中草药提取物中缩合类单宁的选择性脱除.pdf

1 中草药提取物中缩合类单宁的选择性脱除中草药提取物中缩合类单宁的选择性脱除 廖学品 唐伟 邓慧 石碧(四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室，四川，成都，610065)摘摘 要要 以皮胶原纤维为原料，通过甲醛交联反应制备吸附材料。采用外加单宁的方法研究了这种吸附材料对中草药提取物中缩合类单宁的选择性吸附能力。结果表明，胶原纤维吸附材料对落叶松单宁、黑荆树单宁和杨梅单宁等 3 种典型的缩合类单宁都具有非常好的吸附选择性，在实验条件下单宁的去除率达到 100%，而对有效成份的吸附率较低。该吸附材料对与缩合类单宁具有相似结构的低聚原花青素的吸附率也较低。对比试验表明，胶原纤维吸附材料对单宁的吸附选择性优于聚酰胺。关键词关键词 皮胶原纤维；缩合类单宁；低聚原花青素；中草药；有效成分；吸附选择性 SELECTIVE REMOVAL OF CONDENSED TANNINS FROM EXTRACTS OF CHINESE MEDICINAL HERBS LIAO Xue-pin,Tang Wei,DENG Hui,SHI Bi (The Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering of Ministry of Education,Sichuan University,Chengdu 610065,P.R.China)Abstract A novel adsorbent was prepared on the basis of collagen fiber by cross-linking reaction of formaldehyde.By the approach of adding tannins into extracts of Chinese medicinal herbs,the adsorption selectivity of this adsorbent to condensed tannins was extensively investigated.It was indicated that the collagen fiber adsorbent has satisfied adsorption selectivity to typical condensed tannins(larch tannin,black wattle tannin and Bayberry tannin).The extent of adsorption of these condensed tannins was 100%,whilst the active components of Chinese medicinal herbs retained by the collagen fibers were limited.It was also observed that the adsorption extent of oligomer procyanidins on the collagen fibers was low,although they have similar basic molecular structure with condensed tannins.In comparison with polyamide adsorbent,the collagen fiber adsorbent was remarkably more effective in selectively removing condensed tannins.Key words collagen fiber,condensed tannins,oligomer procyanidins,Chinese medicinal herbs,active component extracts,adsorption selectivity 中药制剂中的单宁具有多种生理毒性1-6。作者曾报道了利用胶原纤维吸附材料除去中草药提取物和制剂中水解类单宁（单宁酸）的方法，发现其对单宁酸的吸附率达到 97%以上，而对有效成分基本上不吸附7。因此，可以考虑将胶原纤维吸附材料用于中药生产中的单宁去除。但是，植物中的单宁分为水解类单宁和缩合类单宁8，而且它们都广泛存在于药用植物中，有些药 基金项目：中国高校博士点基金资助项目(20020610010)通讯联系人，E-mail:，电话:[phone],传真:[phone] _http:/ 2 用植物中还同时含有这两类单宁，如大黄提取物9。