miRNA-34a-5p靶向Fut8抑制巨噬源性泡沫细胞的运动能力.pdf

医学分子生物学杂志,2023,20(5):411-416 J Med Mol Biol,2023,20(5):411-416DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2023.05.006资助项目:中山市第三批社会公益与基础研究专项(No.2020B3004)通讯作者:陈林木(电话:[phone],Email:89638806 )This work was supported by a grant from the Third Batch of Research Pro-ject for the Social Welfare and Basic Science in Zhongshan(No.2020B3004)Corresponding author:CHEN Linmu(Tel:[phone],E-mail:89638806 )miRNA-34a-5p 靶向 Fut8 抑制巨噬源性泡沫细胞的运动能力黄云秀1,陈林木2中山市人民医院1检验医学中心,2临床药学科 广东省中山市,528403【摘要】目的 探讨 miRNA-34a-5p/岩藻糖基转移酶 8(fucosyltransferase,Fut8)轴对巨噬源性泡沫细胞运动能力的影响。方法 首先利用生物信息学和 RT-PCR 寻找并检测 Fut8 基因上游的调控 miRNA 变化情况;其次利用 Pearson 相关性分析观察斑块组患者血清中 Fut8 和 miRNA 的相关性;最后构建泡沫细胞模型观察 miRNA 对泡沫细胞运动能力的影响并明确 Fut8 在其中的重要作用。结果miRNA-34a-5p 和 miRNA-449b-5p 在斑块组患者血清中均显著上升,但 miRNA-34a-5p 与 Fut8 有更大的相关性。miRNA-34a-5p 在泡沫细胞形成时含量显著升高,抑制 miRNA-34a-5p 表达会促进 Fut8 的表达。高表达的 miRNA-34a-5p 会导致穿透到下室的细胞数量减少。过表达 Fut8 预处理细胞,会增加穿透到下室的细胞数量。结论 miRNA-34a-5p为 Fut8 的上游 miRNA 之一,通过下调 Fut8 表达而抑制巨噬源性泡沫细胞运动能力。【关键词】miRNA-34a-5p;miRNA-449b-5p;Fut8;泡沫细胞;运动能力【中图分类号】R543.5Effect of miRNA-34a-5p on Cell Mobility of Macrophage-derivedFoam Cells by Targeting Fut8HUANG Yunxiu1,CHEN Linmu21Department of Laboratory Medicine,2Department of Clinical Pharmacy,Zhongshan Peoples Hospi-tal,Zhongshan,Guangdong,528403,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of miRNA-34a-5p/fucosyltransferase(Fut8)axis on the mobility of macrophage-derived foam cells.MethodsFirstly,bioinformatics and RT-PCR were used to find and detect the upstream regulatory miRNA of Fut8 gene.Secondly,the cor-relation between levels of Fut8 and miRNA in serum of the patients with plaque was observed byPearson correlation analysis.Finally,the in vitro model of foam cell was used to observe the effect ofmiRNA on cell mobility and the important role Fut8 played in.ResultsBoth miRNA-34a-5p andmiRNA-449b-5p were significantly increased in serum of patients with plaque,but miRNA-34a-5phad a stronger correlation with Fut8.The expression level of miRNA-34a-5p was significantly in-creased during foam cell formation,and inhibition of miRNA-34a-5p increased the expression levelof Fut8.Overexpression of miRNA-34a-5p led to a decrease in the number of cells penetrated intothe lower compartment of the transwell chamber.The number of cells penetrated into the lower com-partment was increased after the overexpression of Fut8 in cells.ConclusionAs one of the up-stream miRNAs of Fut8,miRNA-34a-5p inhibits the mobility of macrophage-derived foam cells bydown-regulation of Fut8.