核定位信号及其分析策略.pdf

1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/ISSN100727626CN1123870Q中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology2009年8月25(8):683689 综述核定位信号及其分析策略赵元茵1),王元忠1),曹 念2),周度金1),李渝萍1)3(1)第三军医大学生物化学与分子生物学教研室,重庆 400038;2)第三军医大学学员旅三队,重庆 400038)摘要 真核细胞核膜上的核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)是细胞核内外进行物质交换的主要通道,分子量较小的化合物可自由通过NPC或采取被动扩散的方式进入细胞核,而分子量为50kD以上的蛋白质则只能通过主动转运进入细胞核.以这种方式进入细胞核的蛋白质必须在其氨基酸序列上拥有特殊的核定位信号(nuclear localization signal,NLS),以被相应的核转运蛋白(karyopherins)识别.核定位信号具有多样性,包括经典核定位信号(classical NLS,cNLS),内输蛋白2识别的核定位信号(又称PY模体2NLS)和其它类型的NLS.每一类NLS具有相似的特征,但并不具有完全保守的氨基酸组成.不同的NLS,往往对应着各不相同的核输入机制.而对同一蛋白质来说,也可能同时拥有几个功能性的NLS.研究核定位信号一方面可以帮助揭示新的大分子物质核转运机制,另一方面也有助于发现一些蛋白质的新功能.本文对常见NLS的分类进行了总结,并介绍了两种常用的NLS预测软件及鉴定NLS的一般策略.关键词 核转运机制;核定位信号;内输蛋白中图分类号 Q291Categories and Research Strategies of Nuclear Localization SignalZHAO Yuan2Y in1),WANG Yuan2Zhong1),CAO Nian2),ZHOU Du2Jin1),LI Yu2Ping1)3(1)Department of Biochemistry and Molecular Biology,Third Military Medical University,Chongqing400038,China;2)Squadron3of Cadet Brigade,Third Military Medical University,Chongqing400038,China)AbstractThe nuclear pore complex(NPC)is in charge of the exchange of macromolecules between thenuclei and the cytoplasm of eucaryotic cells.The small compounds can get into the nuclei through the NPCfreely or by passive diffusion.However,those proteins whose molecular weights are larger than 50 kD can onlyget into nuclei by active transport.There must be one or more special signals in the amino acid sequences,so2called nuclear localization signals,which can be recognized by respective karyopherins,in those proteins.There are diverse sequences in NLSs,including classical NLS(cNLS),PY2NLS,which can be recognized byimportin2,and some other NLSs.Though there are similar properties among the same family members ofNLSs,there is no fully conserved amino acid sequence.Different NLSs often correspond to differentmechanisms of nuclear transport,and also,couple of functional NLSs may exist in