C、N、P、S循环主要相关酶酶活测定 (2).doc

C、N、P、S循环主要相关酶酶活测定
林叶春
2010-01-05
A. 芳基酰胺酶(Arylamidase，EC3.4.11.2) 1g土样
-试剂： 0.1M pH8.0Tris缓冲液[2.44g三羟甲基氨基甲烷溶于50ml去离子水中，用0.05M H2SO4调节pH至8.0，再用去离子水定容至200ml]；0.05M H2SO4；L-亮氨酸-β-萘胺溶液[称取0.2342g L-亮氨酸-β-萘胺盐酸盐溶于适量去离子水中，并定容至100ml，即为8.0mM溶液]；盐酸化乙醇[将4.32ml浓盐酸加入到适量95%的乙醇中，并用乙醇定容至200ml，即为盐酸化乙醇]；4-二甲基氨基肉桂醛(CAS:6203-18-5)溶液[称取0.12g 4-二甲基氨基肉桂醛溶于95%乙醇中，并用乙醇定容至200ml，即为0.6mg/ml的溶液]；β-萘胺标准溶液[称取12.5mg β-萘胺于100ml容量瓶中，加入5ml乙醇和75ml去离子水，充分摇匀，再用去离子水定容至100ml，即为125μg/ml的β-萘胺标准溶液]。
-仪器：分光光度计(540nm)；25ml三角瓶；摇床；培养箱；离心机；试管
-操作：取1.0g新鲜土壤(<2mm)于25ml三角瓶中，加入3ml 0.1M pH8.0 Tris缓冲液和1ml 8.0mM L-亮氨酸-β-萘胺溶液，盖上瓶塞，充分混匀，于37℃培养1h，再加入6ml 95%乙醇，混匀。将上述悬液转移至离心管中，17000×g离心1min，将上清液转移至试管中。取此上清液1ml于另一支试管中，加入1ml乙醇、2ml盐酸化乙醇和2ml 4-二甲基氨基肉桂醛溶液，充分混匀，于540nm处比色测定。对照样，在培养结束之后再加入1ml8.0mM L-亮氨酸-β-萘胺溶液。
-校准曲线制作：分别量取1，2，3，4，5和6 ml 125μg/ml β-萘胺标准溶液于25ml的容量瓶中，用去离子水定容，即得5，10，15，20，25和30μg/ml β-萘胺工作溶液。取上述工作液各1ml于试管中，分别加入1ml95%乙醇、2ml盐酸化乙醇和2ml 4-二甲基氨基肉桂醛溶液，摇匀后于540nm处比色。
-结果： 芳基酰胺酶活性(μg β-萘胺·g-1·h-1) = CV/(dwt×t)
其中，C为样品β-萘胺含量(μg/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g)；t为反应时间(h)。
V. Acosta-Martínez and M. A. Tabatabai. Arylamidase activity of soils. Soil Sci. Soc. Am. J. 2000,64:215-221.

