荧光定量PCR法与常规细菌...肠道致病菌检测中的应用效果_杨园园.pdf

|167健康科学医学实践荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法在荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法在肠道致病菌检测中的应用效果肠道致病菌检测中的应用效果杨园园运城护理职业学院，山西运城044000摘要：目的 探究在肠道致病菌检测中，应用荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法的临床效果，并对之展开分析和探讨。方法 本次研究将时间定为2019年1月1日-2021年12月31日，纳入研究的参与对象为：上述时间段内，某医院收集的腹泻患者1286例资料。所有参与患者都进行了粪便采集和检测，检测方法为荧光定量PCR法和常规细菌鉴定法。对检测结果实施详细记录与分析。结果 所有粪便标本中，应用常规细菌检测出沙门菌21例，阳性率为1.63%，志贺菌50例，阳性率为3.88%；应用荧光定量PCR检测的沙门菌与志贺菌病例分别为23例、53例，阳性率分别为1.79%、4.11%。且将荧光定量PCR检测出的感染患者，应用常规细菌再次检测，检测结果完全相符，阳性率为100.00%。结论 荧光定量PCR检测法具有独特优势，不仅能够直接将粪便中的DNA快速提取，对致病菌进行准确判断，同时操作快速、简单，是一种可大范围推广应用的检测方式。关键词：荧光定量PCR法；常规细菌鉴定法；肠道致病菌；应用效果DOI:10.19335/ki.2096-1219.2023.05.037 Application Effect of Fluorescence Quantitative PCR and Routine Bacterial Identification Methods in Detection of Intestinal PathogensYANG Yuanyuan Yuncheng Nursing Vocational College,Yuncheng,Shanxi 044000ABSTRACT：Objective To explore clinical effect of fluorescent quantitative PCR and routine bacterial identification methods in detection of intestinal pathogenic bacteria,and carry on analysis and exploration.Methods The study was conducted from January 1,2019 to December 31,2021,participants in study were:data of 1286 diarrhea patients in a hospital during above period.The paper collected stool of all participating patients and carried on test with fluorescent quantitative PCR and routine bacterial identification methods.Test results were recorded and analyzed in detail.Results Among all fecal samples,21 cases of Salmonella were detected by routine bacteria,with positive rate of(1.63%),and 50 cases of Shigella were detected by routine bacteria,with positive rate of(3.88%).(23)and(53)cases Salmonella and Shigella were detected by fluorescence quantitative PCR,with positive rates of(1.79%)and(4.11%)respectively.Infected patients detected by fluorescence quantitative PCR were retested with routine bacteria,detection results were completely consistent,with positive rate of 100.00%.Conclusion:Fluorescence quantitative PCR method has unique advantages,can extract DNA from feces directly and determine pathogenic bacteria accurately,with fast and easy operation,which can be promoted and applied widely.KEYWORDS：Fluorescence quantitative PCR;Routine bacterial identification method;Intestinal pathogenic bacteria;Application effect0引言腹泻是一种消化系统最易发生的常见病症，其主要表现为大便性状改变且排便频繁，以其发病速度的快慢可将其分成急性和慢性两种。