药用植物三叶青组织培养研究进展_林丽霞.pdf

2023.3 经验交流三叶青（Terastigma hemsleyanum Diels et Gilg）为葡萄科崖爬藤属的多年生草质攀缘藤本植物，又称蛇附子、金钱吊葫芦、三叶崖爬藤、土经丸、石老鼠等，是我国特有的珍稀药用植物1-3。生于山谷疏林中或阴处石壁上，分布于长江流域至南部各省份，福建、湖南、云南、广东、广西等地的三叶青为青藤三叶青，浙江、江西一带的三叶青则为紫藤三叶青4-5。三叶青味微苦、性平，以块根或全草入药，在民间有“药王”“抗癌神草”“植物抗生素”等美誉，用于治疗小儿高热惊厥、百日咳、肺炎、哮喘等症，具有抗癌、抗肿瘤、抗炎、镇痛、清热解毒及保肝等作用，且毒副作用小6-7。目前，对三叶青的研究侧重于总黄酮提取工艺的优化及提取物的药效，尤其是抑制直肠癌、肝癌、皮肤癌等癌症细胞的生长8-10。随着三叶青药用成分更深入的研究与开发，野生三叶青远远满足不了市场逐年递增的需求，利用组织培养技术快速增殖瓶苗，可以在短时期内提供大量种苗。本文总结了近年来三叶青组织培养技术的研究进展，以期为建立高效、低成本三叶青组织快繁体系提供思路，为实现三叶青种苗大规模生产奠定基础。1外植体的来源与处理1.1外植体的选择在植物组织培养中，外植体的选择在很大程度上影响着无菌体系的建立。选择外植体时需考虑植物的品种、外植体的来源、取材的时间、材料的大小和消毒的难易等。目前，研究较多的三叶青组织培养材料主要来自浙江省各个地区，如宁波、建德、台州、丽水、金华、富阳等，少数来自安徽、江西和福建等地11。在三叶青组织培养中，可使用茎尖、带芽茎尖、腋芽、带腋芽的茎段、不带腋芽的幼嫩茎段和叶片等作为外植体。钟毓倩等的研究12发现，选择三叶青不同部位外植体进行组织培养，效果最好的诱导外植体为茎尖。王静13分别以带芽茎尖、带腋芽的半木质化茎段为外植体进行组织培养，结果表明，带腋芽茎段诱导的无菌苗分枝较多、更健壮，而茎尖诱导的无菌苗叶片出现严重退化。陆飞彪等人14选取生长良好三叶青嫩叶为外植体进行愈伤组织诱导，建立了三叶青愈伤组织诱导增殖体系。目前，三叶青组织培养主要以带腋芽的茎段直接诱导不定芽，进而继代增殖生根培养形成再生植株，以叶片为外植体诱导愈伤组织进行细胞悬浮培养。1.2外植体的消毒在组织培养中，培养基可能会被污染，所以外植体的消毒是组培的第1步，应根据所选外植体的污染程度选择适合的灭菌方式和灭菌时间。罗常荣15选带腋芽茎段为外植体，用洗洁精混合液（0.1%）浸泡30 min，再用流水冲洗30 min，使用75%酒精浸泡茎段5 min，接着用0.1%氯化汞（加23滴吐温）分别浸基金项目：厦门市重大科技计划项目（3502Z20211003）。作者简介：林丽霞(1989-)，女，助理研究员，从事果树栽培与植物种苗繁育技术研究。E-mail:通讯作者：施建羽（1971-），男，副研究员，从事果树栽培技术研究。E-mail:药用植物三叶青组织培养研究进展摘要：根据已报道的文献，对我国药用植物三叶青组织培养技术的研究进行归纳总结，从外植体的选择与消毒、培养基及植物生长调节剂的筛选、培养条件等方面进行阐述，以期为三叶青的种质资源保存及种苗工厂化生产提供理论参考。关键词：三叶青；组织培养；研究进展林丽霞林建忠赖瑞云张雪芹施建羽（福建省亚热带植物研究所/福建省亚热带植物生理生化重点公共实验室福建厦门361006）150-经验交流 2023.3泡震荡3个时间水平（5 min、10 min、15 min），无菌水浸泡震荡冲洗5次，结果表明，震荡消毒10 min成活率最高（为53.92%）。