质谱分析方法（MS）笔记.docx

一、质谱分析方法（MS）简介
1. 概述: 质谱法(Mass Spectrometry, MS) 是通过将样品转化为运动的气态离子并按质荷比(m/z)大小进行分离并记录其信息的分析方法。

被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果
4.质谱仪的组成

一、离子源: 离子源的作用是将欲分析样品电离，得到带有样品信息的离子。
不同分子离子化所需要的能量差异很大，应选择不同的离解方法
(1) 软电离方法 : 能量的较低电离方法 适用于易破裂或易电离样品
(2) 硬电离方法 能量较高的电离方法
1、电子电离源(Electron Ionization EI) :电子电离源又称EI源，是应用最为广泛的离子源，它主要用于挥发性样品的电离
优点 (1) 应用最广，标准质谱图基本都是采用EI源得到的；(2) 质谱图再现性好，便于计算机检索及比较; (3) 结构简单，操作方便。
缺点： (1) 质谱图中分子离子峰很弱或不出现（由于电子的能量高，分子离子进一步离解成碎片离子）; (2) 样品必须易于气化,不适合极性大、热不稳定化合物。
产生的分子离子种类: M+ • 或M- •
2、化学电离源(Chemical Ionization , CI ) ：化合物稳定性差，用EI方式不易得到分子离子,因而也就得不到分子量。为了得到分子量可以采用CI电离方式。
用高能电子（100~240eV）轰击离子室内的反应气（甲烷；10~100Pa） ，电离产生CH5+和C2H5+，后者再与样品分子碰撞，产生准分子离子。
化学电离是通过离子-分子反应来完成的。反应气体一般是甲烷、异丁烷等。
优点：1）准分子离子峰强度高，便于推算分子量；2）色质联用仪器，载气不必除去；3）反映异构体的差别较EI谱要好些。
缺点：碎片离子峰少，强度低。
产生的分子离子或准分子离子种类不同类型的分子能被特定的正或负反应离子有选择地电离。例如，胺和醚等含杂原子的分子通常产生大量的[M+H]+,而饱和烃则常产生[M-H]+等。
3、场致电离源（Field Ionization, FI and Field Desorption FD） ：应用强电场诱发样品电离电压：7-10 kV；d<1 mm；强电场将分子中拉出一个电子
场离子化是一种温和的技术，产生的碎片很少。主要为分子离子和（M＋l）离子。碎片通常是由热分解或电极附近的分子一离子碰撞反应所产生。不适用于化合物的结构分析。
场电离（FI）当样品蒸汽接近或接触带高正电位的金属针时，在强电场的作用下发生电离。
优点：电离快速，适合于和气相色谱联机；
缺点：要求样品汽化，灵敏度低。
场解吸（FD）：原理与FI相近，但样品是被沉积在电极上。
FD适用于难汽化的、热不稳定样品。FD的准分子离子峰比FI的强，质谱图比FI的还要简单。
4、快原子轰击法(Fast Atom Bombardment, FAB)：快原子轰击电离法是用高速原子（离子）枪射出的高速中性原子（Ar, Xe or Cs+离子）束对溶解在底物中的样品分子进行轰击，产生 [M+H]+ or [M]+等离子的电离法。
适用于挥发性低、强极性、离子型的化合物，需要选择合适的基质
产生的分子离子或准分子离子种类：一般常见的[M+H]+根据底物脱氢以及分解反应产生的[M-H]+容易提供电子的芳烃化合物产生M+•甾类化合物、氨基霉素等还产生[M+NH4]+
糖甙、聚醚等一般可（产生）观察到[M+Na]+。
5、激光解吸源（Laser Description，LD）：激光解吸源是利用一定波长的脉冲式激光照射样品使样品电离的一种电离方式。被分析的样品置于涂有基质的样品靶上,激光照射到样品靶上,基质分子吸收激光能量，与样品分子一起蒸发到气相并使样品分子电离。可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。
适合于分析生物大分子，分子量可达数十万至百万质量数。如肽、蛋白质、
核酸等，需要选择合适的有机酸或甘油作为基质。
优点：可用于难于电离的样品，无明显的碎裂；
允许样品中含非挥发性组分；
特别适用于与飞行时间质谱相配 （MALDI-TOF MS）。
缺点：基质的选择烦琐；
制样过程要求高。
产生的分子离子或准分子离子种类
M+H)+ 或 (M-H)- （类似于FAB法中由质子转移反应 得到的离子）
(M+Na)+ ，正负多电荷离子 (M+nH)n+ 或 (M-nH)n-（由基质效应等因素产生）
正负簇合物离子的(nM+H)+ 或 (nM-H)- （在结晶中容易形成）
M+•（与B+• 通过电荷交换反应得到的离子）
二、质量分析器
将离子源中生成的各种离子按质荷比m／z分离。不同类型质谱仪区别主要在于此。
质量分析器的主要类型有：磁分析器、飞行时间分析器、四极滤质器、离子捕获分析器、离子回旋共振分析器。
（1）四极滤质器 (Quadrupole Mass Filter) ：通过加在四极杆上的交变电压，改变电压和频率进行扫描。从而允许一定质量的离子通过四极场到达接受器（是电场扫描）。 M/Z=2E/v2
其中：E=电压（离子动能），v =离子速度
优点：扫描速度快，价格便宜，体积小，目前已开发出台式仪器被广泛使用。
缺点：质量范围窄，分辨率有限（不能测定高分辨）
