堆肥高温菌.doc

堆肥中高温降解菌的筛选及鉴定
摘要：从五指山土壤腐殖质样品中分离得到54株高温细菌，经水解实验以及酶活力测定，获得一株可同时降解纤维素、蛋白质、淀粉的高温细菌，命名为3-5，其纤维素酶活力、蛋白酶活力、α-淀粉酶活力分别为7.308U/ml、13.296U/ml、76.136U/ml。通过对菌株的形态特征观察、部分生理生化实验和16SrDNA基因鉴定，初步确定其土芽孢杆菌属的菌株（Geobacillus）。菌株最适生长温度为;最适生长pH为6.0；NaCl浓度为1%、装液量为10%时，菌株生长量最大。
关键词：高温菌；酶活力；鉴定；土芽孢杆菌属Geobacillus
Isolation and Identification of thermophilic bacteria with
strong degradation ability from compsting
Abstract: Fifty-Four thermophilic bacterium were isolated from agron in Wuzhishan mountain region of Hainan province, then a thermophilic bacterium strain 3-5were screened out for hydrolysis experiment and enzyme activity, which can degrade cellulose、protein and starch simultaneously. It’s cellulose activity、amylase activity and protease activity were 7.308U/ml、13.296U/ml、76.136U/ml respectively. The strain 3-5 is identified as Geobacillus primarily based on it’s morphological characteristers、some physiological characteristers and 16SrDNA gene sequence. It’s optimum temperature for growth was ; optimum pH for growth was 6.0;3-5 achieve it’s maximum growth when the concentration of sodium chloride is 1% and liquid medium volume is 10%.
KeyWords: thermophilic bacteria; enzyme activity; identification; Geobacillus
引言
堆肥高温期是有机大分子破坏、断裂和分解的主要阶段，也是保证堆肥无害化的重要阶段。但是由于温度的影响，堆肥高温期的微生物种群受到很大的限制，极大地限制了大分子难降解物质的快速降解。高温菌具有代谢快、活性高、代时短、酶的热稳定性高、营造高温条件杀死病原菌等特点，对于高温环境下有机物质的生物转化具有不可估量的作用[1]，与常温菌相比具有更高的微生物代谢活性和有机物降解速率，在固体废弃物利用领域具有广阔的应用前景[2]，通过接种高温降解菌可以增加堆肥高温期微生物的数量，加速难降解有机物质的快速转化，从而有效提高堆肥效率。已有研究表明堆肥中接种高温降解菌可促进有机物降解、提高堆肥高温期温度、延长高温期、加快堆肥腐熟[3-6]。
目前对于高温降解菌的研究大多仅关注一种大分子物质的降解，对于能同时降解多种有机物的高温菌研究较少。本研究从五指山土壤腐殖质样品中筛选具有同时降解纤维素、蛋白质、淀粉三种有机大分子能力的高温菌，旨在为堆肥提供优良菌株，有效的促进堆肥物料快速腐解、缩短堆肥周期，提高堆肥物料的腐熟程度和稳定化程度，得到高品质的堆肥产品。
2.材料与方法
2.1材料
供试样品包括：海南五指山石隙灌丛、路边腐木、树下山沟采集的土壤腐殖质样品共4个。 河北保定康帝生态肥业有限公司污泥＋秸秆＋鸡粪堆肥、海南裕沃生物科技有限公司出垛堆置10d的滤泥堆肥、诸诚金土地有机肥有限责任公司发酵3d的鸡粪堆肥、张家口市金农生物科技有限公司发酵16d的牛粪堆肥。
2.2培养基
2.2.1驯化培养基
牛肉膏10g，蛋白胨5g，NaCl 5g，H2O 1000ml，pH7.0，121℃灭菌20min
2.2.2选择培养基
纤维素刚果红培养基：羧甲基纤维素钠1.88g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，明胶2.0g，刚果红0.2g，植物凝胶10g，琼脂15g，H2O 1000mL pH 7.0～7.2g，121℃灭菌20min[7]。
蛋白选择培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，酪蛋白5g，CaCl2 0.1g，L—酪氨酸0.1g，植物凝胶15g，H2O 1000mL，pH 7.0-7.2，121℃灭菌冷却至60℃，加入 1% 115℃灭菌的吐温80[8]。
淀粉选择培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨 10g，酵母粉5g，氯化钠10g，pH 7.0，植物凝胶15g-20g，曲利苯蓝0.05-0.1g，H2O 1000mL ，121℃灭菌30 min。
2.2.3发酵培养基
