪伤寒、仙台、贝塔、巴布亚、鸡、马流产、山夫登堡、都柏林登。。
d可直接用（O）单因子血清证实，以排除雷极氏普罗菲登斯菌登。
4 药敏试验
a) 挑选DHL平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，36±1 ℃培养16~18 h，菌液用于药敏试验。
b) 将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1×109 cfu／mL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片2~5张，置36±1 ℃培养24 ｈ后观察。
c) 根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。

三、产气荚膜梭菌的检测
1 引用标准
自定标准。
2 范围
适用于猪产气荚膜梭菌病的诊断。
3 材料
3.1 绵羊血琼脂
3.2 牛乳培养基。
4 组织染色镜检
对疑似病例的肠道黏膜涂片，魏氏梭菌呈G+，直杆状，两端钝圆，单在或成双，无鞭毛，不运动。芽孢大而卵圆，位于菌体中央或近端，多数菌株可形成荚膜。
5 分离培养
可将肠道内容物接种血平板，37 ℃厌氧培养18～24 h后观察。菌落特点：魏氏梭菌在血平板上可形成直径2～5 mm、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄色、表面光滑半透明、圆屋顶状菌落，有双层溶血环。可通过镜检对形态进一步确定。
6 生化鉴定
对牛乳培养基的“暴烈发酵”。
7 肠内毒素检查
采集空肠后段或结肠前段内容物，加适量生理盐水稀释，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份加热（60 ℃ 30min）。两份上清液分别静脉注射家兔（1～3ml）或小鼠（0.1～0.3ml）。如有毒素存在，不加热组动物常于数分钟至数小时内死亡，而加热组动物不死亡。
8 报告
因为正常人畜肠道内存在此菌，并且发病菌主要靠在肠道内产生毒素致病，细菌本身并不侵入机体。因此只有细菌分离和肠毒素检查都符合，并结合临床症状才能报告产气荚膜梭菌感染。鉴别A型和C型要靠中和保护试验。

四、猪痢疾诊断
1 引用标准
参考NY/T 545-2002。
2 范围
适用于猪痢疾（SD）的实验室诊断。
3 粪便中Sh显微镜检查
3.1 材料
3.1.1 器材：显微镜，暗视野镜头，玻片及盖玻片，酒精灯等
3.1.2 染色液：结晶紫染色液或稀释的石炭酸复红。
3.1.3 样品：病猪新鲜粪便（含粘）或直肠拭子或大肠内容物及黏膜
3.2 操作方法
3.2.1 染色样品制作：取样品直接抹片，干燥，火焰固定，以1.2.2结晶紫液或稀释复红染色2 min~3 min，水洗，吸干后待检。
3.2.3 悬滴样品制作：取样品少许悬于生理盐水，待检。
每份样品最少制片2张
3.2.4 显微镜检查：染色样品以油镜直接观察，悬滴样品在暗视野400~1000倍镜头下观察。
3.3 结果判定
典型Sh菌体长6 μm~8.5 μm，呈2~5个密螺旋体，两端尖锐，呈蛇样活泼运动。当视野中有数量（3~5条以上）Sh样菌体时，在获培养前，可作为诊断的重要参考。
4 分离培养和鉴定
4.1 材料准备
4.1.1 器材：厌氧培养装置及使用方法，细菌学实验常规器材，外科手术器材，微孔滤器和0.65 μm滤膜。
4.1.2 试验动物：小鼠（20 g左右）
4.1.3 试剂：PBS(0.01M，pH7.2)，生理盐水，多粘菌素，TSA。
4.1.4 样品：病猪新鲜粪便或大肠粘膜刮取物（含粘液）。对死猪或扑杀猪大肠分段结扎（每段10cm），分离取出。样品应尽早分离培养，也可0～4 ℃保存4～7 d。
4.2 操作方法
4.2.1 样品种Sh镜检
将样品少许摸片染色或作成悬滴标本，镜检，观察Sh有无活力。含菌量少且无活力者，则难以分离成功。
4.2.2 分离培养
4.2.2.1 直接划线分离法：即取样品直接在TSA上划线接种若干皿。
4.2.2.2 集菌法：先将样品以生理盐水或PBS作1：5稀释，2000 r/min，弃去沉淀。将上清液再以6000～8000 r/min离心20 min。取沉淀划线接种TSA若干皿。
4.2.2.3 稀释法：将样品或集菌法的沉淀物作10倍梯度稀释至10-6～10-8。取各梯度稀释液各1滴，分别划线接种于TSA上，（每梯度稀释液最少接种3皿）。接种后的培养皿置厌氧罐内进行厌氧培养。若上述稀释液中加入多粘菌素200 U/mL～300 U/mL，可提高分离率。