one certain protein.Thestudies on NLS help us not only reveal new nuclear transport mechanism of macromolecules,but also discovernewfunctions of proteins.Categories of NLSs were summarized by the authors.Two common2used softwareemployed in NLS prediction and the strategies used to identify NLS are also introduced in this review.Key wordsnuclear transport mechanism;nuclear localization signal;importin收稿日期:2009202217;接受日期:2009204213国家自然科学基金(No.30671056)、重庆市自然科学基金(No.2008BB5019)及第三军医大学“回国人员启动基金”资助(No.2008002)3联系人 Tel:[phone];E2mail:yupingli1999 Received:February 17,2009;Accepted:April 13,2009Supported by National Natural Science Foundation of China(No.30671056),Natural Science Foundation of Chongqing(No.2008BB5019)and ScientificResearch Foundation for the Returned Overseas Scholars of Third Military Medical University(No.2008002)3Corresponding authorTel:023268752940;E2mail:yupingli1999 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/ 真核细胞的细胞核有核膜包被,核膜上的核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)是细胞核内外进行物质交换的主要通道,化合物自由通过NPC的能力取决于它们的大小1:分子量小于5 kD的小分子(通常是离子、核苷酸和其它小分子)可以自由通过NPC;分子量550 kD蛋白质,扩散方式因其大小而异,小的蛋白一般通过被动扩散进入细胞核,但也不排除主动转运的情况.分子量越大,被动扩散的能力越弱;分子量大于50 kD蛋白质只能通过主动转运进入细胞核.通过主动运输进入细胞核的蛋白质必须在其序列上拥有特殊的信号,即核定位信号(nuclear localization signal,NLS).NLS被相应的核转运蛋白(karyopherins)识别,后者与核孔蛋白相互作用,帮助含NLS的货物蛋白通过核孔到达细胞核,此后货物蛋白与核转运蛋白解聚,前者定位于核内,后者回到细胞质循环使用.目前研究发现,大多数通过主动转运进出细胞核的蛋白质,其转运过程依赖于单体G蛋白Ran2.核膜两侧Ran的存在形式决定了蛋白质转运的方向(详细机制见111)3,4.不同类型的NLS对应着不同的核转运机制,对NLS的研究能够帮助人们更好的认识核转运这一生物学过程,也为发现某些蛋白质的新功能提供线索.1 核定位信号的分类111 经典核定位信号(classical N LS,cN LS)及其转运机制cNLS是指其序列组成和转运机制研究得最为清楚,存在最为广泛的一类NLS.cNLS一般分为2种:单分型的NLS(monopartite NLS),最初发现于SV40病毒大T抗原中,是一段48个氨基酸组成的富含碱性氨基酸的短肽(126PKKKRK V132).其中部一般包含4个或4个以上精氨酸(R)和 或赖氨酸(K),两端是酸性氨基酸或脯氨酸或甘氨酸5.脯氨酸的存在可能是以其阻断碱性氨基酸残基上游的 2螺旋的形成.单分型NLS的核心序列可表示为K(KR)X(KR)6;双分型的NLS(bipartite NLS),这类核定位信号以核质蛋白的核定位序列(155KRPAATKK AG QAKKKK170)为典型,其特征是由两簇碱性氨基酸残基组成,两簇碱性序列之间被1012个非保守氨基酸残基间隔,其序列通式可以表示为RK(X)10212RRKK7.cNLS在核蛋白中的存在十分广泛,目前鉴定得到的NLS大多都属于此类.因此,对此种NLS所对应的转运机制也研究得最为清楚(Fig.1).