_胰凝乳蛋白酶在胍溶液中的变性_失活_复性_复活.pdf

笼马卷1989浇1期年3月生物物 理学报ACT ABIO PHY S ICAS IN ICA一01。马N。、丁ar.1989a一胰凝乳蛋白酶在服溶液中的变性、失活、复性、复活姜淑 仙练永 宁(中国科学院生物物理研究所)摘要前已报导,在眠 或呱的作用下,叭酸激酶失活速度远快于酶分子整体构象变化的速度。本文报导又用在 变性剂存在下研究底物反应的方法对分子较小,由单亚基组成,件有五个二 硫键使分子结构更加稳定 的胰凝乳蛋白酶,在盐酸呱作用下的变性,失活以及相应的复性,复活进行动力学的比较。结果表明失活仍快于构象变化速度,复活慢于构 象的恢复速度。实验结果还表明已经充分复活的酶和未经变性的酶在片浪巾的构 象存在着某些差 别.引言利用变性剂有控制 地改 变酶蛋白在溶液 中 的构 象,从 而研 究其 相应的生物功 能变化,是研究酶结构和功能关系的重要方法。过 去,研究构象变 化过 程 中酶活性 的变化系采用定时取样逐个测定的方法。这 不仅工作量大而且对于活性 变化快的过 程根本无法应用。妇是根据邹承鲁等仁;2所建立 的,在变性剂或 抑制剂存在下底 物 反应的动力学 分析,使得活性变化的快过程的测定成为可能。用 这种方法,测定了在脉或肌的作用 下,肌酸激酶的失活速度,发 现它远快于酶分子整体构象变化速度忍i”。丧 明肌酸激酶 的活性部 位刘一变性剂的作用 十分 敏感、活性 部位可能处于表面 或接近分子 表面 的位置。肌酸激酶是 由两个分子量 为4 2K的亚基组成的大 分 子。因此,对于那些分 子量小,结构更稳定的蛋 白分子,在 变性剂作用下构象变化 与活力变化的规律的研究将是很有意义的。本文即是 对具有5个 二硫键使结构稳定的单亚基 小 酶分子一a一胰凝 乳蛋白酶,在肌作用 下构象变化与活力变化的比较研究。结果说明其失活速度仍显著快于酶分子构象变化速度,而变性了 的该酶分 子经稀释复活时其复活速度又慢于构象恢复速 度。材料和方法一、酶和 试剂结晶胰凝 乳蛋白酶,a一Ch ymotry Psi n),电泳 纯,苯 甲酞一L一酪 氦酸乙醋(Be nzoy卜L-tyro sioeethyleste r,B T EE和乙酞一L一酪氨酸乙醋(Aeetyl一L一,)rosineethyle ste r,A T E E),第1期a一胰凝乳蛋白酶在肌溶浓中的变性、失活、复性、复活1。试剂纯,均为上 海 东风 生化试剂厂产 品。盐酸肌(Gua nid inel i,droelilo ride),分 析 纯.北 京化工厂产品,使用前按No z ak i名法 重结 晶两次,其6M水溶液,在2 20 nm处 的光吸收小于0。l。其它试剂均为 国产 品,分析纯。实验用水为玻璃 重蒸馏 水。二、方法a一胰凝乳蛋白酶浓度 由2 80 nm处光吸收 测定,E,=2 1.5。紫外光谱测定在vari anc ary21 9紫外分光度计上 进行。使用了自动搅拌装备可 测定慢速反应(秒级)。差 光谱测定法见文献3。快速反应是在D ion exD一11 5停流装置 上测 定。为了保证高浓 度 时反应体系 的 混合均匀,采用了多道混合装置。有 关 实验操作见正文。全部实验 都是 在2 5下进行。数据处理方法及Gu gge nh ei m作图法见文献3。结果和讨论一、胰 凝乳蛋 白酶变性时所用变性剂服和盐酸 肌 的比较,睬和盐酸脏是使用最 多的变性 剂。Marti n等“,曾对a一胰凝 乳蛋酶在脉变性 时的构象变化进行过 仔 细的研究,但对 其活力变化 研究得少。由于肌变性速度快、他们使 用的方法根本不 可能 测定快的活性变化过程。但就构象变化与活 力变化的比较研 究而 言,肌作为变性 剂有其 优越性。与服相比,较低浓度的肌就可使a一胰凝 乳蛋 白酶构象发生 很大 的变化,活 力完全丧 失。从图1可见当肌浓度为2.5 M时酶就 完全 失活,而孤浓 度在。.3 M时酶 的活力几 乎没有变 化。因此2.5M孤失F19.1.Thea erivitie sofa一ehymotrypsiningu anidines olutio n oofdiffer ente o nce n-trations.T heenzymesolutio nswe r eineu-batedwithgu a nidiniumh ydr oeb lo ridefor2 0minsbefor edetermin ationoftheaetivi-ty.Enzeymceonentration:1.25xl0一5M.入 Ipho sPhate0.1buf fer,PH.6.5。任卜%口口叫,刊u无。,Tp已T。岛123丁hee on C e ntr atio nofGa一nel活的a一胰凝乳蛋白酶十倍稀释后,肛的浓度降至o.2 5M,酶的活力就有可能 恢复。