水解类单宁和缩合类单宁在分子结构上存在明显的差异，这可能会导致其吸附特性的不一致。因此，本文进一步研究了胶原纤维吸附材料对中草药有效成分-缩合单宁体系中单宁的吸附选择性，并与常用的除单宁吸附剂聚酰胺进行比较。为了使研究结果具有系统性和说服力，分别采用落叶树单宁、黑荆树单宁和杨梅单宁等 3 种在结构上具有代表性的缩合类单宁进行了实验研究。同时，对低聚原花青素在胶原纤维上的吸附特性也进行了研究，以便观察这类具有生物活性的化合物是否会与缩合单宁一起被吸附脱除。1 实验部分实验部分 1.1 试剂试剂 黄岑甙(1)、柚皮甙（2）、染料木甙(3)、染料木素(4)、白黎芦醇(5)购自陕西慧科植物开发有限公司，含量98.0%。儿茶素(6)、表儿茶素(7)购自 Sigma 公司，为标准品。原花青素购自天津尖峰公司，为葡萄籽提取物，主要含儿茶素(6)、表儿茶素(7)、原花青定 B1(8)、原花青定B2(9)等儿茶素低聚体，以及一定量的儿茶素多聚体；低聚体含量85%。单宁酸(10)为分析纯，平均分子量 1700。黑荆树单宁（11）、杨梅单宁（12）、落叶松单宁(13)的制备：分别以 200g 落叶松树皮、黑荆树树皮和杨梅树皮为原料，用丙酮-水溶液（50:50，体积比）2000ml 浸提 3 次，合并提取物，蒸馏除去有机溶剂；水溶液用 500ml 石油醚萃取脱脂；用 600ml 乙酸乙酯萃取以除去低分子量成分；4下低温贮存 24h，弃去水不溶成分，然后在 60下真空干燥得到三种缩合类单宁。聚酰胺树脂：粒度 0.25-0.5mm，柱层析用，江苏临江试剂化工厂。胶原纤维吸附剂：实验室自制，制备方法参阅文献.7。1.2 实验方法实验方法 1.2.1 胶原纤维吸附剂对中草药有效成分胶原纤维吸附剂对中草药有效成分-缩合单宁混合溶液中单宁的选择性吸附缩合单宁混合溶液中单宁的选择性吸附 将黑荆树单宁（11）、杨梅单宁（12）和落叶松单宁（13）用 10%(v/v)的乙醇水溶液溶解，浓度均为 2000mg/L，各取 50ml 分别加入 3 个 100ml 的容量瓶中。将黄岑甙(1)、柚皮甙(2)、染料木甙(3)、染料木素(4)和白黎芦醇(5)用 50%(v/v)的乙醇水溶液溶解，各取一定量加入上述 3 个容量瓶中，混合后用蒸馏水定容至 100ml。试样中单宁的浓度均为 1000mg/L。将 0.5g 胶原纤维吸附剂放入上述溶液中，20下振荡吸附 24 小时。用高效液相色谱仪（Agilent1100）分析吸附前后各组分的浓度变化。1.2.2 胶原纤维吸附剂对中草药有效成分胶原纤维吸附剂对中草药有效成分-原花青素混合液中多聚原花青素的选择性吸附原花青素混合液中多聚原花青素的选择性吸附 原花青素用 10%(v/v)乙醇-水溶液溶解，浓度为 2000mg/L，取 50ml 加入 100ml 的容量瓶中。取一定量的上述黄岑甙(1)、柚皮甙(2)、染料木甙(3)、染料木素(4)和白黎芦醇(5)溶液与原花青素溶液混合，用蒸馏水定容至 100ml。试样中原花青素的浓度为 1000mg/L。吸附试验条件同上。1.2.3 聚酰胺对中草药有效成分聚酰胺对中草药有效成分-缩合单宁混合溶液中单宁的选择性吸附缩合单宁混合溶液中单宁的选择性吸附 实验方法同 1.2.1，吸附剂为聚酰胺。中国科技论文在线_http:/ 3 OOHHOOHOOCHOHOHOOOOOHHOOHOHHOH黄岑甙(1)Baicalin儿茶素 C(6)CatechinOCH3OHOHOHOOHOOOHOOH柚皮甙(2)NaringinOHOHOOCOOHOHOHOOOHOOOOHOH染料木甙(3)GenistinOHOH染料木素(4)GenisteinOHOHOHOH白黎芦醇(5)ResveratrolOHOHOHOOOHOHOOHOOOHOHHOOOOHOHOHOOOHHOOOOHOHOOOHOHOHOOn单宁酸(10)tannic acidOHOOHOHOHHOOHOOHOHHOOH原花青定 B1(8)procyanidin B1原花青定 B2(9)procyanidin B1OHOOHOHOHHOOHOOHOHOHHOOHOOHHOOHOHOHHH表儿茶素 EC(7)EpicatechinOOHOHHOOHOHOOHOHHOOHOHOOHOHHOOHOHn落叶松单宁(13)Larch tanninOOHOHHOOHOHOHOOHOHHOOHOOHOHHOOHOHOOHHOOHOHHOOH黑荆树皮单宁(11)black wattle tanninACBOOGOHOHOHHOOHOOGOHOHOHHOOHOOHOHOHOHHOOHCOHOHOH杨梅单宁(12)Bayberry