【Key words】miRNA-34a-5p;miRNA-449b-5p;Fut8;foam cells;mobility 心脑血管疾病是世界范围内引起疾病和死亡的重要原因之一,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块的形成是心脑血管病的主要发病基础1-2。大量脂质堆积在大、中动脉的血管内膜下,诱发慢性炎症是 AS 的特征性病变3。巨噬细胞来源的泡沫细胞在 AS 的发生发展过程中发挥着重要作用4-5,AS 形成的关键节点之一就是进入内膜下的泡沫细胞滞留在斑块内6。以往文献研究显示内膜下的泡沫细胞离开斑块的能力会明显减弱7。过多的泡沫细胞聚集在内膜下会致使炎症状态加剧,诱发脂质核心在斑块内形成,这是导致已形成的斑块在治疗时难以消退的重要原因之一8。蛋白质糖基化修饰是在糖基转移酶的控制下,蛋白质在高尔基体或者内质网中附加上糖链的过程,是一种重要的翻译后修饰9。包括 N-糖基化修饰和 O-糖基化修饰两种主要修饰类型10。本课题组长期关注蛋白质糖基化修饰对 AS 发生发展的影响。前期研究发现作为氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein,ox-LDL)的重要生物活性成分之 一 的 溶 血 磷 脂 酸(lysobisphosphatidic acids,LPA),200 mol/L 处理巨噬细胞 24 h 能够导致巨噬细胞转化为泡沫细胞11,并且其运动能力会明显下降。我们观察到在泡沫细胞形成过程中岩藻糖基转移酶 8(fucosyltransferases 8,Fut8)和对应的1,6-岩藻糖基化修饰(又称为核心岩藻糖基化修饰)水平明显降低12。Fut8 表达下降后,下游的局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)磷酸化减少,F-肌动蛋白的多聚受到抑制从而导致其运动能力受损13。而过表达 Fut8 后泡沫细胞的运动能力得到明显恢复12,提示 Fut8 是影响泡沫细胞运动能力的重要因素,但是 Fut8 表达下降的原因尚不明确。miRNA 主要由 RNA 聚合酶转录及加工而产生,通过调控蛋白质生物合成而发挥作用的一类重要非编码 RNA14。在以往有关肿瘤的研究中证实Fut8 受多个 miRNA 的调节。microRNA-198-5p 通过靶向 Fut8 抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭15。通过 microRNA 微阵列,Cheng 等16发现Fut8 为 miR-26a、miR-34a 和 miR-146a 靶向基因之一。荧光素酶报告基因分析表明这些 miRNA 与Fut8 的 3UTR 特异性相互作用,随后下调 Fut8 表达水平。这些 miRNA 的强制过表达能够诱导 Fut8水平的降低,从而抑制肝细胞癌进展。Wang 等17发现 miR-198 通过直接靶向 Fut8 来抑制结直肠癌的增殖和侵袭。上述研究提示 miRNA 是 Fut8 基因表达的重要调节因子。虽然 miRNA 可以通过影响AS 发展的多个步骤来影响 AS 的发生、发展及预后,如调节血管内皮细胞的凋亡、增殖、衰老以及炎性反应等过程18-20。但是在 AS 疾病中尚未见报道 miRNA 与 Fut8 之间的调节关系,因此本文基于Fut8 对泡沫细胞运动能力具有重要影响的基础上,寻找 Fut8 基因上游的 miRNA,并明确 miRNA/Fut8轴对巨噬源性泡沫细胞运动能力的影响。1 材料与方法1.1 临床样本收集收集 2021 年 1 月至 2021 年 6 月在中山市人民医院诊断为颈部 AS 患者(斑块组)和同期体检健康者(对照组)的外周血。所有斑块组患者经颈动脉 B 超检查,均为初次确诊患者,未接受降脂、降糖、抗血小板等治疗;健康志愿者为我院体检患者,均经颈动脉 B 超检查排除颈动脉病变。斑块组共 57 例,包括男性 36 例,女性 21 例,平均年龄为(44.5 14.1)岁;对照组共 46 例,包括男性 30 例,女性 16 例,平均年龄(42.7 10.8)岁。斑块组与对照组一般资料的比较无统计学差异(P0.05)。1.2 细胞来源THP-1 单核细胞购自 ATCC 公司,参照以往文献21利用佛波酯刺激转化为巨噬细胞。用含 10%胎牛血清(FBS)的1640 培养基于5%CO2、37 的恒温培养箱中培养。1.3 RT-PCRmiRNA 采取 miRNA 提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,R2210)进行提取,普通 mRNA 使用 Trizol 法进行提取。