B. β-葡糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21) 1g土样
-试剂：甲苯；pH值6.0MUB缓冲液；0.5mol/L NaOH；0.5mol/L CaCl2溶液；p-硝基酚标准溶液[参见磷酸酶测定]；pH12.0Tris缓冲液[12.2g三羟甲基氨基甲烷溶于800ml去离子水中，用0.5mol/L的NaOH调节pH至12.0，去离子水稀释至1L]；对-硝基酚-β-D-葡糖苷(PNG)溶液[0.377g PNG溶于40ml MUB缓冲液中，用相同的缓冲液稀释至50ml，在4℃下贮存]；去离子水
MUB缓冲液(Modified Universal Buffer Solution): 将12.1 g三羟甲基氨基甲烷（THAM），11.6 g顺丁烯二酸(马来酸)，14.0 g柠檬酸和6.3 g硼酸（H3BO3）于500ml 1 mol·L-1 NaOH溶液中，再用去离子水稀释至1L，贮于4°冰箱中。
1.改进的MUB(pH6.0):取200ml储备液于配有磁力搅拌器的500ml烧杯中，滴入0.1N的HCl搅拌至pH6.0,水定容至1L.
2.改进的MUB(pH11):取200ml储备液于配有磁力搅拌器的500ml烧杯中，滴入0.1NNaOH的搅拌至pH11,水定容至1L.
-仪器：分光光度计(400nm)；25ml三角瓶；恒温水浴；摇床；漏斗；滤纸
-操作：取1.00g新鲜土壤(<2mm)于25ml三角瓶中，加入0.25ml甲苯、4.00ml pH值6.0MUB溶液和1.00ml PNG溶液，盖上瓶塞，充分混匀，于37℃培养1h。然后加入1.00ml 0.5M CaCl2溶液和4.00ml 0.1M pH值12.0的Tris缓冲液中止反应，摇匀，悬液1500×g10 min，上清液在400nm处比色测定。做空白对照时，必需在培养结束之后，加CaCl2溶液和Tris缓冲液之后加入底物PNG溶液。每个样品必需做一个空白和三次重复。
-标准曲线制作：取1ml对-硝基酚标准溶液于100ml容量瓶中，用去离子水定容至刻度，再分别取该稀释液0，1，2，3，4和5ml于50ml三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至5ml(即为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μg/ml的对-硝基酚工作液)，然后加入1.00ml0.5M CaCl2溶液和4.00ml 0.5M NaOH溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定。
-结果： β-葡糖苷酶活性(μg对-硝基酚·g-1·h-1) = CV/(dwt×t)
其中，C为样品对-硝基酚含量(μg/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g)；t为反应时间(h)。
(1.Tabatabai M.A.,1994.Enzymes. In: Weaver, R.W., Augle, S, Bottomly, P.J., Bezdicek, D., Smith, S., Tabatabai, A., Wollum, A. (Eds.), Methods of soil analysis. Part 2. Microbiological and biochemical properties. No. 5. Soil Science Society of America, Madison, pp.775-833.
2.F. Eivazi and M. A.Tabatabai.1988.Glucosidases and Galactosidases in Soils.Soil Biol. Biochem.5.Vol.20,pp
.601-606.)

C. 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，EC3.1.3.1) 1g土样
-试剂：通用缓冲溶液(MUB)贮备液[改进的MUB(pH11):取200ml储备液于配有磁力搅拌器的500ml烧杯中，滴入0.1N NaOH的搅拌至pH11.0，去离子水定容至1L.]；25mmol/L对-硝基酚磷酸钠溶液(PNP溶液)[0.420g对-硝基酚磷酸二钠溶于40ml pH11.0 MUB溶液中，用相同的pH值缓冲液稀释至50ml，于4℃下保存。]；0.5mol/LCaCl2溶液[73.5g CaCl2溶于少量去离子水中，并稀释至1L]；0.5mol/L NaOH[20g NaOH溶于1L去离子水中]；对-硝基酚标准溶液[1g对-硝基酚溶于少量去离子水中，并稀释定容至1L，于4℃下保存。]；甲苯；去离子水
-仪器：分光光度计(400nm)；培养箱；摇床；50ml三角瓶；50/100ml容量瓶；恒温水浴
-操作：取1.00g新鲜土壤(<2mm)于50ml三角瓶中，加入0.25ml甲苯(泥炭土加5ml)、4.00ml pH11.0 MUB缓冲液和1.00ml用相同的缓冲液配制的对-硝基酚磷酸钠溶液，盖上瓶塞，充分混匀后，37℃下培养1h，然后加入1.00mlCaCl2溶液和4.00ml NaOH溶液，摇匀后迅速过滤，于400nm处比色。同时做空白对照，加对-硝基酚磷酸钠溶液之前加入CaCl2溶液和NaOH溶液，并迅速过滤。每个样品三次重复。
-标准曲线制作：取1ml对-硝基酚标准溶液于100ml容量瓶中， 用去离子水定容至刻度，再分别取该稀释液0，1，2，3，4和5ml于50ml三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至5ml，然后加入1.00ml0.5M CaCl2溶液和4.00ml 0.5M NaOH溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定。
-结果： 土壤磷酸酶活性(μg对-硝基酚/g·h) = CV/(dwt×t)
其中，C为样品中对-硝基酚含量(μg/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量；t为反应时间(h)。
(1. 吴金水,等.土壤微生物生物量测定方法及其应用[M].北京:气象出版社,2006,128-129.
(2. Tabatabai M.A., 1982. Soil.Enzymes. In: Weaver, A.L., Page, R.H, Miller and D.R., Keeney, D. (Eds.), Methods of soil analysis. Part 2. Microbiological and biochemical properties, Second Edition, No. 9. Soil Science Society of America, Madison, pp.903-943.)