tanninACBOG=H 图图 1 中草药有效成分及单宁的分子结构中草药有效成分及单宁的分子结构11-13 Fig 1.Molecular structures of Chinese medicinal herb extracts and tannins 2 结果和讨论结果和讨论 中国科技论文在线_http:/ 4 2.1 胶原纤维吸附剂对中草药有效成分落叶松单宁混合液中单宁的选择性吸附胶原纤维吸附剂对中草药有效成分落叶松单宁混合液中单宁的选择性吸附 实验发现，胶原纤维吸附剂对落叶松单宁的吸附率几乎达到 100%，如图 2 和表 1 所示。这表明，胶原纤维吸附剂能够有效地除去中草药提取物中的缩合类单宁。除黄岑甙外，胶原纤维吸附剂对多数中草药有效成分的吸附率较低。作者以前的研究显示7，胶原纤维对黄岑甙的吸附率很低（7.0%）；而当与落叶松单宁混合后，其吸附率达到 67.4%。这可能是因为落叶松单宁与黄岑甙存在某种结合，或者是被胶原纤维吸附后的落叶松单宁与黄岑甙具有较强的结合力。48121620242801020304050mAURetention time (min)larch tannin2 3514 24681012141618202224262801020304050mAURetention time (min)2 3514(a)吸附前吸附前(Before adsorption)(b)吸附后吸附后(After adsorption)图图 2 中草药有效成分中草药有效成分-落叶松单宁混合液吸附前后的落叶松单宁混合液吸附前后的 HPLC 图谱图谱 色谱柱：Hypersil ODS C18,4.0250,5m;洗脱液：A=H2O(0.5%H3PO4),B=CH3OH;流速：0.8ml/min;洗脱梯度：0-10min B 液由 18%增加至 24%,10-25min B 液由 24%增加至 70%,25-35 min 70%B 液,35-40min 100%B 液；检测：DAD，Sig=280nm；进样量:20L；柱温：30。Fig.2 HPLC patterns of the mixture of active components of Chinese medicinal herbs and larch tannin before and after adsorption 表表 1 中草药有效成分及落叶松单宁在胶原纤维吸附剂上的吸附率中草药有效成分及落叶松单宁在胶原纤维吸附剂上的吸附率a)Table 1 Adsorption extent of active components of Chinese medicinal herbs and larch tannin on collagen fiber adsorbent 吸附前 before adsorption 吸附后 after adsorption 组分 component 保留时间(min)Retention time 峰面积 peak area 保留时间(min)Retention time 峰面积 peak area 吸附率%extent of adsorption 落叶松单宁（13）larch tannin 柚皮甙(2)naringin 染料木甙(3)genistin 白黎芦醇(5)resveratrol 黄岑甙(1)baicalin 染料木素(4)genistein 13.5-29.00 20.946 21.909 22.276 24.077 26.090 5788.9 656.0 720.9 486.5 582.8 1251.8 20.936 21.896 22.264 24.074 26.087 612.2 582.0 395.5 189.9 834.0 100 6.7 19.3 18.7 67.4 33.4 a)吸附率=(吸附前峰面积吸附后峰面积)/吸附前峰面积100%2.2 胶原纤维吸附剂对中草药有效成分胶原纤维吸附剂对中草药有效成分-黑荆树单宁混合液中单宁的选择性吸附黑荆树单宁混合液中单宁的选择性吸附 中国科技论文在线_http:/ 5 胶原纤维吸附剂能够有效地除去黑荆树单宁，除去率也达到 100%,如图 3 和表 2 所示。值得注意的是，此时对黄岑甙的吸附率只有 21.2%，对其它中草药有效成分的吸附率则变化不大。这表明混合物中不同分子结构的缩合类单宁将影响某些有效成分的吸附。黑荆树单宁的 B 环为连苯三酚结构，而落叶松单宁的 B 环为连苯二酚结构，但这种结构差异是否是导致黄岑甙吸附率变化的原因有待进一步研究。