老鼠粪便中粪固醇的检测.pdf

http:/ 老鼠粪便中粪固醇的检测老鼠粪便中粪固醇的检测 徐扬 吉林大学生命科学学院，长春（130012）Email：摘摘 要：要：本文介绍了一种气相色谱/质谱选择离子模式（GC/MS-SIM)检测老鼠粪便中粪固醇的方法。在老鼠粪便中已检测出粪醇、差向异构-粪醇、胆固醇、24-乙基-粪醇等。结果表明，这些粪固醇可以作为老鼠粪便污染的指示物。关键词：关键词：老鼠，粪便，粪固醇，指示物 中图分类号：中图分类号：X502 文献标识码：文献标识码：A 1.引言引言 科学家早已发现，-甾烷醇可以较好地鉴别各种动物的粪便来源。因而，很多研究已将这些生物标志物作为动物污染的指示物。5-甾烷醇是一类典型的甾族类生物标志物，通常是由较高等动物肠中大肠杆菌作为触媒，将胆固醇（胆甾-5-烯-3-醇）及其高分子同系物 24-甲基-胆固醇（24-甲基-胆甾-5-烯-3-醇）、24-乙基-胆固醇（24-乙基-胆甾-5-烯-3-醇）、24-乙基-胆甾-5，22-二烯-3-醇等，经5双键氢化还原转化而形成的一系列甾族类化合物。上述生物加氢化反应，只形成 5-氢异构体，不能形成 5-氢异构体。5-氢异构体，只有在需氧菌参与时才能形成 1，2。胆固醇转化为粪醇（5-胆甾-3-醇），通常需要经历C-3 位上羟基的一系列氧化过程，如形成胆甾-5-烯-3-酮、胆甾-4-烯-3-酮、5-胆甾-3-酮等中间体3-5；形成的粪醇（5-胆甾-3-醇），是人粪便中主要的 5-甾烷醇，约占总固醇的 60%6；在其它动物粪便中这种 5-C27甾烷醇含量较低；草食动物（如牛、羊等），因喂养富含C28 菜油固醇和C29 谷甾醇饵料，粪便中 5-C28 甾烷醇和 5-C29 甾烷醇的含量较高，如 24-甲基-5-胆甾-3-醇、24-乙基-5-胆甾-3-醇；狗和鸟类粪便中很少含有 5-胆甾-3-醇7；而狗粪便中富含胆固醇，鸟类粪便中却富含胆固醇和谷甾醇。用微生物学指标（如：耐热大肠杆菌thermotolerant coliform等）不能鉴别狗和鸟类等粪便污染的来源8。5-甾烷醇及其比值指标，已被应用于各种污染指示物的研究中9-13。Bethell等用5-胆甾-3-醇/24-乙基-5-胆甾-3-醇的比值指标作为污染指数，较好地区分了人类粪便与草食动物（如牛和羊）粪便的来源14,15。Leeming R等用5-胆甾-3-醇/（5-胆甾-3-醇+24-乙基-5-胆甾-3-醇）的比值指标，指示了不同来源的粪便污染状况16。目前，尚未见到有关老鼠粪便中粪甾醇测定的研究报道。鉴于此，本文应用毛细管GC/MS-SIM检测老鼠粪便中的粪甾醇，旨在为我国生态监测方法提供基础资料。2.材料和方法材料和方法 2.1 样品来源样品来源 在野外诱捕野生老鼠一只，放入干净木盒中，待老鼠排出粪便后，及时收集新鲜粪便，置于烧杯中，阴干后，转移到棕色玻璃瓶中，密封，于冰箱中冷冻保存，待处理。2.2 仪器与试剂仪器与试剂 2.2.1 仪器仪器-1-http:/ Agilent 6890/5973N 气相色谱-质谱联用仪，毛细管柱（HP-5，30m0.25mm0.25m），ZFA型旋转蒸发装置，ULTRA TURRAX ZKA T18 basic 匀浆机，氮吹装置，分液漏斗（1L），KS-型康氏振荡器，浓缩瓶，马脑钵，80 目过滤筛，棕色广口瓶。2.2.2 试剂试剂 二氯甲烷（色谱级，Tedia，USA），无水硫酸钠（300下加热 4h，干燥器中保存），佛罗里硅土（650下加热 6h，加 5%水，混匀后于干燥器中保存），正己烷（色谱级，Tedia，USA），甲醇（分析纯），氢氧化钠（分析纯），氮气（纯度 99.99%），水（Millipore 超纯水）。2.3 实验方法实验方法 2.3.1色谱条件 色谱条件 色谱柱：HP-5 ms,30m0.25mm0.25m；载气：高纯氦气；柱流速：1ml/min；检测器：质谱EI检测；进样口温度：260；进样方式：无分流进样；进样量：1l。柱温条件：初始温度80保持3分钟，然后以5/min的速度升温，在285保持16分钟。2.3.2 质谱条件质谱条件 离子源：四级杆离子源；质量扫描范围mPz：50 amu550amu；电离方式：EI；电子能源：70ev；接口温度：280；离子源温度：230；四极杆温度：150；扫描方式：SIM，溶剂延迟：3min。