符渊淼16也是以幼嫩带腋芽茎段为外植体，自用流水冲洗3060 min，在超净工作台上先用70%酒精浸泡1 min，再用加有23滴吐温的0.1%HgCl2溶液浸泡15 min，最后用无菌水洗涤5次，约78%外植体未污染。2培养基与植物生长调节剂的选择2.1培养基的筛选植物组培中常用的再生途径就是通过诱导腋芽或者不定芽进行器官的直接发生，再对其增殖培养。史清英17通过比较4种基本培养基（MS、1/2MS、WPM、B5）对三叶青芽诱导和丛生芽增殖的影响，发现1/2MS、WPM基本培养基对腋芽的诱导率明显较高，分别为84.67%、86.00%；而MS、B5基本培养基芽增殖系数较高，且MS、1/2MS基本培养基有利于芽伸长。王静13以MS和1/2 MS为基本培养基诱导三叶青的不定芽，发现MS是初代苗的最佳诱导培养基；以MS、1/2 MS、3/4 MS为基本培养基进行侧枝的继代培养，发现MS为最佳增殖培养基。可见，以三叶青茎段为外植体，在初代培养基的选择上，一般采用1/2 M培养基或MS基础培养基，增殖培养基可选用MS作为基础培养基。三叶青的生根培养基一般采用1/2MS基本培养基，邵骏骅18以MS为生根培养基，其生根率也高达100%。此外，诱导植物外植体形成大量愈伤组织，可以在较短时间内通过愈伤组织分化形成不定芽或不定根。吴浩等19以不带腋芽的三叶青茎段为外植体，研究White、B5、MS 3种基本培养基对愈伤组织诱导率及分化率的影响，结果表明MS基本培养基的诱导率最高，为96.7%，而以培养基B5最有利于不定芽的分化，分化率为66.7%。卢爱芳等20以无菌苗叶片诱导愈伤组织，试验结果表明最佳诱导培养基为2/3 MS，诱导率高达96%，而1/2 MS培养基最有利于三叶青愈伤组织分化为不定根。2.2植物生长调节剂对组培苗的影响2.2.1植物生长调节剂对诱导三叶青腋芽和愈伤组织的影响不同的植物生长调节剂对外植体脱分化和器官发生的作用不同，使用不同浓度的植物生长调节剂对外植体生长和分化的作用亦不同，因此需根据植物外植体的不同选择适宜的植物生长调节剂及浓度。在诱导三叶青腋芽发生的培养基中一般添加6-BA、NAA、IBA等，通常采用6-BA和NAA、6-BA和IBA配合使用。钟毓倩等12的研究发现，初代培养的最佳激素配比为2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，诱导率为86%，罗常荣15同样以2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA的激素组合诱导腋芽，其诱导率仅为51.67%；而史清英17以较低浓度的6-BA（0.8 mg/L）和NAA（0.05 mg/L）进行诱导，诱导率高达100%。吴浩等19采用2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA诱导不带腋芽的幼嫩茎段，诱导率为96.7%。钱丽华21的研究发现，2,4-D对三叶青叶片愈伤的诱导效应差，单一的6-BA处理对三叶青叶片愈伤的诱导效应不理想。陆飞彪等14的研究表明，诱导愈伤组织的最佳激素组合为2.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L NAA，其诱导率为70%。此外，洪春桃22在诱导腋芽的培养基中添加了25%的活性炭。2.2.2植物生长调节剂对三叶青不定芽增殖的影响在不定芽的分化和增殖培养基中，常用6-BA和NAA的激素组合。陈加红23利用2.04.0 mg/L 6-BA和0.10.3 mg/L NAA增殖不定芽。彭昕等的研究24结果表明，利用2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/LIBA进行增值培养时芽的增殖效果最好。