4.3 结果判定
4.3.1 观察
每隔2～4 d开罐检查一次，共2～4次，观察有无溶血区及溶血菌落。
致病性Sh呈强β溶血，一般看不见菌落。当培养条件适宜时，再溶血区可见到云雾状菌苔。无害蛇样螺旋体等呈弱β溶血。
4.3.2 移植纯化
先作溶血区内物质涂片，染色镜检。如见Sh样菌体，可在无菌落溶血区内移取小块琼脂划线于TSA若干皿。如此每隔2天移植一次，一般2~4次后即可纯化和保存。
4.3.3猪蛇样螺旋体鉴定
4.3.3.1 溶血试验
将猪蛇样螺旋体、无害蛇样螺旋体或毛肠蛇样螺旋体及被检菌株，分别划线于同一TSA上不同区内，经48 h培养后，观察比较其溶血程度。
4.3.3.2 肠致病性试验
每菌株至少接种6只小鼠，将小鼠停饲24 h后，每只每次灌服1 mL（含菌3～5亿），次日再灌服一次，15 d后剖检观察盲肠病变。感染后50％出现腹泻和病变者，则为致病性Sh。

五、猪巴氏杆菌病诊断技术
1 引用标准
参考NY/T 564-2002。
2 范围
适用于猪巴氏杆菌病的检测。
3 材料
3.1 改良马丁氏琼脂
3.2 马丁氏肉汤
3.3 常用生化培养基。
4 组织染色镜检
用肝脏组织或心血摸片或纯培养物染色呈阴性，瑞氏染色呈两极浓染的球杆菌。
5 病原分离鉴定
将濒死前或死后数小时内以无菌手术采取病死猪的心血、肝脏组织，接种于改良马丁氏琼脂斜面，进行分离。培养18～24 h后，改良马丁琼脂斜面生长纯粹的培养物，呈微蓝色菌台或菌落。马丁肉汤培养物生长为均匀浑浊，不产生菌膜。
6 生化鉴定
本菌发酵葡萄糖、果糖、半乳糖，多数发酵蔗糖，不发酵乳糖、肌醇、菊糖、水杨素及鼠李糖，吲哚试验和氧化酶试验阳性。
7 诊断判定
根据临床症状和病理变化，加上涂片染色镜检，可对本病作出初步的诊断，但确诊要靠病原分离鉴定。

六、猪链球菌病诊断技术
1 引用标准
参考GB/T 199 15.2-2005和GB/T 199 15.9-2005
2 范围
适用于猪链球菌病诊断。
3 材料
3.1 绵羊血琼脂
4 组织染色镜检
对最急性和急性病例，无菌采取集病死猪的心、肝、脾、肺、肾和淋巴结等组织做触片，姬姆萨染色，链球菌可见较纯的单个或成双的圆形或椭圆形球菌, 有少量形成短链和长链，如见链球菌则表明病料中可能含有链球菌。
5 病原分离鉴定
无菌取心、肝、脾、肺、肾或淋巴结内部组织划线接种普通琼脂绵羊血平板，36±1℃培养24±2 h，如果菌落生长缓慢，可延长至48±2 h后观察。
如果是猪链球菌2型，培养24 h，在普通琼脂绵羊血平板形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径0.3 mm～1mm，大多数菌株呈α溶血，部分菌株产生β溶血。
将可疑菌落做革兰氏染色和过氧化氢酶试验。本菌为革兰氏阳性球菌，菌体直径μl固体培养物以双球菌为多，少量呈3个～5个排列的短链，液体培养物以链状为主，无芽孢，能形成荚膜。本菌过氧化氢酶试验均为阴性。
菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态和过氧化氢试验符合者，可初步确定为链球菌。
6 生化鉴定
经初步鉴定后，做5％乳糖、海藻糖、七叶苷、甘露醇、山梨醇、马尿酸钠等糖发酵试验。
7 PCR鉴定是否为猪链球菌2型
必要时进行猪链球菌2型毒力因子PCR检测。
7.1 仪器：台式高速（12000 r/min）离心机；DNA扩增仪；水浴锅；稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；电泳凝胶成相分析系统；可调移液器一套，包括1～20 μL 2支，20～200μL 1支，200～1000μL 1支；与移液器匹配的滴头；1.5 mL离心管；0.5 mL或0.2 mL（与扩增仪配套）塑料管。
7.2 试剂
7.2.1 细菌DNA提取试剂盒
7.2.2 2.5 mmol/L dNTP
7.2.3 10×PCR Buffer
7.2.4 25 mmol/L MgCl2
7.2.5 10 pmol/L引物
7.2.6 Taq DNA聚合酶
7.2.7 50×TAE（保存液）和1×TAE（使用液）
7.2.8 琼脂糖：电泳级
7.2.9 CYBgreen
7.3 PCR引物
根据猪链球菌2型溶血素基因设计引物，引物序列如下，其目的片断长度为495 bp。
sly1：5’-CCCAAGTTCAAGCCGCATTTA-3’(1542)