参与cNLS核蛋白转运的核转运蛋白是内输蛋白和18.作为接头分子,内输蛋白一边通过识别cNLS与货物蛋白结合,一边通过其内输蛋白结合结构域(importin 2binding domain,IBB)与内输蛋白1结合,三者形成转运复合物.复合物中的内输蛋白 1通过与核孔蛋白相互作用,使复合物通过NPC进入细胞核,在核内复合物解聚,内输蛋白在众多蛋白(Nup2、Ces1)的辅助下,重新运送回胞质9.此转运机制依赖于GTP偶联蛋白Ran,在细胞质中,Ran以Ran2G DP的形式存在,起到稳定转运复合物的作用,在细胞核中,Ran以Ran2GTP的形式存在,Ran2GTP与内输蛋白竞争结合内输蛋白1,从而导致内输蛋白1从转运复合物上解聚.另外Ran2GTP还可以与内输蛋白的出核转运蛋白Ces1形成复合物,辅助内输蛋白的回输10,11.112 转运蛋白2识别的核定位信号(PY2N LS)及其序列特征研究发现有许多核蛋白并不是通过经典途径进入细胞核,它们往往不与内输蛋白结合而直接与核转运蛋白(kap)相互作用从而完成主动转运12.核转运蛋白家族包括众多成员,其中有10余种可以作为入核载体.找到能被该家族识别的共有NLS序列是发现新型核定位信号和新型核转运机制的重要途径.但是由于kap家族各成员识别的NLS互不相同,同源分析也很难发现它们的共同特征,所以这一领域的研究进展并不显著.近期,Lee等13以内输蛋白2(又称为转运蛋白,transportin)为研究对象,在这一领域率先取得了突破.转运蛋白的底物通常是一类与mRNA编辑有关的核蛋白,尤其是核内不均一核糖核蛋白家族(heterogeneousnuclear ribonucleoproteins,hnRNPs).其 家 族 成 员hnRNP A1含有一段长度为38个氨基酸残基名为M9的序列,该序列是最早确定的被转运蛋白识别的NLS14.Lee等通过研究M9与转运蛋白结合面的蛋白质空间结构及氨基酸残基理化性质,发现了转运蛋白2NLS的一些基本特征,随后将此方法推广到其他6个已知转运蛋白底物的研究中,并总结出了转运蛋白2NLS的一般特征:该NLS属于线性表位;通常是由30个以上氨基酸组成的肽段;富含碱性氨基酸残基;可以用序列通式表示其结构特征:转运蛋白2NLS主要分成3个部分,它们分别是:其羧基端的PY模体,距PY模体上游25个氨486中国生物化学与分子生物学报25卷 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/Fig.1The classical nuclear import cycle In thecytoplasm,cargocontainingacNLS isboundbytheheterodimeric import receptor,importin importin.Importinrecognizes the cNLS,and importinmediates interactionswith the nuclear pore during translocation.Once inside thenucleus,RanGTP binding causes a conformational change inimportin,which releases the IBB region of importin.Thisautoinhibitory domain,together with Nup2 and Cse1,facilitatescNLS dissociation and delivery of the cNLS cargo in thenucleus.Finally,importinis recycled back to the cytoplasmby the export receptor,Cse1,in complex with RanGTP.Thefigure are adapted fromLangeet al22基酸的碱性氨基酸,和位于其中部的保守肽段(Fig.2).PY模体是指转运蛋白2NLS羧基末端的两个保守氨基酸残基2脯氨酸和酪氨酸.突变试验发现,这2个氨基酸是转运蛋白2NLS发挥功能所必需的结构,因此转运蛋白2NLS被称为PY2NLS.与PY模体同样保守的是与其间隔25个氨基酸残基的1至2个碱性氨基酸(通常是精氨酸或赖氨酸),因此PY2NLS的羧基端序列通式用RKH2X(225)2P2Y表示.位于PY2NLS的中部的保守肽段,一般由46个氨基酸残基组成.这一区域的氨基酸组成形式分为两类,一类为2GAS2 2(为疏水性氨基酸),其特征是核心序列1、3、4位是疏水性氨基酸,2位为1个无侧链或短侧链氨基酸.