作者实验证明,在酶浓度10“”1 0日M范围内,PH6.5(远低于酶的最适PH)上述 稀释过程,酌的活 力几乎完全恢复(一9 5%)。作者 曾试图使用脉作变性剂 进行 研究,实验表明使a一胰凝乳蛋白酶失活需较高的脉浓度(6M),失活速度慢,稀释(即便使脉浓度降至o.3 M以下),酶活性的恢复程度很低(最高为6 5%)所以脉不适于构象与活力变化的对比研究。当然这样仅指a一胰凝乳蛋白酶情形。变性作用的快慢与复活过程 中活力恢复程度大体上 是相关1 4生物物理学报198 9 年的。作者认 为这可以从蛋白质水解酶的自溶 作用得到解 释,变性快、自挤少,因而恢 复时程度就高。二、口一胰凝乳蛋 白酶的肌变性差光谱。4M肌溶 液中的变性差光谱(图2),它和入I a-rtinL6Glazer和S mith7,和 报导的脉变性差光谱图非常相 似。分 别 在2 92、2 84和23 1nm处出现三个负峰。构象变化的监 测是在分光光度计上进行,分 别 测定了变性时不 同波长的光吸收变化。图3给出了波长2 92nm处光吸收的变 化。按Gu gg enh eim作图法 进行数 据 处理(图4),变性过程是连续的两个一级反应,速率 常数 分别 为。.19 2,0.09 6:ec一。在28 4nm和23 Inm波长 测得结果相似(表I)。三个波 长 处光吸收变化是 同步 的,是相同的两个连续的一级过程。u,1俐山 0”q亡c!o 们刀23 C2二2 90310n mF19.2T hedenatu rationdif fer entalsP-ectr aofa一ch ymotryPsinin4M.gu anid inesolution.Enzymeconcentr ation:1.25Xl o一6M.Pho sPhatebuffe rpH.6.5F19.3RatoofU、一ab*orbanc e(2q2nm.)ehangeofdenatu rationofa-chymotryPsiningu a nidines olution.Enzymeleo neentratio n.1.25Xz o一M,gua nidiniumh ydro chloridec o ncen-tr atio n:4M.,0.1M.PhosPhatebuf-fe r,PH.6.5T hemethodewasde seribedintext.三、a一胰 凝乳 蛋 白酶变性过程 中的活力变 化。a一胰凝 乳 蛋白酶的呱变 性是 一个快过程,传统的定 时取样法不能应 用。我们采用在变性剂存在下追踪底物反应的方法,当然这是以变性剂除与酶之外不与其它物质发生作用 为前提。反应是在停流装置上进行,为了保证粘度较高的反应体系的完全均 匀混 合,采用了多道 混合,使含有底物的肌溶液与 酶在极短时间内(5 0ms)两 次强 烈混合。为 了提高测活灵敏度 采用以A TE E为底物,测 定H+产生速度的方法。在极稀的缓冲溶液 中以苯 酚红为指示剂监 测59 Onm光吸收变化。结果 如图5 o按Gug gen heim作图法处理(图6)表明失活过程仍是两 个连续的一级 过程。速率常数 分别为1.3 5,0.52s e。“。它比相应的构象变化速度快(表I)。构象变化与活力 变化的两 相性质说明变性失活过程中有中间态存在。四、孤变性的a一胰凝 乳蛋白酶的稀释复性。在pH6.54M肌变性完全 失活的胰凝 乳蛋第1期a一胰凝乳蛋白酶在肌溶液中的变性、失活、复性、复活l53224uoT别自o 的户一口8 6自.户尹p记一“一别吮,止.成,厅OT,石了2,3 CT主叮 己so c)叩工me(s 性 e)F19.4T heGuggenheimPlotofF ig.3F19.5T hecha ngeofaetivitiesofa一chymotryPsinin4M.gu.nidinesolutio ns.Referen ce:nogua nidiniumhydro c五10 rideSa.Ple:4M.gu a nidi-niumh ydr o cblorideTab lel。T herateeonsta ntsin4M.guanidineofden aturationofa一ehymotrvPsin50utio n.卫3 Inm2 84nm292nmKl(se c一,0.1 940.1750.1 92K:(see一,)0.1030.1020.09 6入0 2e e生公u C 州小几因一记山U c,已J一曰口-5才勺!v.乙,。