sly2：5’-GAAGATTGCGAGCATTTCCTG-3’(2036)
7.4 DNA提取
利用对数生长期的液体培养物，严格按照DNA提取试剂盒说明书进行。
7.5 PCR扩增
反应体系25μL：
细菌总DNA 5.0μL
10 pmol/μL的上游引物 1.0μL
10 pmol/μL的下游引物 1.0μL
2.5 mmol/L dNTPs混合物 2.0μL
10×PCR Buffer 2.5μL
25 mmol/L的MgCl2 2.0μL
5 U的TaqDNA聚合酶 0.3μL
双蒸水补至25μL。
循环参数：
95 ℃预变性 5 min；
94 ℃变性 1 min；
56 ℃退火 1 min； 共35个循环，
72 ℃延伸 1 min；
72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
7.6 电泳检测
取1.5g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取8～10μl PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液和CYBgreen混合后加样，进行电泳。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3 V/cm～5V/cm，电泳时间为30 min～35 min。将电泳好的凝胶放紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果。
阳性对照的PCR产物电泳后在495 bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立。在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在495 bp的位置上出现一条特异性条带，判为该菌株含有猪链球菌2型溶血素基因。

七、副猪嗜血杆菌（Hps）PCR诊断技术
1 引用标准
自定标准。
2 范围
副猪嗜血杆菌诊断。
3材料
3.1 仪器：台式高速（12000 r/min）离心机；DNA扩增仪；水浴锅；稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；电泳凝胶成相分析系统；可调移液器一套，包括1～20 μL 2支，20～200μL 1支，200～1000μL 1支；与移液器匹配的滴头；1.5 mL离心管；0.5 mL或0.2 mL（与扩增仪配套）塑料管。
3.2 试剂
3.2.1 TSA培养基
3.2.2 TSB培养基
3.2.3 10 mmol/L Tris/1 mmol/L EDTA溶液中
3.2.4 溶菌buffer (0.0005%Tween20，0.24 mg/mL proteinaseK和0.1 mol/L Tris，pH8.5)
3.2.5 2.5 mmol/L dNTP
3.2.6 10×PCR Buffer
3.2.7 25 mmol/L MgCl2
3.2.8 10 pmol/L引物
3.2.9 50×TAE（保存液）和1×TAE（使用液）
3.2.10 Loading Buffer
3.2.11 琼脂糖
3.2.12 CYBgreen
4 操作方法
4.1 镜检
对从临床症状疑似副猪嗜血杆菌病的发病仔猪的肺和脾作组织触片，革兰氏染色，副猪嗜血杆菌镜检呈革兰氏阴性小球杆菌。
4.2 分离培养
取出患病仔猪病变肺、气管分泌物、胸水、腹水及脾组织，划线接种于TSA平板。37 ℃，5%CO2培养24～48ｈ。副猪嗜血杆菌呈无色、透明、湿润、光滑的露珠样细小菌落，革兰氏染色呈阴性小球杆菌，老龄培养物呈多形态(细小杆状、短链状和长丝状)。
4. 3 PCR引物设计
HP 16S1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′
HP 16S2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′
该引物扩增出编码16SrRNA的DNA部分片段，长度为822 bp。
tbpA55：5′-TTAGCCTTGCTCTTCTTAGCC-3′
tbpA33：5′-AAGCTTGAAACTAAGGTACTCTAA-3′
该引物扩增出编码转铁结合蛋白A的DNA部分片段，长度为1.9 kb。
4.4 细菌DNA提取