这种结构模式可能与该NLS与转运蛋白结合面的疏水环境有关,因此也把这种NLS命名为疏水性PY2NLS即hPY2NLS,前面提到的M9 NLS就属于这一类.另一类PY2NLS的中心区域并不是由疏水性氨基酸组成,而是由一串碱性氨基酸组成,被称为碱性PY2NLS,即bPY2NLS,这一类NLS存在于以核内不均一核糖核蛋白hnRNPM和转录共调节因子多谷氨酰胺结合蛋白1(polyglutamine binding protein 1,PQBP21)为例的转运蛋白底物中.bPY2NLS中碱性氨基酸的作用还不十分清楚,但是两种不同的NLS提示转运蛋白可能有不同底物结合位点,这与以往的研究相符12.将总结出的PY2NLS通式用于预测已经取得了初步进展,有81个新的转运蛋白底物被发现,这些蛋白的功能并不仅仅局限于mRNA加工,而是涉及到细胞信号转导、细胞周期调控和细胞骨架等广泛领域.对其中5种蛋白的核转运机制进行深入研究发现,G蛋白Ran在转运蛋白与货物蛋白解聚中都发挥了重要作用.PY2NLS的发现为寻找除cNLS以外的其它核定位序列开辟了新的途径,随着新的模式NLS用于NLS的预测,将有助于发现更多的核蛋白和核转运机制.113 其它类型的N LS11311 空间表位型核定位信号 前面提到的cNLS和PY2NLS都属于线性的NLS,自然界还存在空间表位 的NLS.例 如STAT1(signal transducers andactivators of transcription 1),在它的一级结构中,并不存在被任何核转运蛋白识别的目标序列,但当其亚基聚合时,每个亚基的几个碱性氨基酸彼此靠近形成一个被内输蛋白识别的空间表位,发挥NLS的功能15.11312 假核定位信号 目前,用NLS预测软件得到的相当数量的NLS并不一定具有核定位的能力,这种具有某类NLS的序列特征,但并不发挥功能的NLS称为假NLS(pseudo NLS).11313 隐秘性核定位信号 另外还有很多预测出的NLS可能是隐秘性NLS(cryptic NLS)16.这类NLS由于整个蛋白构象的原因或其两侧氨基酸序列的影响不能与核孔复合物上的受体结合,因此,平时不一定发挥核定位的功能.但在某些刺激信号存在下,蛋白发生构象的变化,则变为显性NLS即功能性NLS.很多I型核受体就是由于与胞浆蛋白如HSP等结合遮蔽了NLS,但在配体的结合下,构象发生变化,胞浆蛋白解离下来暴露NLS,核受体在NLS的介导下进入细胞核从而发挥功能.11314 多核定位信号 更多的研究发现,在一个核蛋白中,往往存在不止一个有功能的核定位序586第8期赵元茵等:核定位信号及其分析策略 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/Fig.2Consensus sequence of NLSs recognized by K ap2Alignment of all known(top)and predicted(bottom)NLSs recognized by Kap2 at conserved PYresidues.NLSs inknown Kapb2 substrates are predicted by the presence of the RKH2X(225)2P2YC2terminalmotifs within structurally disordered and positively charged regions of 30 amino acids.Central hydrophobic motifsGAS(is a hydrophobic side chain)and central basicmotifs are shaded grey.The data are adapted fromLeeet al13列.这使得蛋白质的核转运机制变得更加复杂.对于多核定位信号存在的意义有两种解释:首先,多核定位信号有不同的分工.有些NLS在穿越核膜中发挥作用,而有的NLS则是在细胞核亚定位中发挥作用.Krauer等17在研究非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein2Barr virus)的核抗原EBNA26时,在其序列中发现了3个有功能的NLS.突变实验显示,NLS2(氨基酸412418)有明显的核仁定位功能,而将NLS5(氨基酸939945)与绿色荧光蛋白融合,蛋白主要在核质中分布.关于多核定位信号的另一种说法是,不同的NLS用于对不同的细胞信号做出应答.虽然具体机制仍不清楚,但确实在某些与应激有关的蛋白质中发现了多个NLS.Theodore等18在转录因子Nrf2中新近发现的2个NLS就与亲电子试剂和活性氧引起的Nrf2活化有关.2 鉴定功能性核定位信号的步骤211 蛋白质分子中核定位信号的确定鉴定NLS的第一步通常是确定目的蛋白能否定位到细胞核内,最常用的方法是将目的蛋白与示踪分子融合,以明确全长蛋白的定位情况.