使用反转录试剂盒(TaKa-Ra)进行 miRNA 和 mRNA 的反转录,使用扩增试剂盒进行 RT-PCR 扩增后对 miRNA 和 mRNA 的表达情况进行检测。引物序列参考前期研究文章12,如下:Fut8 上 游 引 物 5-CTGGTTCCTGGCGTTG-GATT-3,下 游 引 物5-CTCAGCCATTCGCCT-CAAGT-3;miRNA-34a-5p 上 游 引 物 5-CCCA-CATTTCCTTCTTATCAACAG-3,下 游 引 物 5-TG-GCAGTGTCTTAGCTGGTTGTG-3;miRNA-449b-5p上游引物 5-GGGAGGCAGTGTATTGTTA-3,下游引物 5-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3;Gapdh 上游引物5-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3,下游引物 5-GCCATCACGCCACAGTTTC-3。1.4 ELISA参照 Fut8 ELISA 检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司,#JL47884)说明书进行,主要步骤如下:标准品的稀释与加样,温育,配液,洗涤,加酶,再温育,再洗涤,37 避光显色 15 min,终止,最后以空白调零,450 nm 波长依序测量各孔的吸光度值(A 值)。1.5 双荧光素酶实验参照以往文献22进行试验,主要步骤如下:214黄云秀,等.miRNA-34a-5p 靶向 Fut8 抑制巨噬源性泡沫细胞的运动能力对 Fut8 3UTR 片段进行 RT-PCR 扩增,采用 psi-CHECKTM-2 载体,将获得的 Fut8 3 UTR 片 段(Fut8 3UTR-wt)定向克隆到海肾荧光素酶开放阅读框的下游。Target Scan 在线软件预测 miR-34a-5p与 Fut8 结 合 序 列。采 用 Multisite-Quickchange(Strata-gene 公司)技术,将预测到的 miR-34a-5p与 Fut8 的 3UTR 结合位点进行定点突变,构建突变载体(Fut8 3UTR-mut)。将突变型报告基因表达质粒或野生型质粒与 miR-34a-5p 共同转染 293T细胞,并分别转染阴性对照模拟物(NC mimic)。Dual-Glo 萤光素酶测定系统(Promega 公司)用来测量萤光素酶活性,同时通过标准化将海肾荧光素酶活性值转化为相应的萤火虫荧光素酶活性值。1.6 蛋白质印迹法(Western blotting)分析参考前期文章12,主要步骤如下:利用 RIPA裂解液提取细胞总蛋白,BCA 法进行蛋白定量。等量上样,上层胶电泳 80 V 恒压约 30 min,下层胶电泳 120 V 恒压约 60 min。采用湿法恒流转膜,电流保持 250 mA。转膜完成后,将膜放入相应一抗孵育液,在4 冰箱中孵育过夜。在磷酸缓冲液(PBST)清洗孵育膜后,添加相应二抗孵育 1 h。TBST 清洗 5 min,重复 3 次。设置化学发光仪合适的曝光时间,出现明显条带后停止曝光。使用 Im-age J 软件对曝光图片灰度值进行统计分析。1.7 Transwell 实验等待巨噬细胞生长到对数期,使用 0.25%胰酶对细胞进行消化和重悬,计算数量后备用。将Transwell 小室置于 24 孔板内,每个孔内加入包含10 万个巨噬细胞的培养液,给予 50 g/mL ox-LDL刺激 24 h 构建泡沫细胞模型,弃培养液后再加入无血清培养液 500 L。上室加入相应的处理物质,Transwell 小室下室中添加 500 L 的 1640 培养基(含 10%FBS)作为泡沫细胞运动的趋化动力,放置时间为 24 h。实验完成后取出 Transwell 小室,利用棉签轻轻擦除上室中的细胞,室温下利用4%多聚甲醛浸泡下室的细胞10 min,从多聚甲醛取出后,自然风干 10 min。加入 0.1%结晶紫染色液200 L/孔对细胞进行染色,时间约为 10 min。PBS 对细胞进行清洗 3 遍,树脂封片后在正置显微镜下观察并且拍照。1.8 统计学处理使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析,两样本数据符合正态分布的数据采用独立样本t 检验,非正态分布数据采用非参数检验。多个样本均数的比较采用 one-way ANOVA 分析。P0.05判断处理组间差异具有统计学意义。所有数据均为3 次以上重复实验的结果,数据用平均数 标准差(x s)表示。2 结果2.1 miR-449b-5p 和 miR-34a-5p 在斑块组中表达显著升高为了寻找 Fut8 基因上游的 miRNA,首先利用多个生物信息学网站预测可能存在结合的 miRNA。如图1A 所示,同时存在 miRDB(136 个)、TargetScan(5个)和 miRTarget(16 个)数据库的 miRNA 为 miR-449b-5p 和miR-34a-5p。