48121620242801020304050mAURetention time (min)2 3514black wattle tannin48121620242801020304050mAURetention time (min)2 3514 (a)吸附前吸附前(Before adsorption)(b)吸附后吸附后(After adsorption)图图 3 中草药有效成分中草药有效成分-黑荆树单宁混合液吸附前后的黑荆树单宁混合液吸附前后的 HPLC 图谱（色谱条件同图图谱（色谱条件同图 2）Fig.3 HPLC patterns of the mixture of active components of Chinese medicinal herbs and black wattle tannin before and after adsorption 表表 2 中草药有效成分及黑荆树单宁在胶原纤维吸附剂上的吸附率中草药有效成分及黑荆树单宁在胶原纤维吸附剂上的吸附率a)Table 2 Adsorption Extent of active components of Chinese medicinal herbs and black wattle tannin on collagen fiber adsorbent 吸附前 before adsorption 吸附后 after adsorption 组分 component 保留时间(min)Retention time 峰面积 peak area 保留时间(min)Retention time 峰面积 peak area 吸附率%extent of adsorption 黑荆树单宁(11)black wattle tannin 柚皮甙(2)naringin 染料木甙(3)genistin 白黎芦醇(5)resveratrol 黄岑甙(1)baicalin 染料木素(4)genistein 13.5-20.7 20.928 21.888 22.259 24.067 26.074 3077.1 652.0 652.0 487.1 682.4 1216.5 20.943 21.902 22.270 24.076 26.084 616.8 560.1 393.0 537.6 828.5 100 5.4 14.9 19.3 21.2 31.9 a)吸附率=(吸附前峰面积吸附后峰面积)/吸附前峰面积100%2.3 胶原纤维吸附剂对中草药有效成分胶原纤维吸附剂对中草药有效成分-杨梅单宁混合液中单宁的选择性吸附杨梅单宁混合液中单宁的选择性吸附 由 2.1 及 2.2 可见，不同类型的缩合类单宁将影响某些有效成分在胶原纤维上的吸附。图 4为杨梅单宁与中草药有效成分混合物在胶原纤维上的吸附情况。此时，杨梅单宁的吸附率为100%，同时黄岑甙的吸附率只有 0.1%，而其它成分的吸附率变化不大。这进一步表明不同类型中国科技论文在线_http:/ 6 的单宁将影响有效成分的吸附。其原因可能是不同类型的单宁与有效成分之间的结合力不同，与单宁结合力强的成分其吸附率就高。48121620242801020304050mAURetention time (min)25143Bayberry tannin24681012141618202224262801020304050mAURetention time (min)2 3451 (a)吸附前吸附前(Before adsorption)(b)吸附后吸附后(After adsorption)图图 4 中草药有效成分中草药有效成分-杨梅单宁混合液吸附前后的杨梅单宁混合液吸附前后的 HPLC 图谱（色谱条件同图图谱（色谱条件同图 2）Fig.4 HPLC patterns of the mixture of active components of Chinese medicinal herbs and Myrica rubra tannin before and after adsorption 表表 3 中草药有效成分及杨梅单宁在胶原纤维吸附剂上的吸附率中草药有效成分及杨梅单宁在胶原纤维吸附剂上的吸附率a)Table 3 Adsorption Extent of active components of Chinese medicinal herbs and Bayberry tannin on collagen fiber adsorbent 吸附前 before adsorption 吸附后 after adsorption 组分 component 保留时间(min)Retention time 峰面积 peak area 