再根据预测的情况,将全长分子”切割”为若干截断突变体,通过观察这些截断突变体的定位情况明确NLS的具体位置.目前,在观察蛋白质定位时常使用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)或者加强型的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为示踪分子.但在核定位信号鉴定时需要注意:由于GFPEGFP的分子量(27 kD)较小,可以通过被动运输均匀分布于整个细胞,如果与小分子量的短肽融合,分子量依然较小(50 kD),理论上仍能自由通过NPC,这时可能出现以下情况:用GFP示踪一小分子蛋白或短肽,发现绿色荧光的分布呈现核内多,胞浆少的特点,但该蛋白或短肽可能并不含有NLS,只是由于融合蛋白通过被动运输自由进入细胞核,在核内与其它分子发生相互作用而被滞留核中.针对这一现象,许多研究者都选择融合谷胱甘肽硫基转移酶(glutathione S2transferase,GST)的EGFP作为示踪分子19,20.GST与EGFP融合蛋白的分子量53 kD大于NPC准入上限,而且在生理条件下,GST会发生二聚化,从而使得GST2GFP融合蛋白复合物(分子量106 kD)只限定在细胞质分布.一旦有功能性NLS插入该分子,绿色荧光会从细胞质全部转入细胞核,对比十分明显21.686中国生物化学与分子生物学报25卷 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/212 核定位信号转运功能的鉴定NLS是蛋白质通过主动运输进入核孔的充分必要条件22.证明NLS必要性的常用策略是突变试验,即通过观察NLS突变前后,蛋白的核定位情况是否出现差别,明确NLS的功能.突变实验分为缺失突变和定点突变,缺失突变是指删除全部NLS,而保留蛋白的所有剩余序列,而定点突变则主要集中在NLS的碱性氨基酸,通常是将碱性氨基酸突变成为无侧链的非极性中性氨基酸 丙氨酸.此外,保持NLS的氨基酸组成不变,仅改变氨基酸残基的排列顺序也是一种很好的突变策略.对于线性的NLS来说,将其连接到任何一个大分子蛋白质中都应该能够被相应的转运蛋白识别,因此在验证了NLS的必要性之后,还需要把这段序列移植到其它已知的胞浆蛋白中,如果该NLS的插入能够使胞浆蛋白定位到胞核,则说明此NLS是蛋白入核的充分条件.213 核定位信号与核转运蛋白的结合GST2捕获、免疫共沉淀之类的蛋白质体外相互作用的经典研究方法,都可用于寻找NLS的结合蛋白.但跟一般的蛋白质体外相互作用研究所不同的是,对于转运复合物的稳定性很可能依赖Ran存在形式的核蛋白,在进行该实验时可以考虑加入Ran2GTP的干扰实验22.214 影响核蛋白转运的因素分析体外核输入系统是研究核蛋白转运机制的有力工具23,24.该系统由几个部分组成:通透化细胞.无论悬浮细胞还是贴壁细胞都可进行通透化处理,最常用的是HeLa细胞.使用最广泛的通透剂是洋地黄苷(digitonin).洋地黄苷的作用靶点是胆固醇,由于细胞膜的胆固醇含量高于核膜,用适当剂量的洋地黄苷处理细胞后,会形成胞膜受损但核膜保持完整的半通透化细胞,细胞质经受损的胞膜流到胞外,故在这个系统中标记蛋白质能否进入细胞核完全依赖于细胞质成分的人为供给;人造细胞质.早年,非洲蟾蜍的子宫胞质溶胶由于制作成本低廉,组织相容性好受到许多实验室的亲睐,但目前商品化的网织红细胞裂解物使用更加广泛.此外,HeLa细胞胞质溶胶也是比较常见的一类人造细胞质.人造细胞质的新鲜程度是影响整个体外核输入系统工作效率的关键因素,自制非洲蟾蜍子宫胞质溶胶的全部过程要在115 d内完成,制好的胞质溶胶中还需加入DTT和Mg+以维持转运蛋白、以及Ran的活性.通过人为改变通透化细胞的人造胞浆成分就能够分析蛋白质核转运需要哪些辅助因素;系统转运底物.一个体外转运系统是否建立成功,还需要系统对照的检验,常用的系统转运底物有两类:一是用化学交联的方法合成的TRITC(四乙基罗丹明)2BSA(牛血清白蛋白)2NLS,二是前面提到的GST2GFP2NLS融合蛋白.由于经化学交联制备的转运底物纯化过程比较繁琐,交联剂的用量难于把握,而且过量的四乙基罗丹明有可能结合到构成核定位序列的关键氨基酸残基 赖氨酸上,导致核定位序列丧失功能,所以更倾向使用人工合成的融合蛋白作为系统转运底物.利用体外核转运系统,不仅能够直观模拟核蛋白的入核过程,还能定性分析温度、能量、离子和转运蛋白类型等因素对转运过程的影响.