遗传的制作和基因定位专家讲座.pptx

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,4.5 细菌遗传分析与基因定位,4.5.1细菌转化和基因定位,转化,：,指一些细菌能经过其细胞膜,摄取,周围供体染色体片段，将另外源DNA片段经过,重组,加入自己染色体组过程。,1928年，格里费斯(Griffith F.),在肺炎双球菌中发觉转化现象。,1944年，阿委瑞(Avery O.T.),成功地进行了肺炎双球菌转化试验；证实遗传物质是DNA；转化是细菌交换基因方法之一。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第1页,细菌中大部分转化工作是用下面,三种细菌完成,：,肺炎双球菌，枯草杆菌和流感嗜血杆菌。,转化主要分为二个步骤进行:,(一)供体DNA与受体细胞间接触与互作,肺炎双球菌转化：DNA片断最少有800个碱基对；,枯草杆菌转化：DNA片断最少有16000个碱基对。,转化第一步是使转化DNA与受体细菌间成功地相互作用，这包含：,转化片段大小、形态、浓度和受体细胞生理状态。,.转化片断大小：,遗传的制作和基因定位专家讲座,第2页,.供体DNA分子存在数目：,对特定基因来说，供体DNA分子数目与成功转化相关。,链霉素抗性基因转化：,在每个细胞含有,10个DNA分子之前，,抗性转化体数目一直与DNA分子存在数目成正比。,原因：,在细菌细胞壁或细胞膜上有固定数量,DNA接收座位，,故普通细菌摄取DNA分子数,小于10,个。,受体生理状态：,受体细胞,必须在生理上,处于感受态,。,这种感受态只能发生在细菌生长周期,某一时间范围内,，在感受态内，活跃合成蛋白质细菌细胞壁多少发生改变而,易于接收转化DNA,。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第3页,、,转化DNA摄取和整合过程：,细菌中转化，包含,供体DNA结合与穿入，联会和整合,。,当细菌处于,感受态,时，外源双链DNA分子可结合在受体细胞表面,接收座位上,。细菌在摄取外源DNA时，由DNA移位酶降解其中一条链，并利用降解这条链产生能量，将另一条链拉进细胞中。,.结合与穿入：,供体单链DNA片段一旦进入细胞，按各个不一样位点与其对应受体DNA片段联会。,.联会：,单链转化DNA经过与受体DNA对应位点,置换,从而稳定地参入到受体DNA中。,整合(重组)：,遗传的制作和基因定位专家讲座,第4页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第5页,(三)转化和基因重组作图,比如：黎德伯格等用枯草杆菌进行转化和重组试验,DNA 片段进入受体细胞之后，可与受体染色体发生重组。,紧密连锁,两个基因有较多机会包含在同一个DNA片段中，并同时整合到受体染色体中。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第6页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第7页,Trp2 his2 tyr1,三者并发转化频率最高，故这3个基因是连锁，,其中his2和tyr1连锁紧密：,单交换时，染色体开环易降解，故不存在单交换类型；,只有双交换和偶数多交换才有效。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第8页,4.5.2细菌,接合,和基因定位,1.接合：,是指原核生物遗传物质从,供体,(donor)转移,到,受体,(receptor)内过程。,特点：,需经过,细胞直接接触,。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第9页,B菌株：,Met+bio+thr-leu-，,需加,苏氨酸,和,亮氨酸,。,不一样营养缺点型大肠杆菌：,A菌株：,Met-bio-thr+leu+，,需加,甲硫氨酸,和,生物素,。,4.5.2.1黎德伯格和塔特姆（1946年）：,A菌株和B菌株营养缺点型，不能在基本培养上生长。,A,+,B菌株混合培养,，在完全培养基上，几小时后离心，涂布基本培养,长出原养型,(Met+bio+thr+leu+)菌落。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第10页,这种原养型细胞怎样出现？,转化？,细胞间直接接触而发生遗传物质交换和重组?,A、B菌株分别培养在基本,培养基上,一边加压和吸引使培养液充分混合,结果任何一臂培养基上均未长出原养型细菌。,直接接触(接合)是原养型细胞出现必要条件。,大分子可经过，细菌不能经过,Hayes(1952)试验证实,：,接合过程是一个,单向,转移，A菌株遗传物质,B菌株，从供体“donor”到受体“receptor”。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第11页,F 因子：,致育因子(性因子)，是一个附加体。,携带F因子菌株称为供体菌或雄性，用,F,表示。,未携带F因子菌株为受体菌或雌性，用,F,表示。,5.4.2.2细菌遗传物质转移是单向,F 因子组成：,染色体外遗传物质，,环状DNA；,40-60个蛋白质基因；,2-4个/细胞(雄性内)。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第12页,4.5.2.3F 因子三种状态：,以大肠杆菌为例：,一个自主状态F因子，即F,；,带有一个整合F因子细胞叫高频重组细胞，Hfr细胞。,没有F因子，即F；,遗传的制作和基因定位专家讲座,第13页,自主状态时,F 因子独立进行分裂。,F,F,：,先形成接合管，F因子DNA边转移边复制，F,细胞,F,细胞。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第14页,F因子整合到细菌染色体上(F,Hfr细胞)，,其繁殖与细菌染色体同时进行,。,此时，细菌基因,重组频率增加4倍,以上，所以染色体上整合有F因子菌株，称为,Hfr菌株,。,、Hfr细胞形成及染色体转移,：,遗传的制作和基因定位专家讲座,第15页,细菌染色体由一小段单链F因子为前导而转移到F,-,受体,边进入边合成。