郑漫佳等的研究25结果表明，添加0.5 mg/L BA可以显著提高芽增殖系数，最大可达8.47；同时，添加3 g/L水晶洋菜作为凝固剂，芽增殖系数最大为5.68，显著高于添加琼脂粉的各个处理，而添加琼脂粉的试管苗生长容易出现玻璃化。2.2.3植物生长调节剂对愈伤组织分化及试管苗生根的影响在生根培养基中，符渊淼16比较了4种植物生长调节剂（2，4-D、IAA、NAA和IBA）对不定芽的生根影响，结果发现IBA对不定芽的生根效果最好，且3种浓度（0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L）下生根率都达到100%。3培养条件3.1光照光照是植物组织培养中的重要条件之一，包括光质、光照度和光照周期。钱丽华等21探讨光质对三叶青愈伤组织继代增殖的影响，结果表明红光与蓝光以91和73混合光源处理可提高三叶青愈伤干物质含量。通常条件下，三叶青愈伤组织的诱导、不定芽生长及细胞悬浮培养所需的光照度为2 000 lx，光照周期12 h/d。洪春桃等22以三叶青的嫩叶和腋芽151-2023.3 经验交流茎段为材料，建立了三叶青组织培养体系，光照度设为4 000 lx。3.2温度大多数植物组织培养是在2327的温度下进行，培养温度低于15时，组织就会停滞生长，超过35则不利于其生长甚至死亡。三叶青组织培养时一般培养温度为（252）。彭昕等24采用（262）的温度诱导三叶青丛生芽、增殖培养并获得完整植株。钱丽华等21探讨了不同温度对三叶青愈伤组织增殖的影响，结果表明，愈伤组织平均鲜重增长率在5个培养温度（23、25、28、30、34）中表现出显著性差异，其中在28下培养的平均鲜重增长率最大，而在34下培养45 d就开始褐化，然后逐渐死亡。3.3pH进行三叶青的组织培养，pH一般控制在5.8左右。琼脂培养基必须在溶解后进行pH的调整，因培养基经高压灭菌后pH会下降，所以在实际生产中配制的pH会适当调高。否则当pH过低时琼脂无法凝固，过高会导致培养基过硬，直接影响培养材料对营养物质的吸收。4试管苗移栽将一直在恒温、高湿、低光、异养等特殊环境下生长的试管苗移栽到外界自然条件下，需要经过一个逐步锻炼和适应的过程。在陈加红23的研究中，试管苗放置在（254）的温室中，在自然散射光下封口炼苗37d，再开口炼苗37d，炼苗后移栽至70%细泥土+20%泥炭+5%珍珠岩+3%缓释肥+2%草木灰的基质中，整个育苗期温度控制在1530。在钱丽华26的研究中，小拱棚内温度在28 左右，45 d即可长出新根，成活率可达到90%以上。邵骏骅18的研究发现，炼苗后洗去根部的培养基，栽植于装有蛭石、草炭、珍珠岩（361）混合基质的塑料盆中，第1周应覆盖塑料薄膜，3 d后逐渐揭开至1周后完全去除。4周以后，移栽苗即可完全适应且生长势旺盛。5展望在植物组织培养中最容易碰到污染、褐化和玻璃化等难题，在三叶青组织培养过程中也存在愈伤组织褐化及再生植株玻璃化问题，因此，在培养过程中要注意培养基的软硬程度适中、培养的温度和光照要合适等。目前，较多的研究是以三叶青茎段为外植体，其他器官高效再生体系的建立还未成熟，且不定芽的分化率仍较低。通过不断完善药用植物三叶青组织培养体系，可以快速繁殖大量三叶青种苗，改善三叶青野生资源短缺问题。同时，加强三叶青遗传转化体系、原生质体培养与再生等方面的研究，可以为培育优质新品种、开展基础研究等提供技术支撑。参考文献1范适，梁忠厚.三叶青植物资源研究与利用M.北京：中国林业出版社,2021.2林余霖.本草纲目原色图谱800例M.北京：华龄出版社,2020.3甘慈尧.浙南本草新编M.北京：中国中医药出版社,2016.4吴德峰.实用中草药M.