T23丁二即e【see2302 5 02,02,0310“a v巴le n勺th”m)F 19.6ehangePslnInT heGug genheimPlotoftheofa etivitiesofa一chymotry-4M.gu a nidioes olutio n.F19.7There n.tu r ationdiffe r entaloPe e-tr aof gua nid ineden atu r eda一ehymotryp,in.Enzymeco n centariont:1.25x10一M.0.1M.P ho.Phatebuffe r,PH6.516生物物理学报1989年/ll.rl!iu 0 T习z叫0”门月自。11!i2。5 010护A 211】之J2 4叮主m、与。二。如乙,份甲一六,一吮r一爪-一es 二勺下1汗 e15 e了)乡510V犷TheGuggenheimPlotof2 31nmeha ngeofabsorba n eeF19.9T her ee o veryoftheaetivityofguan-idinedenatu r eda一eh yz notrysin.10产1l.25xlo一M.gu aoid inede natu r eda一ehy-motryPsinwasad dedto1z nl.3mMBAEE,0.1M.Pho sPhatebuffe rs olution.口OeF it ha tTab leZT herateguanid ineeonsta ntsofther e aeti丫 ationofdenatu r eda一eh ymotryPsin.23 1,m2 8 4nm2 9 2口m,ee一 工0.09 9400986K:(see 一)2.49 7X10一,日酶 十倍稀释后 活力几 乎完全恢复、图7为其复性差光谱。图谱 与变性差光 谱 相对 应f:l有提别。292、2 8 4和2 31nm处很快出现正峰,达到稳定,但此 后在2 31n n、处尚有一反 方向 的慢过 程继续变化,这个慢过程4 0分钟后结束,23I nm处形成了稳定的负峰。这个慢 过程 的Gug genh eim作图为 图8。说明这个慢过程也是一 个一级过程,k=2.5xlo“se。一。复性过 程中的快过程 经用停流法,以9:1注射器混合分 别测 定了2 9 2、28 4和231nm波长的光吸收变化,计算结果总结在表l。三个波长测 出的快过程是 同步的一级反应,可能就是同一变化。有关蛋 白质 差光 谱各特 征 吸收峰 的性质已经进行许多 研究;。:3。变性差光谱 中负峰 的形成 是变性作用使发色团环境的极性增强的原因。29 2、2 8 4nm光吸收主 要分别是 色氨酸、酪氨酸残基的贡献、对2 31 nm处的光吸收、正如G la z ert”所指出,因素比较复杂除和色氨酸、酪氨酸有 关外,从链的构象起着更 重要的作用”t吕,。在我们所研 究的这种情况、23 1nm处光吸收的慢变化是发生在对色氨酸、酉各氨酸残基最 为敏感的29 2、2 8 4nm光吸收已经稳 定而 不再变化时发生的,因而只能解释 为肤链构象变化的原 因。注意到此 时活性早已恢复全光谱 的 事实说明复活 的酶 与天然 酶在肤链构象上存在着差 别。、Ia rtin,scher aga二研究 卵清蛋白、核糖核酸酶的变性、复性 差光谱时也 发现类似现象旧 但他 们并未注意到活性的问题,sc卜er oga指出这个 吸收根源 在肤链的构象与分 子的a一螺旋、无规卷曲结钩 J 关,“:。第1期。一脾凝乳蛋白酶在肌溶液中的变性、失活、复性、复活1 7五、肌变性a一胰凝 乳蛋自酶的稀释复性 复活过程是一个不太快的过 程。我 们 用 含底物B A EE的缓冲 液稀释4M肌溶 液处理的失活酶、检测256 nm光 吸收 变化(图9)。过程曲线与含有活化剂的酶反应体系相似”。过程可写成:1jw el|;习刁共j八。尸.1,_.、凸u”2se=。Ll一,二-一气1一e.夕JA式 中A、B为常数、t为时 间、过程 中的酶 活 力a为:a=B(l一e一A,)由剩佘活 力与时 间关系(图10)知活力恢复为 一级反应,k=1.8xl o一Zsee一。复活 的半寿期3 9,ee。六、a一胰凝乳蛋白酶在孤溶液中变性、失活、复性、复活的比较,本文的动 力学结果 总结如表I、叮见与肌酸激酶等较大 蛋 白分子相比,分 子较小,仅 由一个肤链构成而且有五个二流键使分子构象更加稳定的a一胰凝乳蛋白酶,在盐酸孤 的作用下 失、二,下:;F19.1 0T heGug genheimPlotofF ig.9.Tab le3.Ae omPa risonofr atee onstantsofdenaturation,ina etivatio nre natur atio nandre aetiv ationofa一ch ymotryPsinandgua nidinede natu reda一chymotry Psin复性复活变性失活_l_一-一-Kl(s e e一,)0.11。SXIO一,K:(sec 一2.5X10一3一一一.