将TSA平板上典型菌落接种TSB，37 ℃过夜培养，取对数生长期分离菌悬浮于10 mmol/L Tris/ 1 mmol/L EDTA溶液中，10000 r/min离心5min；弃上清，沉淀用溶菌buffer重悬；56 ℃作用30 min；最后煮沸15 min；12000 r/min离心5min；收集上清，-20 ℃保存备用。
注：DNA的提取可以用试剂盒，按试剂盒操作说明进行，以节省时间，减少DNA损失。
4.5 编码16S rRNA的DNA部分片段的扩增
反应体系25μL：
细菌总DNA 2.0μL
10 pmol/μL的上游引物 1.0μL
10 pmol/μL的下游引物 1.0μL
2.5 mmol/L dNTPs混合物 2.0μL
无Mg2+缓冲液 2.5μL
25 mmol/L的MgCl2 1.5μL
5 U的TaqDNA聚合酶 0.3μL
双蒸水补至25μL。
循环参数：
95 ℃预变性 5 min；
94 ℃变性 30 s；
59℃退火 30 s； 共30个循环，
72 ℃延伸 90 s；
72 ℃延伸 10 min。
4.6 编码tbpA的DNA部分片段的扩增
反应体系同4.5，循环参数为：
94 ℃预变性 5 min;
94 ℃变性 1 min；
50 ℃退火 1 min； 共30个循环
72℃延伸 2 min；
最后72 ℃延伸 10 min。
4.7 结果分析与判定
4.7.1 1％琼脂糖凝胶板的制备
称取1 g琼脂糖，加入100 mL 1×TAE中，加热融化后，倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5 mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样空），放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
4.7.2 加样
取6～8 μL PCR扩增产物和2～3 μL加样缓冲液和适量CYBgreen混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加1孔阳性对照的扩增产物作为对照，没有阳性对照的情况下，一定加Marker。
4.7.3 电泳
电压80～100 V，或电流40～50 mA，电泳30～40 min。
4.8.4 结果观察与判定
电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上，打开紫外灯观察。如某一待检样品扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上，即他们与加样孔的距离相同，或根据Marker判定大小与设计的大小（820 bp和1.9 kb）一致，则该样品判定为阳性。
5 诊断判定
同份样品在2个PCR中全部阳性的才可以判为本猪（群）已经感染Hps，根据流行病学、临床症状和病理变化判定猪群是否发病。

八、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）PCR检测技术
1 引用标准
自定标准。
2 范围
适用于PRRS的PCR诊断。
3材料
3.1 仪器：组织匀浆机；低温台式高速（12000 r/min）离心机；DNA扩增仪；水浴锅；稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；电泳凝胶成相分析系统；可调移液器一套，包括1～20 μL 2支，20～200μL 1支，200～1000μL 1支；与移液器匹配的滴头；1.5 mL离心管；0.5 mL或0.2 mL（与扩增仪配套）塑料管。
3.2 试剂
3.2.1 Trizol试剂
3.2.2 氯仿
3.2.3异丙醇
3.2.4 反转录酶M-MLV（200 U/µL）
3.3.5 75%乙醇
3.2.6 0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液
3.2.7 2.5 mmol/L dNTP
3.2.8 10×PCR Buffer
3.2.9 25 mmol/L MgCl2
3.2.10 10 pmol/L引物
3.2.11 50×TAE（保存液）和1×TAE（使用液）
3.2.12 Loading Buffer
3.2.13 琼脂糖
3.2.14 Oligo(dT)18（50 μmol/L）
3.2.15 CYBgreen
4 操作步骤
4.1 样品采集
取疑似猪的肺脏、淋巴结和脾脏病变部位组织，-20 ℃保存备用。
4.2 样品处理