上海：上海科学技术出版社,2017.5Zhu M X,Yan L H.Resource investigation on rare and en-dangered She medicine Tetrastigma hemsleyanum in ZhejiangProvinceJ.Zhong yao cai,2014,37（5）:766-70.6彭昕，王志安.中国三叶青资源研究与利用M.北京：中国轻工业出版社,2018.7李葆莉.本草纲目彩色图鉴（下）M.北京：中医古籍出版社,2018.8Zhai Y F,et al.Total flavonoids from the dried root of Tetrastig-ma hemsleyanum Diels et Gilg inhibit colorectal cancer growththrough PI3K/AKT/mTOR signaling pathwayJ.Phytotherapy re-search:PTR,2022.9Liu Z D，Ding F M，Shen X Y.Total flavonoids of Radix Te-trastigma suppress inflammation-related hepatocellular carci-noma cell metastasisJ.Molecular Genetics and Genomics,2021,296（3）:1-9.10Zhong L R.Radix Tetrastigma hemsleyani flavone suppressescutaneous squamous cell carcinoma A431 cells via proteasomeinhibitionJ.Medicalscience monitor:international medical jour-nal of experimental and clinical research,2019,25:436-442.11徐硕,金鹏飞,徐文峰，等.民间中药三叶青的研究进展J.中南药学，2016,14（12）:1336-1341.12钟毓倩.三叶青的组织培养与快速繁殖研究J.浙江中医杂志,2007（6）:363.13王静.三叶青HPLC指纹图谱的质量评价及快速繁育研究D.杭州：浙江理工大学,2016.14陆飞彪,陈妍月,程汝滨,等.三叶青愈伤组织诱导增殖体系建立及天然有机物促进总黄酮合成的研究J.时珍国医国药,2019,30（12）:2987-2990.15罗常荣.药用植物三叶青快繁研究D.福州：福建农林大学,2017.16符渊淼.药用植物三叶青的种质鉴定和组培快繁研究D.杭州：浙江大学,2011.17史清英.三叶青茎段外植体组织培养体系的优化及印度梨形孢对其生长的影响D.杭州：浙江大学,2015.18邵骏骅,邵卫平,刘永立.三叶青高效快繁技术体系的建立J.安徽农业科学,2015,43（35）:208-209.19吴浩,彭昕,林言娜,等.三叶青愈伤组织诱导及分化培养基筛选J.现代农业科技,2011（21）:121-122，125.152-经验交流 2023.320卢爱芳,祁明君,李宗亮,等.三叶青愈伤组织培养及其总黄酮含量的研究J.中药材,2010,33（7）:1042-1045.21钱丽华.三叶青不定根组培快繁体系的建立与应用研究D.杭州：浙江大学,2013.22洪春桃,沈登锋,魏斌,等.几种三叶青组织培养快繁体系的比较及其优化J.浙江农业科学,2019,60（10）:1846-1849.23陈加红.浙江野生三叶青的规模化组培育苗J.河南农业,2018（13）:56.24彭昕,林言娜,何军邀,等.