纤维素发酵培养基：羧甲基纤维素钠5g，NaNO3 2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.6g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.1g，FeCl3 0.01g，明胶2g，酵母粉0.1g，H2O 1000mL，pH 6.8-7.2[9]。
蛋白发酵培养基：干酪素5%，Mandel A盐10%，Mandel B盐1%，pH6.0
Mandel A盐：KH2PO4 2g/L，（NH4）2SO4 1.4g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L
MandelB盐：FeSO4 5mg/L，MnSO4 1.6mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，CoCl 2mg/L
2.3高温降解菌筛选
2.3.1初筛
样品制成悬浮液经70℃高温富集后，将样品悬浮液制成不同稀释度的菌液并涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，倒置与70℃培养箱中培养24h。将形态特征不同的菌落挑出，在牛肉膏蛋白胨平板上经过若干次划线纯化，分离得到耐高温纯菌株。将分离得到的耐高温菌株分别接种至纤维素刚果红培养基、淀粉选择培养基、蛋白选择培养基中，观察菌落周围是否出现透明水解圈。若出现透明水解圈说明该种底物已经被水解，菌株具有降解该种底物的能力，按公式up=(D/d)2来进行计算，Up值的大小反映该菌水解能力的强弱．其中D为透明圈直径(mm)，d为菌落直径(mm)。
2.3.2复筛
将初筛得到的菌株接种至纤维素、淀粉、蛋白液体发酵培养基中，70℃静止培养72小时后，取发酵液5000rpm离心10min，得到粗酶液。分别用DNS法[10]、改良的Yoo法[11]和福林试剂法[12]测定菌株的纤维素酶活力、淀粉酶活力和蛋白酶活力。测定结果用SAS软件进行主成分分析，对菌株降解能力进行综合评价。
2.4菌种鉴定
2.4.1形态学特征和部分生理生化特性
菌株纯化后，通过菌落特征以及简单染色初步判定菌株的形态特征。生理生化特性参照文献13。
2.4.2菌株生长特性
将3-5菌液接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，改变某一条件，并保持其他条件不变，通过测定菌液的OD600值来研究温度、pH、盐度、装液量对菌株生长的影响。
2.4.3 16S r DNA鉴定
以菌液为模板，用一般细菌的通用引物27f、1492r进行PCR扩增。体系：ddH2O 37.5µL ；27f 0.5µL；1492r 0.5µL；10×Taq Buffer 5 μL；dNTP 1µL；模板5µL；Taq酶 0.5µL。程序：94℃预变性10min；94℃变性10s；退火温度采用梯度温度，退火40s，温度分别为52.1℃、53.5℃、54.7℃、55.6℃、56.9℃、58.1℃； 72℃延伸1.5min；共30个循环。上述30个循环结束后，72℃眼神10min。PCR产物送至生物技术公司进行序列测定。所得序列与GeneBank数据库中序列进行Blast分析比对，用MEGA4.0软件构建系统发育树。
3.结果与分析
3.1高温降解菌筛选结果
样品经70℃高温富集培养后，四4个样品中分离得到54株耐高温细菌。经选择性培养基筛选，其中9株细菌具有降解至少一种底物的能力，将9株菌进行摇瓶发酵培养，测定粗酶液纤维素、蛋白、淀粉酶活，酶活力测定结果见表1。
表1 酶活力测定结果
Table1 Results of enzyme activity
菌种
名称
纤维素酶活力
（U/ml）
蛋白酶活力
（U/ml）
淀粉酶活力
（U/ml）
综合指数
1-6
14.380
2.119
55.829
26.48355
1-10
12.300
—
—
1.688987
1-12
5.132
13.673
79.724
36.1859
2-5
—
—
19.330
8.901391
2-15
—
—
69.820
30.26442
3-5
7.308
13.296
76.136
39.84277
3-6
13.420
—
3.718
3.350122
4-3
4.510
6.329
—
4.090918
4-7
6.004
7.290
54.462
27.70958
从表1可以看出，综合考虑菌株的纤维素酶活力、蛋白酶活力和淀粉酶活力，分析计算得到3-5综合指数最高。菌株纤维素酶活力、蛋白酶活力、淀粉酶活力分别达到7.308U/ml、13.296U/ml、76.136U/ml，故选择该菌进行后续研究。
3.2菌种鉴定结果
3.2.1 菌株3-5形态学特征和部分生理生化特性

图1 菌株3-5的菌落形态及菌体形态
Fig.1 Colonial morphology and Morphology micrograph of 3-5
菌株3-5在琼脂平板上的菌落呈白色、圆形，菌落表面干燥、较厚、不透明、边缘圆整（图1）；培养24小时后显微镜下菌体形态为长杆状，有芽孢产生，孢子内生，椭圆，位于菌体一端（图2）；革兰氏染色呈阳性。
菌株部分生理生化特性见表2。
表2 菌株3-5部分生理生化特征
Table2 some physiological characteristers of 3-5
菌株编号
运动性
接触酶
V-P
MR
葡萄糖
α-乳糖
蔗糖
3-5
+
+
—
—
+
—
—
3.2.2 菌株3-5生长特性
3.2.2.1生长曲线