D. 芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase，EC3.1.6.1) 1g土样
-试剂：甲苯；醋酸；醋酸钠[称取醋酸钠水合物68g溶于700ml蒸馏水中，用醋酸调节pH至5.8，再用蒸馏水定容至1000ml即得]；CaCl2；NaOH；0.025M p-硝基酚硫酸酯溶液[0.312g p-硝基酚硫酸钾溶于少量pH值5.8的醋酸缓冲液中，并用醋酸缓冲液定容至100ml，存于4℃下。]
-仪器：分光光度计(400nm)；50ml三角瓶；摇床；滤纸；恒温水浴；漏斗
-操作：取1.00g鲜土(<2mm)于50ml三角瓶中，加入0.25ml甲苯、4.00ml 0.5M pH值5.8醋酸缓冲液和1.00ml 0.005M对-硝基酚硫酸酯溶液，混匀，盖上瓶塞，在37℃下培养1h，再加入1.00ml 0.5mol/L CaCl2溶液和4.00ml 0.5mol/L NaOH溶液，混匀，慢性滤纸过滤，400nm处比色，空白对照应在加入CaCl2和NaOH溶液之后加底物，并迅速过滤。
-标准曲线制作：取1ml对-硝基酚标准溶液于100ml容量瓶中， 用去离子水定容至刻度，再分别取该稀释液0，1，2，3，4和5ml于50ml三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至5ml，然后加入1.00ml0.5M CaCl2溶液和4.00ml 0.5M NaOH溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定。
-结果： 芳基硫酸酯酶活性(μg对-硝基酚·(g·h)-1 = CV/(dwt×t)
其中，C为测定样品中对-硝基酚的含量(μg/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g) ；t为反应时间(h)。
(1.吴金水,等.土壤微生物生物量测定方法及其应用[M].北京:气象出版社,2006,133-134.
2.Tabatabai MA, Bremner JM (1970). Arysulphatase activity of soils. Soil Sci Soc Am Proc 34:225-229.)

E. 脱氢酶(Dehydrogenase，EC1.1.1.1) 20g土样
-试剂：甲醇；碳酸钙；2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)，3%[3g TTC溶于80ml去离子水，稀释至100ml]；三苯基甲臜(TPF)标准溶液[100mg TPF溶于80ml甲醇，用甲醇定容至100ml，混匀。取10ml此溶液用甲醇稀释至100ml，即得100μg/ml TPF标准溶液]
-仪器：分光光度计(485nm)；试管(16mm×150mm)；漏斗；玻璃棒；脱脂棉
-操作：取20.00g新鲜土壤(<2mm)与0.20g CaCO3混匀，再从中称取三份6.00g土壤于玻璃试管中，每管加入1ml 3%的TTC溶液和2.5ml去离子水，用玻璃棒搅拌混匀，盖紧后于37℃培养24h。再加入10ml甲醇，盖紧摇匀1min。用塞有脱脂棉的漏斗过滤，用甲醇洗涤玻璃试管，将管中土壤全部转移至漏斗上。再加入甲醇于漏斗上直至棉塞上的红色消失为止，滤液用甲醇定容至100ml。以甲醇做空白对照，在485nm处比色。
-标准曲线制作：吸取10mlTPF标准溶液，并用甲醇定容至100ml，得到100μg/ml TPF溶液。分别吸取0，5，10，15，20和25 ml 100μg/ml TPF溶液于100ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，即得0，5，10，15，20和25μg/ml系列TPF工作液，摇匀后同试样于485nm处比色，绘制TPF标准曲线。
-结果： 土壤脱氢酶活性(μg TPF·g-1·h-1) = CV/(dwt×t)
其中，C为滤液的TPF量(μg/ml)；V为滤液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g)；t为反应时间(h)。
(1. 吴金水,等.土壤微生物生物量测定方法及其应用[M].北京:气象出版社,2006,135-135.
(2. Tabatabai M.A., 1982. Soil.Enzymes. In: Weaver, A.L., Page, R.H, Miller and D.R., Keeney, D. (Eds.), Methods of soil analysis. Part 2. Microbiological and biochemical properties, Second Edition, No. 9. Soil Science Society of America, Madison, pp.903-943.)
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