慢性腹泻多为肠道组织发生病变、胃肠功能障碍及其他相关疾病所致；而急性腹泻多为细菌感染、药物不适及中毒等原因所致。其中感染性腹泻的流行作者简介：杨园园（1982-），女，汉族，山西运城，运城护理职业学院，讲师，本科，微生物学检验。168|智慧健康Smart Healthcare2023 年 第 5 期性普遍较高，主要致病菌分为两种，即沙门菌和志贺菌。第一时间准确判断出致病菌的种类，对于感染性腹泻的诊疗非常重要。以往对此的检测方法为常规细菌鉴定，虽然具有较高的准确性，但由于是传统培养，存在一系列无法避免的弊端，如操作步骤复杂、检测用时较长、易受外界因素干扰等。在医疗检测技术不断更新换代的前提下，对于肠道致病菌的检测逐渐用荧光定量PCR法代替1。此检测方法的独有优势（操作步骤简便、可重复操作、灵敏性较强等）正好可弥补传统方法的诸多不足。本次研究主要针对上述两种方法在肠道致病菌中的检测结果进行研讨，现报告如下。1资料与方法1.1一般资料本次针对2019年1月1日-2021年12月31日期间，在某医院进行诊疗的1286例腹泻患者采集粪便标本展开研究，依次实施荧光定量PCR法和常规细菌鉴定法进行检测，将两种检测结果进行对比和研讨。1.2方法1.2.1常规细菌鉴定法该医院选用的采样器为一次性专用，用其将肛拭子采取后，进行增菌，即将其放入增菌液中18h以上24h以下，注意增菌液内含沙门菌和志贺菌。随后将SS与XLD琼脂引用划线法进行接种，在平板培养基内进行样本培养，注意要确保培养温度为37。培养期间密切观察菌落颜色及形状变化，一旦发现可疑菌落，则将其采用涂片与染色触媒及氧化酶等相关处理。必要情况下，可对上述标本进行凝集血清学试验，以便为菌种的准确鉴定提供相应保障2。随后，自双糖内将细菌悬液采集，使用单价与多价血清凝集方式，对采集出的菌体实施准确判断。1.2.2实时荧光定量PCR法采集完成肛拭子后，将其进行增菌，即放入增菌液内3h以上5h以下，注意增菌液内含沙门菌和志贺菌。利用一次性滴管取适量增菌液放入无菌离心管内（规格为1.5mL），随后再于上述试管内同时放入20人份的肛拭子增菌液，进行离心处理（10000r/min，处理3min），将上层清液完全剔除后，对底层液体实施检测（含量为50L）。底层液体中需加入5L DNA提取物，密切关注其变化，待出现沉淀悬浮状态后，对其实施煮沸100约5min后，再次进行离心处理（10000r/min），提取上层清液5L，放入新准备的灭菌离心管内。检测通道为：志贺菌VIC和沙门菌FAM，借助25L反应体系，应用实时荧光PCR仪器进行扩增。先实施的循环检测为94，3min，然后再实施40个循环检测，参数为93/30s55/45s3。1.3观察指标统计上述两种检测方法的检测结果，并对其在沙门菌和志贺菌中的阳性检出率进行对比和分析。1.4统计学方法对本次所收集的数据进行汇总后，运用SPSS 23.0软件对数据予以分析，计数资料用n(%)表示，行2检验。以P0.05），详见表1。2.2两种检测方法对志贺菌的检测结果本次所收集的1286份检测标本，实时荧光定量PCR法共检出53例，阳性检出率为4.11%，而常规细菌鉴定法为50例（3.88%），二者相比，未见明显差异（P0.05），详见表2。2.3PCR阳性进行常规检测的结果将荧光定量PCR检测出的感染患者，应用常|169健康科学医学实践规细菌再次检测，其检测结果完全相符，阳性率为100.00%。3讨论作为消化系统常见的病症腹泻的患病率普遍较高，且任意年龄的人群都可能发病。腹泻症状表现以大便性状发生改变及频繁排便为主。常见的感染性腹泻的致病因素主要有饮食不洁净、消化系统病变等，细菌类型主要包括沙门菌和志贺菌，可经消化道快速传播，导致大范围传染发病，给患者的身体和生活带来极大不便4。故而，在临床诊疗中，需要这一种检测手段，能够大规模普查肠道致病菌、快速、灵敏、便捷地检测粪便标本中的肠道致病菌群，以预防疾病流行，有效使用抗生素等药物进行治疗。细菌感染性腹泻的临床治疗首先要进行粪便细菌的准确判定，才能确保医师用药准确疗效达到预期。传统检测上述两种细菌的方法为常规细菌鉴定方式。包括细菌液培养、生化判定及血清学判定等多个步骤，不仅对检测人员要求较高、过程较为繁琐，且检测时较长，需要的器械、试剂等较为多样，并容易受到外界因素干扰而影响检测结果5。其主要包含的弊端有：此方法需要手工操作的步骤较多，因此极易出现误诊或漏诊等情况。如选取菌落时，忽略取菌环的温度控制而导致菌落人为造成死亡，或者工作人员未能熟练操作而没有选择出适宜的可疑菌落，也会造成致病菌鉴别的失误。患者自行使用抗生素也会对细菌培养产生不利影响6。采集的标本由于存放不当，可能会导致细菌污染而影响培养结果等。除此之外，细菌培养过程中的诸多因素也可能会对培养结果产生负面影响，包括环境、操作手法等基础条件、培养基质量与标本采集等方面。上述种种都是导致常规细菌检测法对感染细菌检测率较低的主要原因。由此可见，常规细菌鉴定法对两种细菌的阳性检出率较低，而且步骤相对更为复杂，用时较长，对于急性腹泻无法在短时间内提供准确判定结果，给临床诊疗带来一定困难7。近年来，在医疗检测技术不断更新与改进的大环境下，实时荧光定量PCR检测法被大量应用于多种疾病的诊疗中，其中也包括感染性腹泻。该方式具有一系列传统方式无可比拟的优势，如操作简单、便捷、检测速度快而准确、且一次能够进行多人份检测等。