（2）飞行时间分析器（Time Of Flight）：利用相同能量的带电离子，由于质量的差异而具有不同速度的原理，实现不同质量的离子以不同时间通过相同的漂移距离（领域）到达接受器。
M/Z=2E/v2, v=d/t 代入左式得到 M/Z=Kt2 (k =2E/d2) (d：飞行距离；t：飞行时间 )
m/z小的离子，漂移运动的速度快，最先通过漂移管，到达检测器。
m/z大的离子，漂移运动的速度慢，最后通过漂移管，到达检测器
优点：扫描速度快，灵敏度高，质量范围宽，结构简单，造价低廉等
缺点：分辨率低。但是，现在已经提高到10000以上分辨率
（3）离子阱检测器（Ion Trap Mass Analyzer）：通过电场或磁场将气相离子控制并贮存一段时间的装置。特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；结构简单、成本低且易于操作，已用于GC－MS联用装置用于m/z 200－2000的分子分析。
（4）离子回旋共振分析器（FT-ICR：Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance ）
在射频电场和正交（横）磁场作用下，离子做螺旋回转运动，回旋半径越转越大，当离子回旋运动的频率与补电场射频频率相等时，产生回旋共振现象，测量产生回旋共振的离子流强度，经‘傅立叶’变换计算，最后得到质谱图。是比较新的技术，比较有利于研究高质量数，高分辨及多级离子分析。但是，目前还不太作为常规仪器使用。
5. 质谱仪的性能指标
1）质量测定范围 ：质谱仪所能够进行分析的样品的相对原子质量（或相对分子质量）范围，通常采用原子质量单位u(Da)度量。
2） 分辨率 指质谱仪分辨相邻质量数离子的能力。
定义为：两个相等强度的相邻峰(质量分别为m1和m2)间的峰谷不大于峰高的10%时，则可认为两峰已分开，其分辨率R为：其中m1、m2为质量数(m1＜m2)
两峰质量数较小时，要求仪器分辨率越大。可见在质量数小时，分辨率亦较小。
质谱仪的分辨本领与离子通道半径r、加速器和收集器狭缝宽度、离子源的性质和质量等因素有关。
（3）灵敏度：仪器对样品在量的方面的检测能力（检出限）。
绝对灵敏度：在记录设备上得到可检测信号所需要的样品量；ESI: fmol-pmol
相对灵敏度：可检测到的微量杂质的最小相对浓度。
（４）峰形
（５）精密度和准确度
二、常见质谱分析方法的选择
根据研究特点以及所需获取的信息选择合理的质谱仪器进行样品分析
1. 高分辨质谱仪（HRMS）：有机化合物元素组成以及精确相对分子质量的测定
高分辨一般要求测定的质量数达到小数点后4位，测量值和计算值之差除以分子量结果小于5ppm
如FT-ICR MS（傅立叶变化离子回旋共振）
Orbitrap (静电场傅立叶变换质谱)
可用于确定化合物分子的元素组成，代替元素分析
2. 电子轰击电离源质谱（EI-MS）或串联质谱（MS/MS）
获取碎片离子，对小分子有机化合物进行结构分析，判断其所含官能团
EI源质谱的分析中分子离子的碎裂有确定的机理，能合理推断出化合物的结构；目前得到的大部分已知有机化合物的标准质谱图均由EI源质谱获得，可将所获得的质谱与标准谱图进行对比，确证其是否是目标产物
利用ESI-MS的串联质谱功能（MS/MS） ，也可以获得化合物的碎片离子，进行结构分析
优点：可将任意一个母离子隔离出来打碎获得碎片离子，以获取其结构信息；具有多级串联功
缺点：无成熟确定的断裂机理；无标准谱图进行比照
3. 感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）：无机物的元素分析、同位素示踪、环境样 品的分析
ICP作为质谱的高温离子源（7000K），样品在通道中进行蒸发、解离、原子化、电离等过程。
4. 气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)和高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)：复杂有机物（如天然产物）的分离纯化与定性、定量及结构分析
色谱用于分离纯化与定量分析；质谱用于定性及结构分析（依据碎片离子的种类和分子离子的断裂方式）
GC: 300℃以下汽化样品
HPLC: 300℃以上汽化样品
5. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)
检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物
软电离新型有机质谱，通过引入基质分子，使待测分子不产生碎片，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子解吸离子化的问题，是分析难挥发的有机物质的重要手段之一 ,可测定生物大分子的分子量高达600KDa
三、电喷雾质谱(ESI-MS)的介绍
它的主要部件是一个多层套管组成的电喷雾喷咀。电场作用下使喷出的液体易分散成微滴。另外，在喷嘴的斜前方还有一个补助气喷咀，补助气的作用是使微滴的溶剂快速蒸发。在微滴蒸发过程中表面电荷密度逐渐增大，当增大到某个临界值时，离子就可以从表面蒸发出来。
适合于分析不稳定的极性化合物和生物大分子