普通情况下仅小部分细菌染色体能够转入，接合中止,受体细胞仍为F,，F因子仍留在供体内。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第16页,部分二倍体中发生交换:,单数交换,：打开环状染色体，产生一个线性染色体，这种细胞是不能成活。,偶数交换,：产生可遗传重组体和片段。,部分二倍体：,当F或Hfr细菌染色体进入F后，在一个短时期内，F细胞内,一些位点就会成为二倍体DNA。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第17页,4.5.2.5 中止杂交作图,中止杂交：,就是将两个菌株（比如,Hfr a,+,str,s,F,-,a,-,str,r,）在培养液中进行通风培养，每隔一定时间取样，把菌液放入组织捣碎器里搅拌以中止杂交，经过稀释接种到判别培养基上，待形成菌落后判定它们基因型。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第18页,1955,年,Wollman,和,Jacob,首次进行中止杂交试验：,供体菌：,HfrH,str,s,thr,+,leu,+,azi,s,ton,s,lac,+,gal,+,受体菌：,F,-,str,r,thr,leu,-,azi,r,ton,r,lac,-,gal,-,将大约,10,倍,F,-,菌与,Hfr,对数期菌混合，轻轻振荡培养,在不一样时间间隔取样，然后在组织搅拌中猛烈振荡,中止杂交,振荡后培养物涂布于加了链霉素基本培养基上,筛选不一样于两个亲本,thr,+,leu,+,str,r,重组子,再对每一个重组子非选择性标识,azi ton lac gal,进行测定。,azi：叠氮化钠抗性，ton：噬菌体T1抗性,中止杂交试验过程,遗传的制作和基因定位专家讲座,第19页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第20页,中止杂交试验结果,遗传的制作和基因定位专家讲座,第21页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第22页,（1）不一样非选择标识进入受体且重组时间不一样，但都是稳定；,（2）各基因重组频率伴随时间增加而增加，直至极值；,（3）按时间次序，先重组和后重组基因，重组率极值在逐步降低；,遗传的制作和基因定位专家讲座,第23页,该方法主要依据基因转移先后次序，以时间为单位，求基因间遗传距离。,利用中止杂交试验作图,遗传的制作和基因定位专家讲座,第24页,大肠杆菌染色体是环形,不一样Hfr菌株进行中止杂交试验，基因转移次序、起点和转移方向各不相同。,推断大肠杆菌染色体为环形，而F因子在细菌染色体上有许多插入位点，且插入方向不一样。,Hfr H o thr,azi,lac tsx gal trp mal xyl metB thi,F,C o tsx lac,azi,thr thi metB xyl mal trp gal,F,J4 o thi metB xyl mal trp gal tsx lac,azi,thr,F,P72 o metB thi thr,azi,lac tsx gal trp mal xyl,F,Trp mal,Gal xyl,tsx metB,lac thi,azi,thr,C P72,H J4,遗传的制作和基因定位专家讲座,第25页,细菌染色体为环状,遗传的制作和基因定位专家讲座,第26页,当转移时间间隔在两分钟之内，如已知lac与ade紧密连锁，距离约为1分钟，中止杂交作图就不可靠，须用传统重组作图,(recombination mapping)。,紫红色菌落：,lac+ade+,780（亲本型）,白色或粉红色菌落：,lac-,ade+,220（重组型）,Hfr:,lac,+,ade,+,str,s,X F,-,:,lac,-,ade,-,str,r,混合60min,F,-,：,ade+,str,r,1000,MM+str,影印EMB,五、重组作图,二个基因紧密连锁:,lac,-,：乳糖不发酵,ade,-,：腺嘌呤缺点型,遗传的制作和基因定位专家讲座,第27页,1、重组子产生,lac-ade+,str,r,lac+ade+,str,r,lac+ade+str,s,lac-ade-str,r,lac-ade-str,s,lac+ade+str,s,lac-ade-str,r,lac+ade-str,s,遗传的制作和基因定位专家讲座,第28页,2、重组频率计算,1分钟相当于20%重组值，即：1min=20cM,RF,lac-ade,=,*100%,lac,-,ade,+,lac,+,ade,+,+lac,-,ade,+,=,*100%=22%=22cM,220,1000,遗传的制作和基因定位专家讲座,第29页,3、大肠杆菌遗传图谱,图距单位：,分钟,总长度：,100,分钟,起点（0分钟）：,thr,座位,大肠杆菌环形遗传学图,遗传的制作和基因定位专家讲座,第30页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第31页,4.5.3细菌转导和作画,1.定义：以噬菌体为媒介所进行细菌遗传物质重组过程，称,转导。,2.发觉,Lederbery及其硕士Zinder（1951）首先在鼠伤寒沙门氏菌（Salmenella typhimurium）中发觉转导现象。,发觉过程,他们用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸营养缺点型鼠伤寒沙门氏菌和甲硫氨酸、组氨酸营养缺点型鼠伤寒沙门氏菌共同培养，相当让两种不一样缺点型菌杂交。杂交过程和结果以下：,遗传的制作和基因定位专家讲座,第32页,LT22 phe,-,try,-,tyr,-,LT2 met,-,his,-,（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）（甲硫氨酸、组氨酸）,营养缺点型 营养缺点型,原养型菌落（即出现个别正常型细菌）,那么这些原养型菌落出现是由接合引发？还是由转化引发？他们先进行U形管试验（P159），结果在LT22一臂取得原养型菌株，由此推测可能有一个可经过滤膜过滤性因子（FA）在起作用。深入利用DNA酶处理，结果FA不受DNA酶影响，从而消除了转化作用可能性。最终认为FA是一个噬菌体，发觉了转导。