这些优势完全弥补了传统检测方式的不足。可在提取细菌DNA并对其进行准确判定的同时，再对疾病进行跟踪监控，且灵敏性及检出率较高8。但是鉴于其应用的器具及试剂较为昂贵，还可进行多人份同时检测，不仅能够节约费用，也不会影响判定结果的准确性9。本次研究共选择2019-2021年间，某院进行诊疗的1286例腹泻患者，对其资料进行整理，表 1两种检测方法对沙门菌的检测结果时间实时荧光定量 PCR 法常规细菌鉴定法2P总数沙门菌阳性率总数沙门菌阳性率201945871.5345861.310.0780.7792020512101.9551291.760.0530.816202131661.9031661.900.0001.000合计1286231.791286211.630.0950.761表 2两种检测方法对志贺菌的检测结果时间实时荧光定量 PCR 法常规细菌鉴定法2P总数志贺菌阳性率总数志贺菌阳性率2019458194.15458183.930.0280.8862020512214.10512203.910.0250.8732021316134.11316123.790.0420.838合计1286534.111286503.880.0910.762170|智慧健康Smart Healthcare2023 年 第 5 期依次使用荧光定量PCR法和常规细菌鉴定法。前一种方法共检出沙门菌23例，阳性检出率为1.79%，后一种方法检出21例，检出率1.63%，志贺菌：前一种方法共检出53例，阳性检出率为4.11%，后一种方法检出50例，检出率3.88%，二者相比，实时荧光定量PCR法略高于常规细菌鉴定法。究其原因，可能是后者的步骤更加繁琐，对操作人员的专业度要求较高，再加上其容易被多种因素影响，无法进行全面把控，或者患者自行服用抗生素会造成病菌死亡或消失等多种原因，而前者则不会出现类似情况，无论细菌死活都可进行扩增检测，且不会影响结果判定的准确性。同时，将荧光定量PCR检测出的感染患者，应用常规细菌再次检测，其检测结果完全相符，阳性率为100.00%。综上所述，实时荧光定量PCR法可将粪便中的DNA直接进行提取，且操作简单、快捷、用时较短，同时以准确的判定结果为医师的临床诊疗提供有力依据，因此今后的相关诊疗应将其作为首选检测方式予以应用。参考文献1 戴广明,王芬,曹廷明,等.实时荧光定量PCR检测不同结核标本及其联合玻璃珠磨菌法检测价值的初步研究J.中国防痨杂志,2022,44(5):450-454.2 周训永,何光志,莫金品,等.实时荧光定量PCR法分析黄连解毒汤对大鼠肠道乳酸杆菌的影响J.贵州中医药大学学报,2021,43(4):17-20,47.3 Dong Guoying,Wang Qian,Niu Jiangting,Cai Yiqin,Guo Yanbing,Zhao Han,Zhang Shuang,Wang Kai,Hu Guixue,Yi Shushuai.Development and application of a TaqMan-based real-time PCR assay for specifically detecting feline astrovirusJ.Molecular and Cellular Probes,2021,57(prepublish).4 高颖.实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法在肠道致病菌检测中的应用效果对比分析J.中国医药指南,2021,19(14):126-127.5 Karanth Padyana Anupama,Ashwath Nayak,Iddya Karunasagar,Indrani Karunasagar,Biswajit Maiti.Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichmentJ.Molecular Biology Reports,2021,48(1).6 依力亚斯艾力,乃比米吉提.两种细菌鉴定法在临床血液检验中的应用研究J.临床医药文献电子杂志,2020,7(37):138.7 Garza-Gonzlez Elvira,Camacho-Ortz Adrin,Rodrguez-Noriega Eduardo,Esparza-A h u m a d a S e r g i o,F l o r e s-T r e v i o Samantha,Bocanegra-Ibarias Paola,Tijerina-Rodrguez Laura,Morfn-Otero Rayo.Comparison of Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF MS)and the Vitek 2 System for Routine Identification of Clinically Relevant Bacteria and Yeast.J.Annals of clinical and laboratory science,2020,50(1).8 岳军,张英雪.直接药敏试验与常规药敏试验在临床血液细菌鉴定与检验中的应用对比研究J.中国医药指南,2019,17(9):92-93.9 拉巴仓决,米玛普尺.西藏日喀则市亚东县堆纳乡中心小学一起菌痢疫情病原学检测分析J.世界最新医学信息文摘,2016,16(A5):259,263.