目前,体外核输入系统的组分大多商品化,这将极大地促进核蛋白和转运机制的研究.3 常用核定位信号预测软件NLS研究的第一步,是对蛋白质的序列进行分析,以发现潜在的NLS.NLS预测软件为这一工作提供极大便利,使用这些软件有必要对它们的预测原理和特点有一个初步了解,在此介绍2种常用的NLS分析预测软件.311PSORTPSORT 通常用于发现cNLS,其工作原理主要是用下表的4个序列作为模版,利用K2最近邻算法对分析序列进行评分.另外,蛋白质碱性氨基酸的含量也是PSORT 评价一个蛋白是否是核蛋白的重要因素,凡是碱性氨基酸含量超过20%的蛋白质,PSORT 都认为是核蛋白25.Table 1The prediction patterns employed by PSORTPatternConsensusNLS type4(KR)4SV402like(HP)(KR)3SV402like7P(KR)3SV402likeBipartite(KR)2X10(KR)325Bipartie 这样的工作原理,使PSORT 对核蛋白的“准入门槛”较低,用该软件进行序列分析往往可以得到多个潜在NLS,这将给日后的鉴定工作增加一定的工作量.而且PSORT 的比对版式仅限于cNLS,因此对于含有像PY2NLS这一类的核蛋白PSORT可能漏检.312PredictN LSPredictNLS由哥伦比亚大学生物信息学中心研786第8期赵元茵等:核定位信号及其分析策略 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/发,它的NLS库是经实验验证核定位序列的基础上,用电子突变(in silico mutagenesis)方法修饰得到的,主要包括3方面的工作26:1)将已经证实的NLS的部分碱基进行替换或者删除,再用实验证明加工后的序列是否仍有功能;2)剔出存在于非核蛋白中的假NLS;3)最终进入库中的NLS序列至少要在2个不同的核蛋白家族中出现过.从以上PredictNLS的建库原理可以看出,它对核蛋白的筛选条件较PSORT 严格得多,PredictNLS中NLS模板的最大特点是一定要经过实验验证,这样的准入条件使PredictNLS的预测准确性很高,但相应地,它造成的假阴性率也会比较高,尤其是对一些未曾发现过的新型NLS可能漏检.4 结束语大分子物质从胞浆到胞核的转运是真核生物一个重要的生物学事件.核内外物质交换的精确调控,对基因表达和信号转导有重要的影响.入核转运受体识别NLS是大分子物质向核内主动运输的第一步,因此,对NLS的研究无论是对于阐释物质转运机制还是发掘蛋白质功能都有重要的意义.目前,虽然在许多核定位蛋白质中都已发现NLS,但所发现的NLS类型仍然具有很大的局限性,特别是当前的NLS预测软件主要以cNLS为比对模板,致使NLS的发掘很大程度上在cNLS上停滞不前.有研究者对酵母中1515种通过GFP融合实验确定的核蛋白的NLS类型做了统计,具有cNLS的蛋白质只占57%27,也就是说,还有43%的非经典NLS和非经典物质转运机制等待着人们的发掘.另外,多核定位信号的存在也使物质转运的调控变得更加的复杂.还有一些分子量较小,理论上可以自由通过核孔复合物的蛋白也含有NLS.例如本实验室研究发现,分子量为35 kD的富含脯氨酸核受体辅调节蛋 白1(proline2richnuclearreceptorcoactivator,PNRC1)拥有一个功能性NLS 94PKKRRKKK101,且该NLS对PNRC1分子定位于胞核而不扩散到胞浆起关键作用28.对这些问题的解答将成为核定位信号研究关注的方向.参考文献(References)1 Dingwall C,Laskey R A.Protein import into the cell nucleusJ.Annu Rev Cell Biol,1986,2(11):3672390 2 Quimby B B,Dasso M.The small GTPase Ran:interpreting thesigns J.Curr Opin Cell Biol,2003,15(3):3382344 3 Kalab P,Weis K,Heald R.Visualization of a Ran2GTP gradient ininterphase and mitotic Xenopus egg extracts J.Science,2002,295(5564):245222456 4 Smith A E,Slepchenko B M,Schaff J C,et al.Systems analysis ofRan transport 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