一一l0.100.52.仅在2 31 nm处有变化活速 度快于变 性速 度、活力恢复速 度慢于构象恢复速 度。表 明活性部位是 处于对肌作用较为敏感 部 位,当然,实验中复活的测定是在底物存在下进行的、底物的存在是否加速了复活 过程?但 即便加快了复活速 度它仍慢于构象恢复,所以并不影响复活慢于复性的总趋势。应 当提 到,复活的酶与天然酶 从复性差光谱上观察到构象的差别,说明尽管酶的活性已恢复了但构象仍有所不 同,这是一 个很有意义 的问题。我们已经用拉曼光谱进 行 了分析,并将在 另文中报告这个结果。今考文献lTi:n.从尸.x:B1oohem.21(一9 52),1 025一1032Iaid ler,K.Jr endonPre es,ndTso u,C.L&Bunting,P.5ehemiealKio etiesofEnz,meAetio n,Znded.,eha 一oxford3姚 启智等:4二No艺aki.Y中国科学Metbod弓in(1973)p pl下 5一xsoB辑,10(10 5 2),59 2一5 9 7Enzymol二(E d.Colowiek5.p.andK皿P lan,N.o,、.Acad.pr es s,本文于19 87年1 0月4日收到l8生物物理学报19 59年Ne,York,26(一。72),43.5丫ao,Q.2.Tia uM.andTsou,c.L.:Bioe五em,6M一 rtin,C.:J.Bioe五em。3,1 1(1 9 64),16 3 5了G l一 eer,A。N一ndSm ith,E.L.:J.Biol.ehem.8Rose nhe ek,K.,一ndDory.R.:proe,N.tl,Ae 一d23(19 8 4),2 了4。23 6Sei.(一。6一),2 94 2.U.S.A二4了(196一),一了了5.DE N A TU R ATIO N,IN A CT IVA T ION,RENA T U R A TIONA NDR EA CT IV ATIO NOFa一CHYMOYRT P SININGUANID INESOL U TIO NSJiangS huXianLianYo ngN ing(InstituteofBioPhysies.Ae ademiaS”fea)Abstr a et:Ine arlierstuaie sitwasshownthatinguanidiumehlo rideur e asolutions,raPidinaetiv ationofe r eatinekin as eoee ursbefo rea nysignifi-e ante omformationalehange s,Suehstud ie sr elatingtheehangeina ctivitywi-theomfo rmatio nalehangeofthee nzy mear eofPa rtic ula rinte r e stintheofsmall mo nome rieenzymesstabiliz edbymultiPled is ulfidebondsInthiswo rkwePr es entae omParisonofther atesofe omfo rmatio naleha-ngeswiththo s eofinaetivationofehymotry Psininguanidini一lmeh lo rides olu-tio n.InthefirstPa rtofthisstudytheina etiv ationofehymotry Psiningua-n1din es olutionwasfollowedbysubstr atereaetio ninthePr e*eneeofdenatura ntinastoPPedflowaPPar atu s.Re sultssllowthatther ateofinaetivation15:19-n1fie antlyfa sterthanthatoftheu nfoldingoftheenzy r nemole eule,andthatther ateofr e aetiv atio nofgu anidinede natu r edch ymotryPsini;slowerthanthatofrefoldingofthee nzymemoleeule.Finallye om Pa ris onofthesPeetr aofnative,fu lyactiv echymotryPsinandofthereactivatedenzymeshowsthatther ear ed iffer en e esintheeo功fo rmationsofthes emole e ules。