2.3.3样品的前处理样品的前处理 准确称取阴干后研磨均匀的老鼠粪便样品 5.00g,置于烧杯中，加入 50ml 甲醇和一定量固体氢氧化钠，混匀，至溶液 pH12。依次加入 400ml 水和 50ml 二氯甲烷，振荡 5min，静置 10min，分离水相和二氯甲烷相，将分离后二氯甲烷溶液，过填有 1.0g 无水硫酸钠和 5.0 g佛罗里硅土的玻璃层析柱，收集二氯甲烷溶液于浓缩瓶中。然后再加入 20mL 二氯甲烷淋洗层析柱，重复淋洗两次，合并 3 次淋洗液，旋转蒸发，浓缩至近干，再用正己烷定容至 1.0mL，待测。3.结果与讨论结果与讨论 3.1粪固醇的鉴别粪固醇的鉴别 表 1 为各种粪固醇的学名和俗名。表 2 为老鼠粪便样品中各种粪固醇的鉴别参数。图 1为老鼠粪便样品的总离子流质谱图（GC/MS-TIC）。图 2 是质荷比 m/z 为 373 时抽取的 GC/MS-SIM（m/z：373）谱图。图 3 上部的质谱棒状图为图2中保留时间为46.33min的色谱峰对应的质谱棒状图,图3下部的质谱棒状图为质谱库中粪醇的标准质谱棒状图。图 3 上、下 2 个质谱图的匹配度为 92，检索结果排序为第一（见表 2）。由图 2、图 3 和表 2 可知，图 2 中保留时间为 46.33min 的色谱峰即为粪醇的色谱峰。图 4 是质荷比 m/z 为 388 时抽取的 GC/MS-SIM 谱图。图 5 上部的质谱棒状图为图 4 中保留时间为 46.35min 的色谱峰对应的质谱棒状图，图 5 下部的质谱棒状图为质谱库中差向异构-粪醇的标准质谱棒状图。图 5 上、下 2 个质谱图的匹配度为 49，检索结果排序为第一（见表 2）。由图 4、图 5 和表 2 可知，图 4 中保留时间为 46.35min 的色谱峰即为差向异构-2-http:/ 粪醇的色谱峰。图 6 是质荷比 m/z 为 301 时抽取的 GC/MS-SIM 谱图。图 7 上部的质谱棒状图为图 6中保留时间为 46.94min 的色谱峰对应的质谱棒状图，图 7 下部的质谱棒状图为质谱库中胆固醇的标准质谱棒状图。图 7 上、下 2 个质谱图的匹配度为 99，检索结果排序为第一（见表 2）。由图 6、图 7 以及表 2 可知，图 6 中保留时间为 46.94min 的色谱峰即为胆固醇的色谱峰。图 8 是质荷比 m/z 为 414 时抽取的 GC/MS-SIM 谱图。图 9 上部的质谱棒状图为图 8 中保留时间为 51.10min 的色谱峰对应的质谱棒状图，图 9 下部的质谱棒状图为质谱库中 24-乙基-粪醇的标准质谱棒状图。图 9 上、下 2 个质谱图的匹配度为 90，检索结果排序亦为第一（见表 2）。由图 8、图 9 以及表 2 可知，图 8 中保留时间为 51.10min 的色谱峰即为 24-乙基-粪醇的色谱峰。由表2中重复6次分析的老鼠粪便样品中各种粪固醇的保留时间的变异系数的变化范围0.006%0.019%可知，由毛细管 GC/MS-SIM 定性老鼠粪便样品中各种粪固醇，其鉴别的准确度较高。表 1 粪固醇的命名 序号 学名 俗名 1 5-胆甾-3-醇（5-cholestan-3-ol）粪醇(coprostanol)2 5-胆甾-3-醇（5-cholestan-3-ol）差向异构-粪醇（epicholstanol）3 胆甾-5-烯-3-醇（cholest-5-en-3-ol）胆固醇（cholesterol）4 24-乙基-胆甾-5-烯-3-醇（24-ethylcholest-5-en-3-ol）24-乙基-粪醇（-sitosterol）表 2 老鼠粪便样品中各种粪固醇的鉴别参数 序号 名称 分子式 分 子量 保留时间（min)变 异 系 数（%），n=6特 征 离子（m/z）匹 配度 检 索排序1 粪醇 C27H48O 388 46.33 0.010 373 92 1 2 差向异构-粪醇 C27H48O 388 46.35 0.007 388 49 1 3 胆固醇 C27H46O 386 46.94 0.006 301 99 1 9 24-乙基-粪醇 C29H50O 414 5110 0.019 414 90 1 -3-http:/ 图 1 老鼠粪便样品的总离子流质谱图（GC/MS-TIC）图 2 老鼠粪便样品的 GC/MS-SIM（m/z：373）谱图 图 3 老鼠粪便样品中粪醇的质谱棒状图（上）、质谱库中标准粪醇的质谱棒状图（下）-4-http:/ 