进一步通过RT-PCR 实验发现斑块组患者血清中 miR-449b-5p(图1B)和 miR-34a-5p(图1C)均较对照组有明显升高。A:TargetScan、miRDB 和 miRTarget 数据库预测结果合集;B:RT-PCR 检测斑块组和对照组血清中 miR-449b-5p的表达情况;C:RT-PCR 检测斑块组和对照组血清中 miR-34a-5p 的表达情况。与对照组比较,P0.05图 1 Fut8 基因上游 miRNA 预测及检测2.2 斑块组病人血清中 miR-34a-5p 与 Fut8 表达之间具有明显的负相关性 以往细胞实验证实泡沫细胞形成时 Fut8 的表达明显下调,因此进一步检测了临床患者血清样本中的 Fut8 表达情况。ELISA 实验结果显示 Fut8 水平在斑块组 (17.64 5.12)ng/mL 中的表达较对照组 (24.02 6.69)ng/mL 明显下降(图 2A)。Pearson 相关性分析显示 Fut8 与 miR-34a-5p 呈明显的负相关(图 2B),Fut8 与 miR-449b-5p 也呈明显的负相关(图 2C),但是 miR-314医学分子生物学杂志,2023,20(5):411-416 J Med Mol Biol,2023,20(5):411-41634a-5p 与 Fut8 的相关性更强。因此后续重点关注miR-34a-5p 对 Fut8 的影响。A:ELISA 实验检测 Fut8 在斑块组和对照组病人血清中的表达情况;B:Fut8 与 miR-34a-5p 之间的相关性分析;C:Fut8 与 miR-449b-5p 之间的相关性分析。与对照组比较,P0.05图 2 miRNA 与 Fut8 表达之间的相关性分析2.3 miR-34a-5p 减弱泡沫细胞运动能力内膜下的巨噬细胞通过吞噬 ox-LDL 向泡沫细胞转化。研究发现 ox-LDL 处理巨噬细胞 24 h,随着浓度的增加,miR-34a-5p 的表达明显上调(图3A)。但在 200 g/mL 时其表达量下降,可能与高浓度 ox-LDL 的细胞毒性有关。50 g/mL 的 ox-LDL处理巨噬细胞,随着时间的增加,miR-34a-5p 的表达明显上调(图 3B)。通过 RT-PCR 分别验证了miR-34a-5p inhibitor(图 3C)和 miR-34a-5p mimic(图 3D)的效果。通过 Transwell 实验发现添加miR-34a-5p inhibitor 后,迁移到下室的细胞数量较对照组明显增多(图 3E),而添加 miR-34a-5pmimic 后,迁移到下室的细胞数量较对照组明显减少(图 3F)。A:RT-PCR 检测浓度梯度的 ox-LDL 刺激巨噬细胞 24 h 时 miR-34a-5p 的表达情况(n=3);B:RT-PCR 检测 50g/mL 的 ox-LDL 时间梯度刺激巨噬细胞时 miR-34a-5p 的表达情况(n=3);C:RT-PCR 验证 miR-34a-5p inhibitor的效果(n=3);D:RT-PCR 验证 miR-34a-5p mimic 的效果(n=3);E:Transwell 实验检测添加 miR-34a-5p in-hibitor 后细胞迁移情况(n=3)(400);F:Transwell 实验检测添加 miR-34a-5p mimic 后细胞迁移情况(n=3)(400)。P0.05图 3 miR-34a-5p 对泡沫细胞运动能力的影响414黄云秀,等.miRNA-34a-5p 靶向 Fut8 抑制巨噬源性泡沫细胞的运动能力2.4 Fut8 与 miR-34a-5p 之间的相互作用生物信息学预测显示 Fut8 mRNA 的 3-UTR 区域与 miR-34a-5p 序列存在互补(图 4A)。双荧光素酶实验显示在 293T 细胞中共转染 Fut8 3UTR-wt和 miR-34a-5p mimic 时,荧光强度明显下降。当共转染 Fut8 3UTR-mut 和 miR-34a-5p mimic 时,荧光强度未见明显改变(图 4B)。在泡沫细胞中添加miR-34a-5p inhibitor 时,Fut8 的 mRNA(图 4C)和蛋白(图 4D)含量较对照组均显著升高。在泡沫细胞中添加 miR-34a-5p mimic 时,Fut8 的 mRNA(图 4E)和蛋白(图 4F)含量较对照组均显著降低。A:生物信息学预测 Fut8 mRNA 的 3-UTR 区域与 miR-34a-5p 序列的互补;B:双荧光素酶实验显示 Fut8 mRNA的 3-UTR 突变对 miR-34a-5p 与 Fut8 结合的影响(n=3);C:miR-34a-5p inhibitor 对 Fut8 mRNA 含量的影响(n=3);D:miR-34a-5p inhibitor 对 Fut8 蛋白含量的影响(n=3);E:miR-34a-5p mimic 对 Fut8 mRNA 含量的影响(n=3);F:miR-34a-5p mimic 对 Fut8 蛋白含量的影响(n=3)。P0.05图 4 miR-34a-5p 与 Fut8 之间的相互作用2.5 miR-34a-5p 靶向 Fut8 影响泡沫细胞运动能力为了探讨 Fut8 表达改变在 miR-34a-5p 调节泡沫细胞运动能力中的重要作用,构建了 Fut8 过表达质粒。