中药对MCAO大鼠脑多唾液酸-神经细胞粘附分子表达的影响.pdf

http:/ 中药对 MCAO 大鼠脑多唾液酸-神经细胞粘附分子 表达的影响1周永红1，王新陆2，胡怀强21 青岛大学医学院中医教研室 （266021）2 山东中医药大学 （250014）摘 要：目的：摘 要：目的：研究中药复方对大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠脑内多唾液酸-神经细胞粘附分子的影响，探讨其促进神经发生的作用。方法：方法：30 只大鼠随机分为药物组、病理模型组、正常对照组3 组。用 Tamura 法造成 MCAO 大鼠模型，于造模成功后 6 天药物组灌胃给予中药复方复健片 10g/kg，余二组分别灌胃给予同等量生理盐水，日 1 次，共 2 周。用免疫组化法观察 MCAO 大鼠脑内多唾液酸-神经细胞粘附分子的表达。结果：结果：药物组大鼠脑内多唾液酸-神经细胞粘附分子表达明显增强。结论：结论：中药复方复健片可显著增强 MCAO 大鼠脑内多唾液酸-神经细胞粘附分子的表达，从而促进缺血性卒中神经发生。关键词：关键词：中药；缺血性卒中；多唾液酸-神经细胞粘附分子 复健片是我们临床治疗缺血性卒中的经验方，具有滋补肝肾作用，是纯中药制剂。临床研究表明，复健片可有效治疗缺血性卒中，改善患者的神经功能缺损评分、日常生活活动能力、智能状况和胰岛素抵抗状态，还可增加梗死周围组织及对侧的局部脑血流1。为探讨其作用机制是否与神经发生有关，我们进行了深入的实验研究。1 实验材料 1.1 实验动物：普通级健康 Wistar 大鼠 30 只，12 周龄，体重 30020g，雌雄不限（山东省实验动物中心提供）。单笼饲养一周，自由饮水和摄食。饲养室温度 24-25，相对温度 7%左右，光照明暗比为 13：11。1.2 实验仪器：显微手术钻，XSZ-2 型，上海光电公司；双极电凝器，SJ-2 型，上海光电公司；WT11001R 型电子天平，江苏省常州市万得天平仪器厂；电热恒温水槽，DK-600型，上海精宏实验设备有限公司；手术显微镜，光学显微镜均为上海医用光学仪器厂产品；大鼠固定器。1.3 实验药品及试剂：多唾液酸-神经细胞粘附分子（polysialic acid neural cell adhesion molecule，PSA-NCAM）免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；戊巴比妥钠购自上海化学试剂采购供应站分装厂；注射用青霉素钠购自山东鲁抗医药股份有限公司；氯代三苯基四氮唑（红四氮唑，TTC）购自上海试剂三厂。1 基金项目：国家自然科学基金（No.30171165）1http:/ 2 实验方法 2.1 动物分组：实验动物随机分为药物组、病理模型组、正常对照组 3 组，每组 10 只。模型组和药物组按下述方法制作大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，假手术组大鼠行同样开颅术，但不凝闭大脑中动脉，其余操作同模型组。2.2 大鼠MCAO模型的制备：按Tamura2的方法稍加改进行右侧近端大脑中动脉电凝术。麻醉醒后 24h内出现（1）左侧肢体痛刺激收缩现象消失；（2）向左侧倾倒或转圈；（2）提尾时左上肢不能向前伸直。具备以上 3 项为MCAO模型复制成功，纳入试验，进行分组，余者弃之。2.3 给药方法：药物组灌胃给予复健片（由山东鲁信药业有限公司生产，主要药物为何首乌、草决明、桑寄生、海马、淫羊藿等）水溶液10g/kg，余二组分别灌胃给予同等量生理盐水，日1次，共2周。于造模成功后6d给药，固体饲料和水自由摄取。2.4 切片制作：实验动物结束喂药、末次观察神经系统症状后，迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管后，先用100ml生理盐水快速冲洗，随后用4%多聚甲醛磷酸缓冲剂心脏灌注约30min，灌毕立即取脑浸入上述固定液1d，常规脱水、浸蜡、包埋。予正中隆起水平在切片机上行4m连续冠状切片备用。2.5 PSA-NCAM表达：采用免疫组织化学法（ABC法）进行观察。（1）免疫组织化学染色：石蜡切片常规脱蜡复水；30%H2O21份+蒸馏水10份混合，室温510分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗10min3次；滴加复合消化液10min，蒸馏水洗3次；滴加正常山羊血清封闭液20min，不洗，甩去多余液体；滴加兔抗鼠PSA-NCAM一抗（l:2000，Sigma），室温下（25）孵育2小时，再4过夜，PBS洗2min3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温下20 min，PBS洗2min3次；滴加试剂SABC复合物，室温20 min，PBS洗5min4次；DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般10分钟左右。蒸馏水多次洗涤；苏木素轻度复染。脱水，透明，中性树胶封片。显微镜观察。（2）免疫组织化学染色对照：用正常山羊血清和PBS代替PSA-NCAM一抗作孵育，其余步骤同上，用以检查Nestin免疫反应的特异性。2.6 图像分析方法 全部测量均在相同光学条件下完成。采用Leica QwinV3图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析，测定染色平均灰度。2.7 统计学方法 将所有数据输入 IBM PC 机，应用 SPSS10.0 软件包进行统计分析。2http:/ 组间计量资料比较采用方差分析，相关分析采用等级相关检验。3 实验结果 复健片对 MCAO 大鼠 PSA-NCAM 表达的影响见表 1 及图 1-5。表 1 复健片对PSA-NCAM表达的影响（XS）组别 样本量 时间 染色平均灰度 假手术组 5 100.1020.28 5 给药 1w 后 119.608.65模型组 5 给药 2w 后 112.6510.125 给药 1w 后 140.2018.68药物组 5 给药 2w 后 131.412.98注：与假手术组比较，、P 均0.01，P0.05，P0.05；与组内前期比较，、P 均0.05；组间比较，P0.05，P0.05。结果显示，模型组的 PSA-NCAM 染色平均灰度在给药 1 周后较假手术组无显著差异，2 周后则产生了显著差异；药物组的 PSA-NCAM 染色平均灰度在给药 1 周后即较假手术组产生了显著差异；组间比较，治疗 1 周后药物组和模型组 PSA-NCAM 染色平均灰度上无显著差异，2 周后则产生了显著差异。