DB14∕T 1946-2019 实验动物 中国地鼠生物学数据测定.pdf

ICS 65.020.30 B 44 DB14 山西省地方标准 DB 14/T 19462019 实验动物 中国地鼠生物学数据测定 Laboratory animal Determination of biological data in Chinese hamster 2019 - 12 - 01 发布 2020 - 02 - 01 实施 山西省市场监督管理局 发 布 DB14/T 19462019 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 缩略语 . 1 5 遗传数据 . 2 6 生理数据 . 2 7 生化数据 . 3 8 解剖数据 . 3 附录 A（规范性附录） 染色体数测定方法 . 5 附录 B（规范性附录） 精子采集 . 8 附录 C（规范性附录） lgG 测定方法 . 9 附录 D（规范性附录） 血液样品采集要求 . 11 DB14/T 19462019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准由山西省科学技术厅提出、归口并监督实施。 本标准起草单位：山西医科大学。 本标准主要起草人：宋国华、陈朝阳、庞文彪、刘茂林、樊林花、高继萍、王晓堂。 DB14/T 19462019 1 实验动物 中国地鼠生物学数据测定 1 范围 本标准规定了实验动物 中国地鼠（以下简称实验中国地鼠）的遗传数据、生理数据、生化数据、解剖数据等 4 类生物学特性数据的测定方法。 本标准适用于中国地鼠生物学特性数据质量的控制。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14927.1-2008 实验动物 近交系小鼠、大鼠生化标记检测法 DB14/T 1942-2019 实验动物 中国地鼠微卫星DNA检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实验中国地鼠 laboratory Chinese hamster 经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定以及其它科学实验的中国地鼠（Cricetulus griseus） 。 3.2 数据采集 data collection 数据采集系统是结合基于计算机或者其他专用测试平台的测量软硬件产品来实现灵活的、 用户自定义的测量系统。为了反映实验动物品种品系的生物学特征，需进行各种数据的采集及标准化的工作。 3.3 数据测定 data determination 是指借助于一定的测量工具或一定的测量标准而获得的数据。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DB14/T 19462019 2 ALB：白蛋白 ALT：丙氨酸氨基转移酶 BUN：尿素 CRE：肌酐 GLU：血糖 GRAN：中性粒细胞 HCT：红细胞压积 HGB：血红蛋白 LYM：淋巴细胞 MCH：平均红细胞血红蛋白量 MCHC：平均红细胞血红蛋白浓度 MON：单核细胞 MPV：平均血小板体积 PCT：血小板压积 PLT：血小板 RBC：红细胞计数 CHOL：总胆固醇 TG：甘油三脂 TP：总蛋白 WBC：白细胞计数 5 遗传数据 5.1 生化标记检测 生化标记检测应符合 GB/T 14927.1-2008 第 5 章生化标记检测方法总则。 5.2 染色体数测定 染色体数测定按照本标准附录 A 执行。 5.3 微卫星 DNA 标记检测 微卫星 DNA 标记检测按照 DB14/T 1942-2019 规定检测。 6 生理数据 6.1 血液学 6.1.1 采样要求 麻醉状态下，腹主动脉采血适量，用 0.9% EDTA 抗凝，室温条件下不超过 4 h 测定。 DB14/T 19462019 3 6.1.2 检测指标 RBC、HCT、PLT、MPV、WBC、HGB、LYM、MON、GRAN、PCT、MCH、MCHC。其余指标可根据实验需要测定。 6.2 精液 6.2.1 精液采集 精液采集详见本标准附录 B。 6.2.2 精子活力 用玻璃棒蘸取新鲜精液用 0.9% 氯化钠稀释精液，滴在玻片上，加上盖玻片，中间不要有气泡；在显微镜下用暗视野进行观察，统计精子 3 种活动（直线前进运动、旋转运动和振摆运动）情况；计算直线前进运动精子数与精子总数的比值。 6.2.3 精子计数 用 0.5% 碳酸氢钠等倍数稀释精液，4%甲醛固定，混匀后滴入计数池，显微镜下计数。 6.3 IgG 测定 lgG 测定按照本标准附录 C 规定执行。 7 生化数据 7.1 血液生化指标 7.1.1 采样要求 中国地鼠禁食 8 h12 h，不禁水，采血按照本标准附录 D 规定执行。 7.1.2 检测指标 ALB、ALT、BUN、CRE、GLU、TG、TP 其余指标可根据实验需要测定。 