取部分组织样品，磨碎并用0.01M PBS（PH 7.2~7.4）稀释成1: 5乳剂（或将病料用剪刀剪成小块，放入5 mL青霉素小瓶，进一步剪碎，按5倍体积的0.01M PBS后，用匀浆机匀浆），-20℃保存备用或立即用于RNA提取。
4.3 RNA的提取
a) 取处理好的稀释样品200~300 µL，加入700 µL TRIZOL试剂，涡悬混匀，在15~30 ℃温育2~3 min；加入200 µL的氯仿，盖紧管盖，上下颠倒混匀15 s，15~30℃温育2~3 min，2~8 ℃ 12000 g离心15 min；
b) 转移水相500 µL到一新的离心管中，加入0.5 mL的异丙醇，15~30℃作用10 min，2~8 ℃ 12000 g离心10 min；
c) 弃去上清液，加入75%乙醇1.0 mL，振摇，2~8 ℃ 7500 g离心5 min；
d) 弃去上清，干燥沉淀物（室温约5 min）；加入20 µL DEPC水溶解，-20 ℃保存或立即使用（置冰上）。
4.4 引物设计
根据文献和PRRSV代表株VR2332和LV设计了一对引物：
PRRSV N1： 5′-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′
PRRSV N2： 5′-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3′
4.5 RT
总体积为10 µL，反应体系如下：
5×RT buffer 2.0 µL
dNTP（10 mmol/L） 0.25 µL
Oligo(dT)18 0.5 µL
RNA 模板 7 µL
混匀离心，65 ℃作用10 min，冰上冷却，加入M-MLV （200 U/µL） 0.25 µL，42℃1h，冰上冷却后作为PCR模板。
4.6 PCR
PCR 反应总体积为25 µL，包括：
2条PRRSV引物（10 pmol/µL） 各1 µL
Mg++(25 mmol/L) 1.5 µL
dNTP (2.5 mmol/L) 2.0 µL
10×Buffer 2.5 µL
Taq 酶（5 U/µL） 0.2 µL
模板cDNA 5 µL
灭菌双蒸水 11.8 µL
瞬时离心混匀，将PCR反应管置于PCR仪内。PCR反应参数为：
95℃预变性 5 min；
94℃ 45 min；
51℃ 45 min； 共35个循环，
72℃ 1 min；
72℃延伸 10 min。
将PCR产物放4 ℃保存或立即做琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物。
4.7 结果分析与判定
4.7.1 1.5％琼脂糖凝胶板的制备
称取1.5 g琼脂糖，加入100 mL 1×TAE中，加热融化后，倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5 mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样空），放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
4.7.2 加样
取6～8 μL PCR扩增产物和2～3 μL加样缓冲液和和适量CYBgreen混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加1孔阳性对照的扩增产物作为对照，没有阳性对照的情况下，一定加Marker。
4.7.3 电泳
电压80～100 V，或电流40～50 mA，电泳30～40 min。
4.7.4 结果观察与判定
电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上，打开紫外灯观察。如某一待检样品扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上，即他们与加样孔的距离相同，或根据Marker判定大小与设计的大小（400 bp或430 kb）一致，则该样品判定为阳性。
5 诊断判定
PCR检测结果阳性，表明该猪（群）已感染PRRSV，根据流行病学、临床症状和病理变化判定猪群是否发病。

九、古典猪瘟（CSFV）PCR检测技术
1 引用标准
自定标准。
2 范围
适用于古典猪瘟（CSFV）的PCR诊断。
3材料