加到喷嘴上的电压可以是正，也可以是负。通过调节极性，可以得到正或负离子的质谱。
软电离方式，分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它用于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样，一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷，则其质荷比只有1000Da，进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点，目前采用电喷雾电离，可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。
产生的准分子离子种类
低分子量化合物:
正离子: (M+H)+ (M+NH4)+ (M+Na)+ (M+K)+
负离子: (M-H)- (M+Cl)- (M+Br)- (M+Ac)-
生物大分子与聚合物：
正负多电荷离子 (M+nH)n+ 或 (M-nH)n-
正负簇合物离子的(nM+H)+ 或 (nM-H)-
大气压化学电离源(Atmospheric pressure chemical Ionization, APCI) 结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于APCI喷咀的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+ 和O+ 等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化，这些反应过程包括由质子转移和电荷交换产生正离子，质子脱离和电子捕获产生负离子等。
适合于分析中性与极性较小的化合物,尤其是挥发性化合物
产生的准分子离子种类
正离子: (M+H)+ (M+NH4)+ (M+Na)+ (M+K)+
负离子: (M-H)- (M+Cl)- (M+Br)- (M+Ac)-

制样：
将纯化好的微量固、液体样品溶于100-200ul基质液（50%H2O，50%乙腈，按0.1%加甲酸或纯H2O、甲醇、乙腈等）；
组成基质液的有机试剂应达到ＨＰＬＣ级，H2O应为超纯水（18.2MΩ·cm ）；
样品中不能含有固体颗粒，否则需通过微孔滤膜过滤除去。
注：未经测试人员允许，不得使用DMF、DMSO等强极性溶剂以及强酸性、强碱性介质溶解样品
4. 电喷雾质谱谱图解析及分析结果的表示
(1)常用术语
基峰: 质谱图上最强的离子峰,相对丰度定为100％。
质荷比: 离子的质量数与所带的电荷之比。
精确质量: 基于天然丰度最大的同位素的精确原子量计算得到的离子的质量数。
相对丰度：原始质谱图上最强的离子峰为基峰，100%。其它离子峰与此基峰的相对百分值表示。
分子离子: 样品分子丢失一个外层价电子而形成的 带正电荷的离子，称为分子离子,记为M.+。
准分子离子: 通常指分子离子获得一个质子或失去一个质子产生的离子，如(M+H)+、(M-H)+。
碎片离子: 分子离子的化学键断裂失去一个自由基或中性分子产生的离子。
重排离子: 分子离子裂解过程中伴随着分子内原子或基团的重排所形成的特殊碎片离子。
同位素离子: 元素具有非单一的同位素组成时，由同位素所组成的离子蜂。
多电荷离子: 样品分子丢失两个或两个以上的电子而形成的的离子。
（2）分子离子的判定依据
A. 不考虑同位素的影响，分子离子是谱图中质量数最高的离子；
B. 必须是奇电子离子、符合氮规则；
奇电子离子：带奇数个电子的离子
氮规则：一般有机化合物的分子量为偶数，只有分子中含有奇数氮时分子量才是奇数，这一规律称为氮规则。
C. 与相邻的碎片离子间的质量数差合理。
由C，H，O 组成的有机化合物，M 一定是偶数。
由C，H，O，N 组成的有机化合物，N 奇数，M 奇数。
由C，H，O，N 组成的有机化合物，N 偶数，M 偶数
原因： C、O、S等元素具有偶数质量和偶数化合价，H、Cl、P等元素具有奇数质量和奇数化合价，只有N例外具有偶数质量和奇数化合价
（3）同位素离子峰：除少数元素外,大多数元素具有天然存在的稳定同位素，所以在质谱图上出现一些M+1，M+2的峰，由这些同位素形成的离子峰称为同位素离子峰。