图 4 老鼠粪便样品的 GC/MS-SIM（m/z：388）谱图 图 5 老鼠粪便样品中差向异构-粪醇的质谱棒状图（上）、质谱库中标准差向异构-粪醇的质谱棒状图（下）图 6 老鼠粪便样品的 GC/MS-SIM（m/z：301）谱图 -5-http:/ 图 7 老鼠粪便样品中胆固醇的质谱棒状图（上）、质谱库中标准胆固醇的质谱棒状图（下）图 8 老鼠粪便样品的 GC/MS-SIM（m/z：414）谱图 图 9 老鼠粪便样品中 24-乙基-粪醇的质谱棒状图（上）、质谱库中标准 24-乙基-粪醇的质谱棒状图（下）3.2 老鼠粪便样品中粪固醇的含量老鼠粪便样品中粪固醇的含量 表 3 为重复测定 6 次老鼠粪便样品中各种粪固醇的含量。由上表 3 可知，由毛细管-6-http:/ GC/MS-SIM 测定老鼠粪便样品中各种粪固醇的含量，其精密度度较高。另外，老鼠粪便样品中主要含有 C27 固醇，少含有 C29 固醇，这正说明老鼠属于杂食动物。表 3 老鼠粪便样品中各种粪固醇的含量 序号 化合物名称 样品含量（10-6）变异系数（%），n=6 1 粪醇 19.44 0.83%2 差向异构-粪醇 13.24 0.29%3 胆固醇 20.44 0.53%4 24-乙基-粪醇 12.88 0.11%4.结论结论(1)用毛细管 GC/MS-SIM 检测老鼠粪便样品中的粪固醇，可以采用从总离子流质谱中直接抽取目标粪固醇的特征离子进行检测的方法，其步骤简单，鉴别准确可靠。(2)老鼠粪便样品中主要含有 C27 粪固醇，如粪醇、差向异构-粪醇、胆固醇，少含有C29 粪固醇，如 24-乙基-粪醇。-7-http:/ 参考文献参考文献 1 Murtaugh JJ,Bunch RL.Sterols as a measure of fecal pollutionJ.Water Pollut Control,1967,39:404-409.2 Hatcher PG,McGillivary PA.Sewage contamination in the New York Bight.Coprostanol as an indicator.Environ Sci Technol J,1979,13:1225-1229.3 Bjo rkhem I,Gustafsson JA.Mechanism of microbial transformation of cholesterol to coprostanol J.Eur J Biochem,1971,21:428-432.4 Eyssen HJ,Parmentier GG,Compernolle FC,de Pauw G,Piessens-Denef M.Biohydrogenation of sterols by Eubacterium ATCC 21,408nova species.Eur J Biochem,1973,36:411-421.5 Ren D,Li 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Faecal Sterols in Feces of Mice Xu Yang College of Life Science,Ji Lin University,Changchun,China(130012)Abstract In this paper,a method for determination of total faecal sterols in feces of mice by using gas chromatography combined mass spectrometry with single ion monitoring(GC/MS-SIM)is described.coprostanol,epicholstanol,cholesterol,cholestanol and-sitosterol in feces of mice were determined.It is shown that faecal sterols is to be used as the indicators of pollution of feces of mice.Keywords:mice,feces,faecal sterols,indicators.-8-