4 讨论 中枢神经系统损伤后的神经发生与后期康复效果密切相关3，而神经发生与神经元的增殖、迁移、分化等多方面因素有关。PSA-NCAM带有大量的唾液酸，是一种特殊的神经细胞粘附分子，参与神经细胞粘附和轴突生长、并促进突触可塑性，对神经元前体细胞的迁移有重要作用4-5。复健片由何首乌、桑寄生、草决明、海马、淫羊藿组成，是用于缺血性卒中治疗的经验方。方中重施何首乌为君。本品味苦、甘，性微温，归肝肾经，善补肝肾、益精血，“治中风左半偏枯之病甚佳”（玉楸药解），故何首乌为治疗中风病传统要药。因此重用之以滋补肝肾、填益真阴。该方复配桑寄生、草决明为臣。二味同有滋补肝肾之功，共扶首乌固本培源。海马、淫羊藿均能温补肾元，方中稍佐此二味，意在激发肾气，和调阴阳，兼有通行气血之用。以上数味，相辅成功，补肝肾、调气血、和阴阳。本研究通过检测 PSA-NCAM 的表达，探索复健片对神经元迁移的影响。缺血性卒中后 PSA-NCAM 表达反应性增强，但其时间较迟，经复健片治疗后则 PSA-NCAM 表达增强时间提前，表明复健片对缺血性卒中神经发生过程中的神经元迁移有促进作用，3http:/ 从而促进神经干细胞向目标迁移，在一定程度上干预了神经发生过程。参考文献 1 周永红.复健胶囊治疗缺血性卒中后遗症30例临床研究.中医杂志，2002，43（5）：355-356.2 Tamura A,Graham DI,Mc Culloch J,et al.Focal cerebral ischemia in the rat:Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.J Cerb Blood Flow Metab,1981,1:15.3 Liu Y,Dong WW,Yu RH.The neuroprotective effects of cerebellum electric stimulation on motor outcome and MEP in patients of acute cerebral stroke.Zhongguo Linchuang Kangfu(Chin J Clin Rehabil),2002;6(11):1565-1566.4 De-Stefano ME,Leone L,Paggi P.Polysialylated neural cell adhesion molecule is involved in the neuroplasticity induced by axonal injury in the avian ciliary ganglion J.Neurosci,2001,103:10931104.5 Doetsch F,A Ivarez-Buylia A.Network of tangental pathways for neuronal migration in adult mammalian brain J.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:14895.Effect of Chinese herb on the expression of PSA-NCAM in the brain of MCAO rat Zhou Yonghong1，Wang Xinlu2，Hu Huaiqiang21 Qingdao University Midical College（266021）2 Shandong University of traditional Chinese medicine（250014）Abstract Objectives:To study the effect of complex of Chinese herb on the expression of polysialic acid neural cell adhesion molecule in the brain of MCAO rats and explore the action mechanism of its promoting neurogenesis.Methods:30 rats were randomly divided into drug group,model group and normal control.The models of MCAO rats were successfully established by the method of Tamura.After six days,the rats of drug group had been taken orally Fujian Tablets by 10g/kg crude drug one time daily for two weeks,and the rest groups had been taken orally equivalence saline once a day for two weeks.The expression of polysialic acid neural cell adhesion molecule in the brain of MCAO rats was observed in immunohistochemical method.Results:The expression of nestin in the brain of MCAO rats in drug group was obviously increased.Conclusions:Fujian Tablets can predominantly enhance the expression of polysialic acid neural cell adhesion molecule in the brain of MCAO rats.Therefore,it can promote the neurogenesis of AICD.Keywords：Chinese herb;CIS;PSA-NCAM 4http:/ 附图 图 1 假手术组大鼠脑组织 PSA-NCAM 的表达 图 2 药物组大鼠给药 1 周后 PSA-NCAM 的表达 图 3 药物组大鼠给药 2 周后 PSA-NCAM 的表达 图 4 模型组大鼠给药 1 周后 PSA-NCAM 的表达 图 5 模型组大鼠给药 2 周后 PSA-NCAM 的表达 5