保留时间(min)Retention time 峰面积 peak area 吸附率%extent of adsorption 杨梅单宁（12）Bayberry tannin 柚皮甙(2)naringin 染料木甙(3)genistin 白黎芦醇(5)resveratrol 黄岑甙(1)baicalin 染料木素(4)genistein 13.5-28.00 20.934 21.895 22.261 24.061 26.075 1877.5 655.2 745.5 513.7 636.8 1248.3 20.941 21.897 22.266 24.081 26.091 612.8 549.9 405.5 635.9 867.5 100 6.5 26.2 21.1 0.1 30.5 a)吸附率=(吸附前峰面积吸附后峰面积)/吸附前峰面积100%2.4 胶原纤维吸附剂对中草药有效成分胶原纤维吸附剂对中草药有效成分-原花青素混合液中多聚原花青素的选择性吸附原花青素混合液中多聚原花青素的选择性吸附 未经纯化的葡萄籽提取物中主要含儿茶素、表儿茶素、以及它们的低聚体和多聚体。通常把聚合度小于 6 的组分称为低聚原花青素，如儿茶素、表儿茶素、原花青定 B1 和 B2 等，而把聚合度大于 6 的组分称为多聚体。一般认为，药用植物提取物中存在的低聚原花青素是有效成分，它们具有抗氧化、捕捉自由基等多种生物活性14；而将分子量更大的多聚体称之为单宁(缩合类单宁)，为无效/有害成分，需要加以去除。图 5 为原花青素与中草药有效成分混合物吸附前后的HPLC 图谱，表 4 为各组分的吸附率。在图 5(a)中，保留时间为 16-20min 之间的峰主要是儿茶素中国科技论文在线_http:/ 7 的多聚体(所购原花青素的多聚体含量为 15%)，它们与胶原纤维具有较强的结合能力，因此基本上全部被吸附，如图 5(b)所示；而在图 5(a)中保留时间为 2-16min 之间的峰为儿茶素低聚体，它们在胶原纤维上的吸附量有限，如图 5(b)所示。这些研究结果表明，当中草药提取物中含原花青素类成分时，胶原纤维吸附剂可以除去其中的多聚体（单宁），但保留了多数低聚原花青素。此外，在这一体系中黄岑甙的吸附率为 55.4%，远高于在黑荆树单宁-有效成分及杨梅单宁-有效成分体系中的吸附率，而与在落叶松单宁-有效成分体系中的吸附率接近。原花青素与落叶松单宁具有相同的分子结构单元，这进一步证实单宁的分子结构将影响某些有效成分在胶原纤维上的吸附。24681012141618202224262801020304050mAURetention time (min)CECunkown 1unkown 22 3514 24681012141618202224262801020304050mAURetention time (min)unkown 1unkown 2CEC2 3514 (a)吸附前吸附前 (b)吸附后吸附后 图图 5 原花青素原花青素-中草药有效成分混合液吸附前后的中草药有效成分混合液吸附前后的 HPLC 图谱图谱(色谱条件同图色谱条件同图 2)Fig.5 HPLC patterns of the mixture of active components of Chinese medicinal herbs and procyanidins before and after adsorption 表表 4 中草药有效成分及低聚原花青素在胶原纤维吸附剂上的吸附率中草药有效成分及低聚原花青素在胶原纤维吸附剂上的吸附率a)Table 4 Adsorption Extent of active components of Chinese medicinal herbs and oligomer procyanidins on collagen fiber adsorbent 吸附前 before adsorption 吸附后 after adsorption 组分 component 保留时间(min)Retention time 峰面积peak area 保留时间(min)Retention time 峰面积 peak area 吸附率%extent of adsorption 未知 1 unkown 1 儿茶素(C)catechin 未知 2 unkown 2 表儿茶素(EC)epicatechin 柚皮甙(2)naringin 染料木甙(3)genistin 白黎芦醇(5)resveratrol 黄岑甙(1)baicalin 染料木素(4)genistein 6.677 9.174 11.085 15.017 20.946 21.909 22.273 