取菌株3-5的菌液接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，70℃静止培养，每隔4小时测定培养液OD600值。生长曲线如图2所示。菌株潜伏期较短，很快进入对数生长期，且对数期持续时间较长（≧24h），36h后菌株进入稳定期。
图2 菌株3-5生长曲线
Fig.2 growth curve of 3-5
3.2.2.2最适生长温度
图3
3.2.2.3最适生长pH值
将培养24h的种子液接种至pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的牛肉膏蛋白胨培养基中，36h后测定菌液OD600值，确定菌株最适生长pH。培养基pH为5.0—9.0时菌株生长良好，说明菌株对pH耐受范围较宽；pH小于4.0或者大于10.0时菌株几乎不生长，菌株最适宜pH为6.0（图4）。
图4 pH对菌株生长的影响
Fig.4 Effects of pH on the growth of 3-5
3.2.2.4 NaCl浓度对菌株生长的影响
将牛肉膏蛋白胨培养基中NaCl浓度设为0%、0.25%、0.5%、1%、2%、4%、8%，将培养24h的种子液接种至上述培养基中，培养36h后测定菌液OD600值。实验结果如图5所示，菌株在NaCl浓度为1%时生长最快，NaCl超过2%时菌株生长受到限制，浓度为4%时，菌株几乎不再生长，而高朝辉（2005）筛选的菌株CW2在10%NaCl的培养基中仍可生长[14]， 与CW2相比，3-5耐盐性较差。
图5 NaCl浓度对菌株生长的影响
Fig.5 Effects of concentration of sodium chloride on the growth of 3-5
3.2.2.4 装液量对菌株生长的影响
由于菌株在高温条件下静止培养，因此装液量会直接影响培养基中溶解氧含量的多少，从而影响细菌的生长。装液量在10%时，细菌的生长达到最大值，而装液量大于10%时，菌体生长量迅速下降（图6）。可能的原因为装液量10%时，静止状态下供氧的速率能保证培养基中充足的氧浓度，而装液量大于10%时，供氧速率下降，不能保证菌株生长所需的氧浓度，因此菌体生长量有所下降。
图6 装液量对菌株生长的影响
Fif.6 Effects of liquid medium volume on the growth of 3-5
3.2.3 3-5 16S r DNA鉴定结果
以3-5菌液为模板，利用细菌16S rDNA基因通用引物进行PCR扩增，成功扩增出长约1. 5 kb的DNA片段，测序结果与GeneBank中序列进行相似性分析，结果表明3-5与Geobacillus kaustophilus NCIMB 8547(T)的16S rDNA具有99.103的相似性。用MEGA5.0
构建系统发育树（图），图中可以看出3-5属于Geobacillus属中的一个种，与Geobacillus uzenensis UT、Geobacillus kaustophilus NCIMB 8547T（X60618）、Geobacillus thermocatenulatus DSM730T（Z26926）形成Geobacillus属的一个进化种群。分离菌株与Geobacillus kaustophilus NCIMB 8547(T)具有99.103%的相似性，但不在同一个分支上。

图7 3-5系统发育树
Fig.7 Phylogenetic Tree of 3-5
4.讨论
高温菌筛选过程中由于培养温度过高，培养基中水分蒸发较快，培养基容易变干。将培养物置于培养箱中一密闭的塑料桶内，并在培养箱中放一盛满水的容器，可有效缓解水分蒸发，防止培养基变干。
目前国内外关于高温降解菌的报道多为降解一种底物的菌株，本研究所筛选到的菌株3-5可同时降解三种底物的耐高温菌。该菌株纤维素酶活力、蛋白酶活力、淀粉酶活力分别达到7.308U/ml、8.786U/ml、76.136U/ml，由于酶活测定条件、酶活力单位的定义等存在较大差异，因此菌株之间酶活力的可比性不大。
经过形态学、生理生化以及16SrDNA分析，将3-5鉴定为Geobacillusi sp. 的菌株。Geobacillusi sp.是2001年新命名的一类细菌，是从Bacillus属中新分离出来的新属。Geobacillusi sp.为一组在表型上相近和系统发育上一致的嗜热菌群，它们的16SrDNA序列具有高达98.5%到99.2%的相似性，大多数能够在50℃以上生长[15]。Geobacillusi 的菌株可以产生耐高温的生物酶，Shang-Kai Tai等2004年已从制糖厂的废水中中筛选到可产生纤维素酶的高温菌株Geobacillusthermoleovorans T4，其纤维素酶活力在70℃达到最大值11.3mU/ml[16]；Dheeran等2009年从印度喜马拉雅地区的温泉中分离的菌株Geobacillus sp. IIPTN可产生耐高温的α-淀粉酶，其最适产酶温度为60℃，最大酶活力可达到135U/ml[17]；Rahman等从马拉西亚棕榈油厂的肺水肿筛选到可产生脂肪酶的菌株Geobacillus zalihaeT1T，其脂肪酶活力在70℃最大，为0.150U/ml[18]。
在60℃左右的中等高温度条件下，Geobacillus. 一般处于优势地位，本研究筛选到的3-5可在80℃下生存，并且可以降解三种底物，因此在促进堆肥腐熟、提高堆肥品质方面具有很大的应用前景。
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