3.1 仪器：组织匀浆机；低温台式高速（13000～20000 r/min）离心机；DNA扩增仪；水浴锅；稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；电泳凝胶成相分析系统；可调移液器一套，包括1～20 μL 2支，20～200μL 1支，200～1000μL 1支；与移液器匹配的滴头；1.5 mL离心管；0.5 mL或0.2 mL（与扩增仪配套）塑料管。
3.2 试剂
3.2.1 Trizol试剂
3.2.2 氯仿
3.2.3 异丙醇
3.2.4 反转录酶M-MLV（200 U/µL）
3.3.5 75%乙醇
3.2.6 0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液
3.2.7 2.5 mmol/L dNTP
3.2.8 10×PCR Buffer
3.2.9 25 mmol/L MgCl2
3.2.10 10 μmol/L引物
3.2.11 50×TAE（保存液）和1×TAE（使用液）
3.2.12 Loading Buffer
3.2.13 琼脂糖
3.2.14 BSA(0.4 mg/mL)
7.2.15 CYBgreen
4 操作方法
4.1 病料采集：可用于检测的病料包括扁桃体、淋巴结、脾脏和母猪流产胎儿及死胎(扁桃体、淋巴结和脾脏)，-20 ℃保存备用。
4.2 病料处理：取部分材料0.5～2.0 g于无菌研钵，磨碎并用PBS（0.01M, PH 7.2~7.4）稀释成1: 5乳剂（或将病料用剪刀剪成小块，放入5 mL青霉素小瓶，进一步剪碎，按5倍体积的PBS后，用匀浆机匀浆），-20 ℃保存备用或立即用于RNA提取。
4.3 RNA提取
a) 取处理好的稀释样品200～300 µL，加入700 µL TRIZOL试剂，涡悬混匀，在15~30 ℃温育2~3 min；加入200 µL的氯仿，盖紧管盖，上下颠倒混匀15 s，15~30℃温育2~3 min，2~8 ℃ 12000 g离心15 min；
b) 转移水相500 µL到一新的离心管中，加入0.5 mL的异丙醇，15~30℃作用10 min，2~8 ℃ 12000 g离心10 min；
c) 弃去上清液，加入75%乙醇1.0 mL，振摇，2~8 ℃ 7500 g离心5 min；
d) 弃去上清，干燥沉淀物（室温约5 min）；加入20 µL DEPC水溶解，-20 ℃保存或立即使用（置冰上）。
4.4 引物设计
根据华中农业大学2004年在Genbank中公开发表的序列DQ127910设计的引物，产物大小为374bp，引物序列如下：
gE1: 5'-CCACCCGACGCTACGATTGT-3'
gE2: 5'-CTGGCATCCATCATTCCCTG-3'
4.5 RT
以提取到的组织总RNA为模板，进行反转录，反转录体系为20µL。
反转录体系如下：
RNA 7 µL
10 μmol/L引物(gE1/gE2) 1 µL
于70℃水浴中5分钟，然后室温冷却10分钟；再加入：
dNTP (10 mM) 1 µL
5×M-MLV buffer 4 µL
BSA(0.4 mg/mL) 5 µL
M-MLV 反转录酶 1 µL
混均后，37℃水浴45-60分钟。-20℃保存。
4.6 PCR扩增反应
cDNA 5.0 µL
10×PCR buffer 2.5 µL
dNTP (2.5 mM) 2.0 µL
MgCl2（25 mM） 1.5 µL
上游引物（10 μmol/L） 1.0 µL
下游引物（10 μmol/L） 1.0 µL
Taq DNA聚合酶（5 U） 0.2 µL
灭菌双蒸水 1.8 µL
配好反应液后，将PCR反应管置于PCR仪内，循环参数如下：
95 ℃ 5 min
94 ℃ 45 min;
56 ℃ 45 min; 共35个循环
72 ℃ 1 min；
72 ℃ 10 min
将PCR产物放4 ℃保存或立即做琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物。
4.7 结果分析与判定
4.7.1 1.5％琼脂糖凝胶板的制备
称取1.5 g琼脂糖，加入100 mL 1×TAE中，加热融化后，倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5 mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样空），放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
4.7.2 加样
取6～8