24.075 26.087 416.8 1135.4 453.3 966.2 652.7 637.8 484.1 629.4 1287.2 6.647 9.131 11.043 14.978 20.942 21.899 22.266 24.072 26.085 311.5 1029.1 334.5 876.4 608.3 507.9 385.4 280.4 723.5 25.3 9.4 26.2 9.3 6.8 20.4 20.4 55.4 43.4 中国科技论文在线_http:/ 8 a)吸附率=(吸附前峰面积吸附后峰面积)/吸附前峰面积100%2.5 聚酰胺吸附剂对中草药有效成分混合物中落叶松单宁的吸附特性聚酰胺吸附剂对中草药有效成分混合物中落叶松单宁的吸附特性 目前，采用吸附法分离除去单宁时，大多选用聚酰胺吸附剂1。聚酰胺对中草药有效成分-落叶松单宁混合液中单宁的吸附情况如图 6 所示，对各种混合液体系中各组分的吸附率如表 5所示。可以发现，聚酰胺对单宁的吸附不完全，而且对多数有效成分的吸附率也较高，即吸附选择性不如胶原纤维好。如果要使单宁吸附完全，可以增加吸附剂用量，但必然也要使有效成分的损失增加。因此，从本研究工作的实验结果看，胶原纤维吸附剂更适合用于脱除中草药提取物或制剂中的单宁。48121620242801020304050mAURetention time (min)larch tannin1 2 34548121620242801020304050mAURetention time (min)12345larch tannin(a)吸附前吸附前 (b)吸附后吸附后 图图 6 聚酰胺对中草药有效成分聚酰胺对中草药有效成分-落叶松单宁混合液吸附前后的落叶松单宁混合液吸附前后的 HPLC 图谱（色谱条件同图图谱（色谱条件同图 2）Fig.6.HPLC patterns of the mixture of active components of Chinese medicinal herbs and larch tannin before and after adsorption by polyamide 表表 5 中草药有效成分及单宁在聚酰胺上的吸附率（中草药有效成分及单宁在聚酰胺上的吸附率（%）Table 5 Adsorption Extent of active components of Chinese medicinal herbs and tannins on polyamide（%）组分 component 体系 system 单宁 tannin 柚皮甙(2)naringin 染料木甙(3)genistin 白黎芦醇(5)resveratrol 黄岑甙(1)baicalin 染料木素(4)genistein 有效成分 Active components 落叶松单宁有效成分 Larch tannin-active components 黑荆树单宁-有效成分 Black wattle tannin-active component 杨梅单宁-有效成分 Bayberry tannin-active component/69.0 82.7 74.6 10.6 7.2 7.5 7.5 77.7 68.5 67.9 71.5 31.4 25.9 24.7 26.6 0.0 6.4 0.0 0.0 71.0 63.6 60.5 61.9 中国科技论文在线_http:/ 9 3 结论结论 基于皮胶原纤维的吸附剂对不同结构的缩合类单宁均具有非常好的吸附脱除能力，其对中药有效成分-单宁混合体系中单宁的选择性吸附能力较聚酰胺强。而且，胶原纤维吸附剂对与缩合类单宁具有相似基本结构的低聚原花青素的吸附能力较弱，这对保留这类具有生物和药理活性的有效成分非常有益。本实验条件下，胶原纤维吸附剂对单宁的除去率均达到 100%，表明其对单宁的吸附容量很高。从实际应用角度考虑，应该进一步研究中草药提取物中单宁的含量与吸附剂用量的关系，确定吸附剂的最适用量，从而既达到脱除单宁的目的，又尽可能少地损失有效成分。参考文献：参考文献：1 胡冠时.中草药除鞣质的方法研究.中草药,1991,22(11):491493 2 Xu M C,Wang C R,Xu,M C,Shi Z Q,Zhang S,Li,H T,Shi R F,Fan Y G,He B L.Adsorption of tannin from aqueous solution onto macroporous crosslinked 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