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第33页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第34页,3.转导机制,转导是在噬菌体包装中因为错误将细菌染色体片段包装进去成为内含细菌染色体片段“假噬菌体”而发生。详细过程以下：,（1）噬菌体侵染细菌。,（2）噬菌体DNA使细菌染色体形成片段，合成噬菌体DNA和外壳。,（3）新噬菌体包装，偶然将细菌染色体片段也包装进去成为内含细菌染色体片段“假噬菌体”。“假噬菌体”和真噬菌体一起释放出来。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第35页,（4）“假噬菌体”和真噬菌体一样可再侵染细菌，其中“假噬菌体”侵染时，就将外来细菌基因注入，经过基因重组改变遗传性状，完成转导过程。,当前依据转导机制，已广泛应用在体外包装“假噬菌体”，即将外源基因导入“假噬菌体”中，再侵染细菌，进行基因表示研究。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第36页,1.普遍性转导,普遍性转导：指P1、P,22,等能够转导沙门氏菌染色体组任何不一样部分。,假如两个基因一直是一起转导或同时转导（共转导或并发转导）频率较高，那么证实两基因连锁，而且频率越高，则两基因距离越近。,如：a基因和b基因共转导频率高，a和c共转导频率也高，b和c共转导频率低，则3个基因次序为 b a c,遗传的制作和基因定位专家讲座,第37页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第38页,若同时观察3因子转导分析，则只做一次试验就可推出其次序。,举例：利用普遍性转导测知leu，thr，azi三个基因次序。,方法：,（1）用噬菌体P1侵染带leu,+,，thr,+,和azi,+,大肠杆菌。,（2）用从该大肠杆菌释放出来噬菌体，再侵染leu,-,、thr,-,和azi,-,大肠杆菌。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第39页,(3)把受体菌接种到不含thr选择培养基上对thr,+,进行选择，凡具thr,+,细菌都可生长，把此菌接种到其它培养基上，结果在选出thr,+,重组子只有3%leu,+,，但无一个同时也是azi,+,。若选择leu,+,重组子，则约有50%同时也是azi,+,，所以3基因次序应为 thr,+,leu,+,azi,+,。P165,遗传的制作和基因定位专家讲座,第40页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第41页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第42页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第43页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第44页,2.特异性（不足）转导,概念：,只能转移细菌染色体特定部分基因转导.,2 不足转导过程,3 转导机制:,是因为噬菌体在细菌染色体特定位,点上整合。,4 低频转导与高频转导,噬菌体,感染,供体菌,裂解液,(转导噬菌体),非溶源,(溶源菌),(10,-6,),性细菌,溶源性转导子,重组性转导子,低频转导：,指,溶源性细菌,经诱导所释放噬菌体所,进行转导.,遗传的制作和基因定位专家讲座,第45页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第46页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第47页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第48页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第49页,4.6噬菌体重组作图,4.6.1噬菌体结构和形态,遗传的制作和基因定位专家讲座,第50页,二,噬菌体,1951年,Esther Lederberg,发觉K12中有原噬菌体，并命名为,。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第51页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第52页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第53页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第54页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第55页,附加体(,episome,),合子诱导,（,zygotic induction,）,Hfr,（,）,F,无重组子,Hfr,F,（,）,有重组子,遗传的制作和基因定位专家讲座,第56页,4.6.2噬菌体重组作画,菌苔,（lawn）,噬菌斑,（plaque）,遗传的制作和基因定位专家讲座,第57页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第58页,四、T2环形遗传图,遗传的制作和基因定位专家讲座,第59页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第60页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第61页,噬菌体DNA环状排列与末端重复,一、线性DNA含有环状遗传图,末端重复也称末端冗余：是指T4或T2双链DNA分子两端带有相同碱基序列。,环状排列又称致环交换。,遗传的制作和基因定位专家讲座,第62页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第63页,遗传的制作和基因定位专家讲座,第64页,1）感染早期,2）感染后期,环状排列与末端重复形成,遗传的制作和基因定位专家讲座,第65页,