预处理泡沫细胞后发现,因添加 miR-34a-5pmimic 而下降的运动能力得到明显恢复(图 5)。1:NC mimics 组;2:NC mimics+Vector 组;3:Vector+miR-34a-5p mimics 组;4:miR-34a-5p mimics+Fut8 组(400)。P0.05图 5 Fut8 在 miR-34a-5p 下调泡沫细胞运动能力中的作用(n=3)514医学分子生物学杂志,2023,20(5):411-416 J Med Mol Biol,2023,20(5):411-4163 讨论炎症、机械刺激等条件下,穿透到内膜下的巨噬细胞通过细胞表面的 CD36、SRA 等清道夫受体摄取 ox-LDL,转变为泡沫细胞并分泌炎性因子吸引更多的单核细胞进入到内膜下23;本课题组研究已经证实 Fut8 表达下降是泡沫细胞运动能力下降的重要因素之一,然而对 Fut8 本身的调节机制尚不清楚。本研究显示首先通过生物信息学预测筛选出 miR-34a-5p 和 miR-449b-5p,并进一步利用分子生物学方法进行验证。相关性分析显示 miR-34a-5p 与 Fut8 存在较为明显的负相关,因此本实验后续重点探讨了 miR-34a-5p 在泡沫细胞运动能力改变中的作用。由于 miRNA 和下游蛋白之间互作的复杂性,即单个 miRNA 可能会影响下游多个基因24,或多个 miRNA 可能会同时调节同一个基因25,也不能排除 miR-449b-5p 对 Fut8 无影响,因此后续实验仍需结合 miRNA 芯片技术进一步明确与 Fut8 相作用的其他 miRNA。miR-34a-5p 已被证实与多种心脑血管疾病的发生密切相关。以往研究显示 miR-34a-5p 在人类心力衰竭和心血管疾病进展有关的动物模型中被诱导,靶向 miR-34a-5p 在心脏修复中发挥治疗作用26-28。Shan 等29研究通过 microRNA 微阵列分析 AS 小鼠主动脉发现 miR-34a-5p 和 miR-497-5p在 AS 进展时逐渐上调,而 miR-434-3p 逐渐下调。Wang 等30人发现 miR-34a-5p 在冠状动脉疾病(coronary artery disease,CAD)病人动脉组织中的表达水平低于正常对照组患者的动脉组织,低表达的 miR-34a-5p 通过促进 SIRT1 表达从而促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移。但是查阅文献后结合原文图 4A 发现 miR-34a-5p 在 CAD 病人中实际是高于对照组。因此结合我们的实验结果发现 miR-34a-5p 在泡沫细胞中的上调,我们认为 miR-34a-5p 可能在多个参与 AS 的细胞如巨噬细胞、泡沫细胞和血管平滑肌细胞均发挥重要作用,其在不同细胞中的作用仍需进一步探讨。细胞内的 N-聚糖 1,6-岩藻糖基化由 Fut8 单独催化,导致岩藻糖从 GDP-L-岩藻糖转移到天冬酰胺连接的 N-乙酰氨基葡萄糖上31。以往对其研究多集中在肿瘤领域,多项研究证实 miRNA-198是其上游调节分子,能够通过 Fut8 抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭32和抑制结直肠癌的肿瘤生长和转移33。Bernardi 等34发现在肝癌细胞中miR-122 和 miR-34a 的异位表达能够显著降低 Fut8水平,并影响分泌蛋白的核心岩藻糖基化。通过生物信息学预测和实验验证,我们发现泡沫细胞中高表达的 miR-34a-5p 通过抑制 Fut8 的表达而发挥其抑制泡沫细胞迁移的功能。我们的实验首次在 AS性疾病中探讨了 miR-34a-5p 对 Fut8 的调节作用。总之,本实验证实了 miRNA-34a-5p 为 Fut8 的上游 miRNA 之一,通过下调 Fut8 表达而抑制泡沫细胞运动能力。参考文献1 ROTH G A,JOHNSON C,ABAJOBIR A,et al.Global,re-gional,and national burden of cardiovascular diseases for10 causes,1990 to 2015J.J Am Coll Cardiol,2017,70(1):1-25.2 SONG P,ZHA M,YANG X,et al.Socioeconomic and geo-graphic variations in the prevalence,awareness,treatmentand control of dyslipidemia in middle-aged and older Chi-neseJ.Atherosclerosis,2019,282:57-66.3 MOZAFFARIAN D,BENJAMIN E J,GO A S,et al.Heartdisease and stroke statistics-2016 update:a report fromthe american heart associationJ.Circulation,2016,133(4):e38-e360.4 RICCIONI 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