7.2 尿液 宜用膀胱穿刺法或膀胱压迫法收集新鲜尿液，测定尿酸、尿比重、尿糖和尿蛋白。 8 解剖数据 8.1 动物准备 动物解剖前应禁食 8 h12 h，不禁水，应在采血后采集内脏器官。 8.2 脏器采集 采集颊囊、心、肺、脾、肝、胃、胰腺、肠、肾、肾上腺、睾丸/卵巢、子宫、脑等，可根据实验DB14/T 19462019 4 需求采集其它脏器。 8.3 脏器测量 8.3.1 称重 称重前应将脏器周围脂肪、结缔组织剔除，用滤纸吸去脏器表面的体液，迅速称重。根据脏器大小选用适宜精度的天平进行称重。 8.3.2 肠道长度测量 应从胃幽门处至肛门处剖取所有肠段。分别测量小肠、结肠、盲肠、直肠的长度，计量单位采用mm。 DB14/T 19462019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 染色体数测定方法 A.1 器具 注射器、4 号针头、解剖盘、解剖剪、镊子、玻璃吸管、10 mL 刻度离心管、离心机、载玻片、盖玻片、显微镜、滤纸、擦镜纸、白纱布小块、量筒、玻璃板。 A.2 药品 0.02秋水仙素、Giemsa 染液。 A.3 试剂 A.3.1 0.075 mol/L氯化钾溶液 准确称取 0.559 g 氯化钾，溶于 80 mL 蒸馏水中，定容至 100 mL。 A.3.2 固定液 准确量取 3 份甲醇，1 份冰醋酸，混合均匀配制而成。 A.3.3 2柠檬酸钠溶液 准确称取 2 g 柠檬酸钠，溶于 80 mL 蒸馏水中，定容至 100 mL。 A.3.4 0.85氯化钠溶液 准确称取 0.85 g 氯化钠溶于 80 mL 蒸馏水中,定容至 100 mL。 A.3.5 磷酸缓冲液（pH 6.8） 取甲液 49.5 mL，乙液 50.5 mL，混匀即可。 甲液：1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液，称取磷酸氢二钠 9.48 g，溶于 900 mL 蒸馏水中，定容至 1000 mL。乙液：1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液，称取磷酸二氢钾 9.07 g，溶于 900 mL 蒸馏水中，定容至1000 mL。若磷酸氢二钠或磷酸二氢钾含有结晶水，则应根据结晶水的含量重新计算称取量。 A.3.6 Giemsa原液 称取 Giemsa 粉剂 0.50 g，量取丙三醇 33 mL，量取甲醇 33 mL。将 Giemsa 粉溶于少量丙三醇，在研钵内研磨（30 min）无颗粒为止，再将全部剩余丙三醇倒入。于 56温箱内 2 h 后，再加入甲醇，将配好 Giemsa 原液置于棕色瓶中。 DB14/T 19462019 6 A.4 操作 A.4.1 预处理 实验前 3 h4 h，取健康中国地鼠一只按每克体重 4 g 秋水仙素，浓度为 0.16 mg/mL 生理盐水的量将秋水仙素溶液注入腹腔（切勿损伤内脏） 。 A.4.2 取股骨 用眼球后血管丛放血处死中国地鼠。处死后立即用剪刀剪开后腿上的皮毛，取出中国地鼠的股骨，剔掉股骨上的肌肉，并将一小块白纱布包在股骨上用手反复搓动，以除净股骨上肌肉碎渣和结缔组织。 A.4.3 取骨髓细胞 将生理盐水 4 mL，一次性卡介苗注射器通过 4 号针头注入骨髓腔，使骨髓细胞冲洗入 10 mL 锥形离心管内，吸出杂质，管壁冲净。1000 r/min 离心 5 min。小心吸去大部分上清液，留 0.5 mL 与沉淀物混匀。 A.4.4 低渗 在离心管中加入 0.075 mol/L 氯化钾溶液 6 mL， 用吸管将骨髓细胞吹打成细胞悬液， 37恒温水浴锅低渗 23 min（10min 时吹打 4、5 下） ，立即加固定液，严格控制低渗时间。1000 r/min 离心 10 min 后弃去上清液。在离心前加入 1 mL 固定液并用吸管吹匀进行预固定。 A.4.5 预固定 加入 1 mL 新配制的固定液，吹气泡 45 下混匀，5 min 后在吹气泡 15 次，立即以 1000 r/min 离心 10 min，用吸管吸去全部上清液，轻弹离心管底部，使沉淀呈糊状。 A.4.6 第一次固定 吸出上清液，先加固定液 1 mL 将沉淀物打碎，再加至 4 mL，打 15 次，盖上胶塞，放入 37水浴20 min (10 min 时吹打 100 次，管壁冲净)。离心，吸出上清液, 加 2 mL 固定液，吹打，带盖室温固定20 min。 第二次固定、第三次固定方法同第一次固定一样。 A.4.7 滴片 用镊子从冰水中取出预冷的载玻片，甩掉载玻片的冰水后迅速用吸管吸取细胞悬液滴在载玻片上23 滴（滴片的高度 30 cm35 cm，滴面不要重复） ，立即用嘴向同一方向吹，使细胞染色体散开，然后置于酒精灯上微微加热干燥或放在玻片架上室温下晾干。 A.4.8 烤片 将滴片置于 70烤箱烘烤 30 min。 DB14/T 19462019 7 A.4.9 染色 将烤干的玻片放在玻片板上，将 Giemsa 染液滴加在玻片上染色 15 min，用蒸馏水或自来水冲去玻片上的染液。