正交法优化三叶青继代增殖与生根培养的条件J.现代中药研究与实践,2012,26（2）:10-12，33.25郑漫佳,韩素芳,程诗明,等.三叶青组培快繁与试管苗光合特性分析J.福建林业科技,2021,48（2）:53-59，72.26钱丽华.三叶青的离体快速繁殖J.植物生理学通讯,2008（1）:121-122.1.5冬灌（初霜后）和田地区初霜一般在10月中旬左右，即冬灌在10月中旬后，封冻前完成，灌（滴）水量80 m3/亩，灌水要求渗水深度1.0 m，每个滴头渗水半径0.7 m。要求灌足、灌匀，为枝条提供充足的水分，促使葡萄安全越冬。1.6注意事项（1）在选择水溶肥时，除满足上述条件外，尽可能选择含有硼、钙、锌、铁等微量元素的水溶肥。（2）使用滴灌系统时，在结束灌水前2 h加入水溶肥，加入肥料后搅拌使其充分溶解后随水滴施；和田地区风沙大、沙壤土、盐碱大，每次灌完水后都要及时冲洗滤网，以免堵塞，在完成冬灌后，将施肥罐中的水全部排干净。（3）灌水时间与灌水量要根据不同时期降水情况及葡萄生长周期需水规律进行灌、控水。2与传统水肥管理方式的对比分析2.1灌水对比通过试验示范观测，采用传统的大水漫灌方式，三年生葡萄园全年灌水1012次，每次灌水量6070 m3/亩，全年灌水量700800 m3。采用滴（灌）水，全年灌水910次，每次灌水量50 m3/亩左右（冬灌水80 m3），全年灌水量500600 m3，节约用水40%以上。采用传统方法灌水，每人每日灌20亩葡萄园，加上修整渠道和前期准备工作，全年葡萄园浇水分摊人工费200300元/亩，且劳动强度大；采用滴（灌）水，每人每日可滴（灌）50亩，年分摊滴（灌）水人工费用50100元/亩，且劳动强度较小，节约人工成本。2.2施肥对比采用传统方法追施无机肥，每年23次，每次1520 kg，灌水前人工挖坑施入，每次需摊人工费用6090元，劳动强度大；采用水肥一体化技术，全年可追施无机肥5次以上，肥料随水滴施，无须增加人工费用（表1）。表1水肥一体化技术与传统方式水肥管理效果对比方法灌水次数亩灌水量（m3）亩水费（元）年亩水费（元）年分摊人工费（元）施肥次数施肥亩人工费用（元）水肥施入方式传统方式1012607037.5412.5200300236090分开进行水肥一体化技术9105025.0250.050100680随水滴施（上接50页）综上所述，在和田地区葡萄种植采用水肥一体化管理技术与传统管理方式相比，不但灌水施肥效果大幅提高，而且节水、节肥、省时、省工，很适合在该地区推广应用。参考文献1李香云.新疆和田地区脱贫发展中的水资源问题J.水利发展研究,2017,17（2）:4-8,14.2刘绍锋,朱兰香.水肥一体化技术J.山东农机化,2018（5）:47-49.3曹翰文.葡萄水肥一体化关键技术及应用效果J.农广天地,2019（25）：1.4吕海舰,马英龙,郑吉侠,等.葡萄营养需求特性及施肥技术J.现代农业科技，2012（7）：158.5阿不列孜热合曼.葡萄磷肥的科学施用与管理J.果树实用技术与信息,2021（6）:16-17.6李强,许泽华.贺兰山东麓酿酒葡萄肥料配施方法J.宁夏农林科技,2017,58（12）:60-61.7吴云,逯连静.水肥一体化技术在葡萄种植中的推广应用J.上海蔬菜,2020（6）:60-61.8黄秋凤,陈国品,谢蜀豫,等.巨峰葡萄一年两收栽培肥水管理要点J.中外葡萄与葡萄酒,2017（6）:48-50.9阿不列孜热合曼.葡萄钾肥的科学施用与管理J.果树实用技术与信息,2021（7）:21-22.10夏英.葡萄园秋季管理技术要点J.农村科技,2015（9）:42-43.11李兴师.葡萄采收后的管理J.果农之友,2020（9）:28.153-