同位素离子峰的强度
由于各种元素同位素的天然丰度不同，它们形成的同位素峰的强度也不相同;此外同位素峰的强度不仅与重同位素天然丰度有关，还与分子所含元素的数目有关。
1）只含C、H、O、N化合物: 只含C、H、O、N元素的化合物中，它们的重同位素的丰度都较小，
同位素峰很弱。
同位素离子峰簇分子离子峰M与由重同位素贡献的M+1、M+2峰构成同位素离子峰簇。同理,准分子离子以及碎片离子也存在同位素离子峰簇。
2）含Cl、Br和S化合物:
A+2元素,同位素丰度大,M+2峰明显
35Cl／37Cl=100／32.5；
79Br／81Br=100／98；
32S／34S=100／4.42

在质谱图中若M与M+2峰的相对丰度比为3:1，那么可判断此化合物含一个Cl原子；若M与M+2峰的相对丰度比约等于1:1，则可判断此化合物含一个Br原子。对于含两个卤素原子(2个Cl或2个Br或l个Cl、1个Br)，在质谱图中除了M+2峰外还有M+4峰。当含三个卤原子时会出现 M+2、M+4、M+6的同位素峰。
（4）ESI-MS谱图的解析
A. 判断高m/z区域的质谱峰是否为准分子离子峰。若为准分子离子，则可由对应的m/z值推算化合物的相对分子质量
由预期合成的化合物的相对分子质量推测
小分子有机化合物:
ESI(+): 可形成(M+H)+、(M+NH4)+、
(M+Na)+、(M+K)+型准分子离子
ESI(-): 可形成(M-H)-、(M+Cl)-、(M+Br)-、
(M+Ac)-
与化合物的合成条件以及所含有的基团有关
如ESI(+)出现(M+H)+谱峰,则可由m/z-1.01 计算出化合物的相对分子质量
有机聚合物以及生物大分子
ESI谱图中一般出现正负多电荷离子
(M+nH)n+或 (M-nH)n-的质谱蜂可利用三种方法求算大分子化合物的相对分子质量：
联立方程求算法；
分辨同位素峰法；
据转换法（去卷积拆分）法
单核或多核配合物
若含有抗衡阴离子X-
ESI(+): 有可能形成(M-X)+型离子
若含有L-阴离子配体
ESI(+): 有可能形成(M-L)+型离子
ESI(-): 有可能形成(M+L)-型离子
多核配合物也可能形成多电荷离子
可由同位素峰簇中相邻谱峰m/z差值判断：
m/z值相差约１时，其为一价离子；
m/z值相差约０.５时，其为二价离子；
m/z值相差约０.３３时，其为三价离子．
注：尽管不一定能够得到配合物的准确分子质量，但仍可判断配位主体（内界）是否形成
配位聚合物
从ESI谱图中只能找出碎片离子峰
注：可由碎片离子组合成完整的聚合物分子
注意：高m/z区域也可能出现对应于(nM+H)+或(nM-H)-的加和物或簇合物离子峰
（可由预期合成的小分子化合物的分子量判断，一般为分子量的倍数+1或-1）
B. 由同位素峰丰度比推断小分子有机化合物的分子式
根据同位素的峰强度比，可查Beynon（贝农）表或通过计算机检索得到分子式
注：Beynon表仅列出含C、H、O、N化合物的同位素峰强度比。故利用Beynon表推测分子式时应首先扣除S、Cl、Br等A+2元素对M+1、M+2同位素峰丰度的贡献。
化合物是否含有S、Cl、Br等元素可由M+2/M的丰度比判断(ESI谱图中可由M+H+2/M+H的丰度比判断)
若M+2/M>4.40%，则化合物中可能含有一个或以上的S原子
CwHXNYSZ
若M+2/M >32.5%，则化合物中有可能含有一个Cl
原子
若M+2/M ≈1，则化合物中有可能含有一个Br原子

此时同位素离子峰的强度之比，可以用二项式展开
式各项之比来表示：
(a+b)n　　
式中：　　
a-某元素轻同位素的丰度
b-某元素重同位素的丰度
n-同位素个数

大多数金属元素都存在两个或两个以上的同位素，且同位素的天然丰度比较强，故
对于单核或多核配合物，我们可以利用同位素峰的丰度比判断最高质量数的离子是否含有金属离子以
及含有几个金属离子
对于配位聚合物，我们则可以利用同位素峰的丰度比判断电离后得到的碎片离子是否含有金属离子
Zn m/z: 63.93 (100.0%), 65.93 (57.4%), 67.92 (38.6%),
66.93 (8.4%), 69.93 (1.3%)
C. 计算化合物的不饱和度(环加双键值)