滤纸吸干或晾干后待镜检。 A.4.10 镜检 将制备好的玻片置于显微镜下， 首先在低倍视野下寻找细胞和中期分裂相， 然后用中倍镜和油镜观察染色体的形态，统计染色体的数目。 A.5 结果判定 染色体数目为2n=22。 DB14/T 19462019 8 B B 附 录 B （规范性附录） 精子采集 B.1 分离组织 通过外科手术从睾丸中分离出附睾尾和输精管。 B.2 游离精子 用缓冲液冲洗离体附睾并小心去除血液和脂肪组织，随后将附睾尾置于含 1 mL 缓冲液（37）的平皿中，用精细手术剪剪碎附睾尾，继续于 37 孵育 10 min 让精子游离出来。 B.3 取精培育 取 30预热的生理盐水按照 1:5 稀释，装入 1.5 mL 离心管中，1 mL/管，加封口膜后插放在 30恒温金属浴器中。另取 10 L 加入到 190 L 预热好的培养液中，吹打后置入培养箱 2 min，待计数用。 B.4 计数 用细胞计数仪计算精子数量。 DB14/T 19462019 9 C C 附 录 C （规范性附录） lgG 测定方法 C.1 材料 鼠抗中国地鼠 lgG 的单克隆抗体；2% BSA 封闭液；纯化的中国地鼠 lgG；兔抗中国地鼠 lgG 的多克隆抗体；酶标羊抗兔抗体(HRP 标记)；TMB 溶液。 C.2 主要仪器 酶标仪、恒温水浴锅。 C.3 方法 C.3.1 标准曲线制作 C.3.1.1 包被 用含 1:400 鼠抗中国地鼠 lgG 单克隆抗体包被酶标板，100 L/孔，37温育 2 h，4过夜，PBST 300L/孔，重复洗涤 3 次，拍干。 C.3.1.2 封闭 2% BSA 封闭，200 L/孔，37温育 2 h；PBST 300 L/孔，重复洗涤 3 次，拍干。 C.3.1.3 加标准品 加不同稀释浓度（0.25 g/mL、0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL、3.0 g/mL）的标准品中国地鼠lgG，同时设阴性对照和空白对照孔，37温育 1 h，PBST 300L/孔，重复洗涤 3 次，拍干。 C.3.1.4 加抗体 加 1:2000 兔抗中国地鼠 lgG 多克隆抗体，100 L/孔，37温育 1h，PBST 300L/孔，洗涤 3 次，拍干。 C.3.1.5 加酶标抗体 加 1 : 8000 HRP 标记抗体，100 L/孔，37温育 l h。PBST 300 L/孔，洗涤 3 次，拍干。 C.3.1.6 显色、终止及读数 加入 TMB 底物溶液，100 L/孔，37避光温育 15min。加入 2M H2SO4终止反应，100 L/孔，用酶标仪测定 OD450 值。 DB14/T 19462019 10 C.3.1.7 回归方程 以不同稀释浓度的标准品中国地鼠lgG含量为横坐标， 以相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线， 计算回归方程。 C.3.2 中国地鼠血浆中lgG含量检测 C.3.2.1 包被 用含 1:400 鼠抗中国地鼠 lgG 单克隆抗体包被酶标板，100 L/孔，37温育 2 h，4过夜，PBST 300L/孔，重复洗涤 3 次，拍干。 C.3.2.2 封闭 2% BSA 封闭，200 L/孔，37温育 2 h；PBST 300 L/孔，重复洗涤 3 次，拍干。 C.3.2.3 加样 加 1:5000 待检中国地鼠血清/血浆，100 L/孔，同时设阴性对照和空白对照，37温育 1 h，PBST 300L/孔，重复洗涤 3 次，拍干。 C.3.2.4 加抗体 加 1:2000 兔抗中国地鼠 lgG 多克隆抗体，100 L/孔，37温育 1h。PBST 300L/孔，洗涤 3 次，拍干。 C.3.2.5 加酶标抗体 加 1 : 8000 HRP 标记抗体，100 L/孔，37温育 l h。PBST 300 L/孔，洗涤 3 次，拍干。 C.3.2.6 显色、终止及读数 加入 TMB 底物溶液，100 L/孔，37避光温育 15min。加入 2M H2SO4终止反应，100 L/孔，用酶标仪测定 OD450 值。 C.3.3 结果判定 根据标准曲线确定待测中国地鼠血清中 lgG 的含量。 DB14/T 19462019 11 D D 附 录 D （规范性附录） 血液样品采集要求 D.1 采血前准备 采血前一般要求禁食 8 h12 h，不禁水。 D.2 采血途径 麻醉状态下，选择腹主动脉采血。 D.3 采血方法 麻醉动物，将动物固定鼠架，从腹正中线皮肤切开腹腔，暴露腹主动脉，用注射器吸取出血液，防止溶血。 D.4 指标测定 血液生理测定需采血后 4h 内测完全部数据；血液生化测定需采血后应尽快分离血清（浆） 。采血后在室温下静置 0.5h，然后 3000 r/min 离心 5min 得到血清（浆） 。血清（浆）样本放 4保存，凝血指标最好 2h 内测完。否则，应放-20-70保存，一个月内测完。 D.5 注意事项 为了保证酶活性，减少其他指标的降解，应避免反复冻融。 _